張勝葉，戶富棟，郭勝存，李云鵬，程 棟，湯 毅，桑海強

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科 鄭州 450052

血管內(nèi)皮細(xì)胞處于循環(huán)流動的體液環(huán)境中，血流剪切力對維持內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)和功能起重要作用[1-2]。傳統(tǒng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)方法是在靜止培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，無法分析流體剪切力的作用，實驗結(jié)果的解析與應(yīng)用轉(zhuǎn)化受到影響。后來發(fā)展起來的微流控芯片和流體泵，提供不同的流體剪切力，使細(xì)胞能夠在流動狀態(tài)下的3D環(huán)境中培養(yǎng)，促進(jìn)了醫(yī)學(xué)研究的發(fā)展。然而目前微流控通道橫截面多數(shù)是矩形，主要應(yīng)用注射泵和蠕動泵提供流體剪切力，不符合體內(nèi)血管形狀和生理流體剪切力的特點[3-4]。在應(yīng)用脈沖泵(模擬心臟的脈沖式搏動)的研究[5-6]中，微通道內(nèi)表面仍多數(shù)是矩形橫截面。本實驗利用自制的圓形橫截面微通道，用脈沖泵提供不同流體剪切力，模擬體內(nèi)血管形狀(小動脈)和脈沖式搏動，研究血管內(nèi)皮細(xì)胞在類生理循環(huán)流動下的生理特征，尤其是抗凝與抗氧化特性。

1 材料與方法

1.1 材料彈性硅膠(美國Dow Corning公司)，固化劑、膠原蛋白-I、DMEM培養(yǎng)基、青霉素、鏈霉素(美國Thermo Fisher Scientifc公司)，戊二醛(瑞士Sigma Aldrich公司)，體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清(德國Biochrom公司)，內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(美國PromoCell公司)，血小板-內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子CD31(美國R&D公司)，血管內(nèi)皮細(xì)胞鈣黏連蛋白(VE-cadherin，美國Santa Cruz公司)，血管性血友病因子(vWF，丹麥Dako公司)，硫酸乙酰肝素(HS，西班牙Amsbio公司)，成纖維細(xì)胞特異性蛋白-1(FSP-1，英國Abcam公司)，超氧化物歧化酶1(SOD1，美國Pierce公司)，羅丹明鬼筆環(huán)肽[標(biāo)記F-肌動蛋白(F-actin)，美國Cytoskeleton公司]，反轉(zhuǎn)錄試劑盒、RNA提取試劑盒(日本TAKaRa公司)，引物、RT試劑盒、熒光定量PCR試劑盒(美國Applied Biosystems公司)，脈沖泵Miniplus 3(法國Gilson公司)。

1.2 原代血管內(nèi)皮細(xì)胞的分離與鑒定采用機械方法分離豬主動脈內(nèi)皮細(xì)胞(瑞士伯爾尼大學(xué)醫(yī)學(xué)臨床研究中心贈予)，具體如下：用D-Hank′s液沖洗主動脈，無菌條件下沿縱軸剪開，使血管內(nèi)皮朝上向外暴露，用棉簽沿一定方向輕輕擦拭血管內(nèi)表面(忌返回擦拭)。用DMEM培養(yǎng)液將棉簽擦拭的細(xì)胞收集到離心管，以1 000 r/min離心5 min，去除上清液。將一部分細(xì)胞轉(zhuǎn)移到纖連蛋白包被的T25培養(yǎng)瓶，一部分轉(zhuǎn)移到6孔培養(yǎng)板，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每12 h換培養(yǎng)液。培養(yǎng)液為DMEM液+體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清+0.1 IU/L青霉素+0.1 μg/L鏈霉素+4 mg/L內(nèi)皮細(xì)胞生長因子。采用免疫熒光染色檢測內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物CD31、VE-cadherin、vWF表達(dá)，以FSP-1來排除成纖維細(xì)胞污染。取第3～5代細(xì)胞用于本實驗。

1.3 圓形橫截面微通道的制備與內(nèi)表面修飾將彈性硅膠與固化劑按照質(zhì)量比10∶1配制聚二甲基硅氧烷(PDMS)。以內(nèi)徑550 μm無菌針頭為模具，內(nèi)徑120 μm無菌針頭作為底部支持，將兩者垂直交叉放置于PDMS內(nèi)，經(jīng)過60 ℃烤箱加熱固化過夜，裁出PDMS芯片，均勻用力拔出針頭，打孔制作微通道出入口，清洗干凈后在氧氣等離子體機將芯片-載玻片黏合一起。然后進(jìn)行微通內(nèi)表面化學(xué)修飾，紫外線消毒。

1.4 微流控芯片體系的構(gòu)建在細(xì)胞生長達(dá)85%～90%融合時，胰蛋白酶消化、離心、計數(shù)，按照2×106個/mL細(xì)胞密度接種于微通道內(nèi)，緩慢旋轉(zhuǎn)45 min后靜置培養(yǎng)，于12 h更換培養(yǎng)液。在細(xì)胞培養(yǎng)24 h時，連接脈沖泵系統(tǒng)。首先在5 r/min轉(zhuǎn)速下，以蒸餾水、PBS、40 g/L葡聚糖DMEM培養(yǎng)液分別沖洗高壓消毒滅菌后的硅膠管。然后將兩端帶有固定端的硅膠管固定于脈沖泵通道內(nèi)，通過連接器連接另外的硅膠管作為延長管，一端連接于15 mL離心管作為灌流液池，另一端插入微通道入口，在微通道出口連接另一根硅膠管，通入灌流液池。

1.5 血管內(nèi)皮細(xì)胞在微流控芯片體系的培養(yǎng)從0.5 r/min開始，第1 h增加0.5 r/min，以后每1 h增加1 r/min，直至目標(biāo)流體剪切力達(dá)1、5、10、15 dyn/cm2，每24 h更換灌流液，維持循環(huán)培養(yǎng)2～3 d。

1.6 血管內(nèi)皮細(xì)胞生長順應(yīng)性的評估根據(jù)內(nèi)皮細(xì)胞在微通道內(nèi)的生長形狀和特性，利用Image J軟件計算內(nèi)皮細(xì)胞長軸與灌流液方向之間的夾角，評估內(nèi)皮細(xì)胞在一定流體剪切力下的生長順應(yīng)性，每組重復(fù)3次。

1.7 免疫熒光染色檢測血管內(nèi)皮細(xì)胞生理特性指標(biāo)取出微流控芯片，常規(guī)免疫熒光染色，在熒光顯微鏡和共聚焦顯微鏡下觀察內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物CD31、VE-cadherin、vWF，以及細(xì)胞骨架蛋白F-actin、HS、SOD1表達(dá)，應(yīng)用Image J軟件分析CD31、F-actin在微通道正交視圖和體積視圖上的立體分布特點。實驗重復(fù)3次。

1.8 血管內(nèi)皮細(xì)胞SOD1 mRNA表達(dá)水平的qRT-PCR檢測將微通道內(nèi)細(xì)胞按照Trizol說明書進(jìn)行裂解，提取細(xì)胞總RNA，分光光度計法測定并計算提取的總RNA含量與濃度。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，SOD1及內(nèi)參β-actin引物序列見表1，退火溫度均為60 ℃。按定量PCR試劑盒說明進(jìn)行操作，取20 μL反應(yīng)體系進(jìn)行PCR，取2 μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物與SOD1及內(nèi)參β-actin引物進(jìn)行PCR，反應(yīng)條件:預(yù)變性95 ℃10 min；95 ℃15 s、60 ℃ 20 s、72 ℃ 32 s，40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計算SDO1 mRNA的相對表達(dá)量。實驗重復(fù)3次。

表1 引物序列和產(chǎn)物長度

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理采用Graphpad Prism 7進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。在流體剪切力分別為0、1、5、10、15 dyn/cm2時，內(nèi)皮細(xì)胞長軸與灌流液方向之間夾角的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Bonferroni法；在類生理流體剪切力(15 dyn/cm2)和靜止?fàn)顟B(tài)下培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞時，HS熒光強度、SOD1熒光強度、SOD1 mRNA相對表達(dá)量的比較采用兩獨立樣本t檢驗。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 原代血管內(nèi)皮細(xì)胞的鑒定免疫熒光染色結(jié)果提示CD31、VE-cadherin、vWF均正常表達(dá)在內(nèi)皮細(xì)胞，其中CD31和VE-cadherin主要表達(dá)在內(nèi)皮細(xì)胞間的緊密連接處，vWF主要表達(dá)在W-P小體內(nèi)。同時FSP-1染色陰性，排除了成纖維細(xì)胞的污染(圖1)。

A:CD31;B:VE-cadherin;C:vWF;D:FSP-1

2.2 流體剪切力對血管內(nèi)皮細(xì)胞順應(yīng)性的影響在靜止?fàn)顟B(tài)下，內(nèi)皮細(xì)胞呈梭形、多角形、類橢圓形等不規(guī)則形狀，排列雜亂無序；在流體剪切力逐漸增大的情況下，內(nèi)皮細(xì)胞長軸逐漸出現(xiàn)與灌流液流動方向一致的趨勢，由原來無序的不規(guī)則形狀逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)殚L梭形，排列整齊(圖2)，內(nèi)皮細(xì)胞長軸與灌流液流動方向之間的夾角逐漸變小(表2)。在15 dyn/cm2時夾角最小，確定此為模擬體內(nèi)生理狀態(tài)的最佳流體剪切力。

A、B、C、D、E：流體剪切力分別為0、1、5、10、15 dyn/cm2

表2 各組內(nèi)皮細(xì)胞長軸與灌流液流動方向之間的夾角比較

2.3 血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物在類生理循環(huán)流動下的表達(dá)特點結(jié)果見圖3。在靜止?fàn)顟B(tài)下，內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物CD31、VE-cadherin、vWF表達(dá)無方向性。而在類生理循環(huán)流動下，內(nèi)皮細(xì)胞均勻覆蓋于微通道內(nèi)表面，形成一層單細(xì)胞層，CD31、VE-cadherin、vWF表達(dá)具有方向性，均與微通道內(nèi)灌流液流動方向一致；其中CD31在正交視圖XY、XZ、YZ方向均勻分布并表達(dá)在內(nèi)皮細(xì)胞緊密接處，在體積視圖上可見CD31在部分圓形橫截面微通道內(nèi)的立體展示。

A:CD31；B:VE-cadherin;C:vWF;1:靜止?fàn)顟B(tài)；2:類生理循環(huán)流動狀態(tài);3:XY方向；4:XZ方向；5:YZ方向;6:體積視圖

2.4 F-actin在類生理循環(huán)流動下的表達(dá)特點在靜止?fàn)顟B(tài)下，F(xiàn)-actin大量表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞絲狀纖維骨架上，沒有方向性；而在類生理循環(huán)流動下，F(xiàn)-actin與微通道內(nèi)灌流液流動方向一致；在正交視圖XY、XZ、YZ方向均勻分布并表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞纖維骨架上，在體積視圖上可見F-actin在部分圓形橫截面微通道內(nèi)的立體展示(圖4)。

2.5 HS在類生理循環(huán)流動下的表達(dá)特點在靜止?fàn)顟B(tài)下，HS在內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)微弱，熒光染色弱；而在類生理循環(huán)流動下，HS表達(dá)增多，熒光染色強于靜止?fàn)顟B(tài)，且其表達(dá)具有方向性，與微通道內(nèi)灌流液流動方向一致(圖5和表3)。

A:靜止?fàn)顟B(tài)；B:類生理循環(huán)流動狀態(tài)；C:XY方向;D:XZ方向;E:YZ方向;F:體積視圖

A:靜止?fàn)顟B(tài)；B：類生理循環(huán)流動狀態(tài)

表3 靜止和類生理循環(huán)流動狀態(tài)下HS熒光強度的比較

2.6 類生理循環(huán)流動下SOD1的表達(dá)特點及水平在靜止?fàn)顟B(tài)下，SOD1在內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)微弱，熒光染色淡；而在類生理循環(huán)流動下，SOD1表達(dá)增多，熒光染色強于靜止?fàn)顟B(tài)，且其表達(dá)具有方向性，與微通道內(nèi)灌流液流動方向一致(圖6和表4)。在類生理循環(huán)流動下，SOD1 mRNA表達(dá)水平高于靜止?fàn)顟B(tài)(表4)。

A:靜止?fàn)顟B(tài)；B:類生理循環(huán)流動狀態(tài)

表4 靜止和類生理循環(huán)流動狀態(tài)下SOD1熒光強度及mRNA表達(dá)水平的比較

3 討論

三維立體細(xì)胞培養(yǎng)較傳統(tǒng)平面培養(yǎng)具有巨大的優(yōu)越性，可以建立起生理上細(xì)胞-細(xì)胞或細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)相互作用，影響細(xì)胞的增殖、凋亡與分化，模擬在體組織的天然特性。前期多數(shù)微通道研究[7-8]發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞生長形狀和排列具有剪切力依賴性，但多是在非生理血管形狀的矩形橫截面微流控芯片得出此結(jié)論。本研究利用脈沖泵提供流體剪切力，在圓形橫截面微通道內(nèi)培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞具有生長順應(yīng)性的改變，由不規(guī)則形狀逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)殚L梭形，生長方向與灌流液流動方向一致。在流體剪切力為15 dyn/cm2時，內(nèi)皮細(xì)胞長軸與灌流液流動方向之間的夾角最小，內(nèi)皮細(xì)胞順應(yīng)性達(dá)到最佳，依此確定為類生理流體剪切力。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物在微通道內(nèi)表面正常表達(dá)，抗凝和抗氧化指標(biāo)高表達(dá)，且與灌流液流動方向一致，表明本實驗成功地模擬體內(nèi)小血管系統(tǒng)，內(nèi)皮細(xì)胞維持其天然的抗凝、抗氧化生理特性。

天然血管內(nèi)壁具有良好的抗凝特性，主要是由于內(nèi)皮細(xì)胞有一層毛絨狀的多糖-蛋白復(fù)合結(jié)構(gòu)即糖萼層覆蓋，由糖胺聚糖、蛋白聚糖和糖蛋白構(gòu)成。糖胺聚糖是糖萼中含量最多的成分，主要包括HS、透明質(zhì)酸等。許多抗凝調(diào)節(jié)蛋白(C蛋白、S蛋白、組織因子途徑抑制劑、抗凝血酶Ⅲ、組織型纖溶酶原激活物、血栓調(diào)節(jié)素等)、抗氧化應(yīng)激蛋白(SOD、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶等)、細(xì)胞因子、生長因子等均結(jié)合在HS側(cè)鏈。生理流體剪切力在維持糖萼結(jié)構(gòu)和功能等方面起至關(guān)重要的作用，而非脈沖式流體可能導(dǎo)致內(nèi)皮糖萼層降解[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，糖萼層HS在類生理循環(huán)流動下高表達(dá)，且與灌流液流動方向一致。早期微流控芯片研究[10]報道HS可以作為機械傳感器，感知流體剪切應(yīng)力變化，調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞大量基因表達(dá)，進(jìn)一步影響新生血管形成。這表明本實驗體系成功模擬體內(nèi)生理流動狀態(tài)下的內(nèi)皮細(xì)胞，其表面保持大量表達(dá)的HS。

天然血管內(nèi)壁還具有抗氧化功能。SOD是清除氧自由基的代謝酶，主要位于細(xì)胞質(zhì)、線粒體、糖萼層等，能夠抑制超氧陰離子自由基對血管內(nèi)皮細(xì)胞的損害、促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞一氧化氮依賴的血管舒張反應(yīng)、抑制白細(xì)胞在血管內(nèi)皮的黏附、減輕血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬與凋亡等，進(jìn)而抑制動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展[11-12]。本實驗分別在蛋白和mRNA水平上分析SOD1的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)其在類生理循環(huán)流動下的水平均明顯高于靜止?fàn)顟B(tài)，這與前期研究[13]結(jié)果一致。

綜上，本研究在類生理循環(huán)流動下培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞基本保持其體內(nèi)內(nèi)皮細(xì)胞的生長特點，并維持其天然的抗凝和抗氧化生理特征，為進(jìn)一步研究血管內(nèi)皮細(xì)胞的其他生理特性，及內(nèi)皮損傷、動脈粥樣硬化、慢血流、血栓栓塞等病理機制提供良好的體外疾病模型。然而本研究的局限性在于微通道內(nèi)僅有內(nèi)皮細(xì)胞，無血管平滑肌細(xì)胞，灌注液為細(xì)胞培養(yǎng)液，未使用生理的血清、血漿、全血，缺乏體內(nèi)血管所處的內(nèi)分泌、物質(zhì)交換等微環(huán)境，這些都是將來要進(jìn)一步提高和完善之處。