柴亞茹，高孜博，丁麗華，吳擁軍

鄭州大學公共衛(wèi)生學院衛(wèi)生化學教研室 鄭州 450001

外泌體是由活細胞釋放的具有脂質雙層膜的囊泡，直徑30～150 nm，能夠在體液中進行細胞間通信[1-3]。外泌體作為腫瘤生物標志物具有許多優(yōu)勢，如豐度高(每毫升血液中多達1010個囊泡)、穩(wěn)定性強、可反映原始細胞實時狀態(tài)、豐富內含物和可實現(xiàn)縱向取樣[4-5]。當前外泌體的常用定量檢測技術主要有納米顆粒跟蹤分析(nanoparticle tracking analysis，NTA)[6]、可調電阻脈沖傳感技術[7]、電化學[8]、熒光[9]、表面增強拉曼散射[10]、表面等離子體共振[11]等技術。然而上述方法存在操作步驟繁瑣、特異性低、無法排除脂蛋白顆?；虻鞍踪|聚集物的干擾、重現(xiàn)性較差等局限性，嚴重限制了在快速、實時檢測中的推廣應用[8,12-13]。當前外泌體計數(shù)的挑戰(zhàn)主要是如何選擇性和精確地分析納米級外泌體，而不需要繁瑣的過程，因此，建立一種方便、快速、靈敏、準確、重現(xiàn)性好的檢測方法具有重要意義。核酸適配體具有高特異性、高親和力、穩(wěn)定性好等優(yōu)勢，引入信號標記抗體或適配體來量化外泌體可以提高特異性[14-15]，且熒光定量法具有操作方便快捷、花費低、靈敏度高等優(yōu)點[16]。但常規(guī)的熒光分析法容易受外界因素的影響，特別是樣品背景影響較大。為此，本研究利用熒光探針Cy5及SYBR Green Ⅰ(SGⅠ)核酸染料建立了一種比率熒光檢測方法，通過制備適配體-鏈霉親和素磁珠作為捕獲分離單元，并將該方法用于血漿樣品外泌體水平的檢測，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器人肺腺癌細胞株A549(中國科學院細胞庫)，鏈霉親和素磁珠(streptavidin magnetic nanoparticles，MNPs；無錫百邁格生物科技有限公司)，DMEM高糖培養(yǎng)基、乙二胺四乙酸(EDTA)、2.5 g/L胰蛋白酶消化液(含EDTA)、袋裝PBS粉、Tween-20、SGⅠ、TE緩沖液、BCA試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)，共沉淀試劑Total Exosome Isolation(美國賽默飛世爾科技有限公司)，HT-7700透射電子顯微鏡(日本Hitachi公司)，NanoFCM N30E單顆粒納米生物粒徑分析儀(四川極奇科技有限公司)，Nano Drop 2000超微量紫外分光光度計(Thermo Scientific公司)，Nanosight NS300納米顆粒跟蹤分析儀(英國馬爾文帕納科有限公司)，F(xiàn)S5熒光光譜儀(英國愛丁堡儀器公司)。CD63核酸適配體(Cy5-Apt)核酸序列：Cy5-TAGCATTAGT GTCTTTTTTCACCCCACCTCGCTCCCGTGACACTAAT GCTATTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-Biotin(核酸序列均購自上海生工生物工程股份有限公司)。

1.2 外泌體的提取與表征A549細胞在體積分數(shù)5%的CO2、37 ℃培養(yǎng)條件下達到約60%覆蓋率時，沖洗細胞后加入無胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，48 h后收集上清液，4 ℃保存。將細胞上清液行逐步差速離心(300×g，10 min；2 000×g，10 min；10 000×g，30 min)，均收集上清液。將上清液通過0.22 μm的過濾器后加入超濾管濾膜夾層中，4 000×g離心15 min，收集上層濃縮液。加入共沉淀試劑，吹打混勻，4 ℃放置12 h。10 000×g離心60 min，加入PBS重懸，-80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｍㄟ^透射電子顯微鏡觀察外泌體形態(tài)和大小，利用NTA檢測粒徑分布和濃度，Western blot法測定標志蛋白CD63、TSG101和HSP70蛋白表達。

1.3 比率熒光免疫磁珠的構建首先取20 μL 2 g/L的MNPs于200 μL低吸附離心管中，磁分離，棄上清液。再用PBST緩沖液洗滌MNPs 3次，磁分離，棄上清液后加入50 μL 400 nmol/L Cy5熒光探針標記的生物素化CD63核酸適配體工作液，混勻，振蕩30 min，磁分離，棄上清液。取50 μL雜交緩沖液清洗磁珠2次，磁分離，得到CD63核酸適配體修飾的磁顆粒(MNPs-Apt)。向清洗后的MNPs-Apt中加入50 μL 20×的SGⅠ工作液，吹打混勻，振蕩15 min，磁分離。PBST緩沖液混懸清洗磁珠，磁分離，棄上清液，得到比率熒光免疫磁珠(MNPs-Apt-SGⅠ)。

1.4 可行性分析通過激光共聚焦顯微鏡觀察Cy5-Apt是否可以與外泌體特異性結合。測定Cy5熒光探針在不同濃度外泌體中的熒光強度，探究Cy5熒光基團作為固定基團，其熒光強度是否在不同濃度的外泌體環(huán)境中具有穩(wěn)定性。檢測SGⅠ熒光染料在不同濃度外泌體中的熒光變化(SGⅠ熒光基團是嵌入在適配體的雙鏈結構中的，而適配體可捕獲外泌體，因此其熒光強度應隨外泌體濃度的增大而減小)。最后考察MNPs對SGⅠ熒光探針的吸附性(隨著SGⅠ熒光染料濃度的增大，若體系的熒光強度基本不變，則可以判定MNPs對SGⅠ熒光染料的吸附性可以忽略不計)。

1.5 外泌體比率熒光探針定量檢測方法在MNPs-Apt-SGⅠ中加入50 μL外泌體稀釋液，振蕩，室溫孵育60 min，磁分離后去上清液，PBST緩沖液清洗2次，去上清液后加入60 μL的雜交緩沖液，重懸磁珠沉淀。使用FS5熒光光譜儀分別掃描兩種基團熒光強度(SGⅠ染料激發(fā)波長為496 nm，Cy5熒光基團激發(fā)波長為648 nm)。按照公式(1)計算各血漿樣本的熒光比值信號[Δ(FC/FS)]，每個樣品均檢測3個復孔。

(1)

其中，F(xiàn)C表示被檢測點的Cy5熒光強度，F(xiàn)S表示被檢測點的SGⅠ熒光強度，F(xiàn)C0表示空白對照的Cy5熒光強度，F(xiàn)S0表示空白對照的SGⅠ熒光強度。

1.7 特異性及實際樣品檢測選擇實際樣品中常與外泌體共存的白蛋白、脂質體、微囊泡細胞碎片作為檢測目標。將其用PBS按照蛋白濃度定量(均配制成0.013 g/L的溶液，即對應外泌體顆粒濃度為4.0×106個/μL)，用建立的方法檢測熒光比值(FC/FS)并比較，評價所建立的方法的特異性。選擇實際血漿為樣品[收集2018年12月至2019年12月某醫(yī)院呼吸內科住院的肺癌患者(16例)和健康體檢中心健康對照者(10人)全血樣本，4 000 r/min 4 ℃離心后收集血漿，置于凍存管中于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆胅進行檢測。該研究獲鄭州大學生命科學倫理審查委員會的批準，研究對象均已簽署知情同意書。肺癌患者符合以下入選標準：①以《中華醫(yī)學會肺癌臨床診療指南(2019版)》為標準，經病理學或細胞學被證實為原發(fā)性肺癌。②入組前未接受放化療、藥物治療或手術治療。③無主要臟器功能衰竭。④未合并其他惡性腫瘤。⑤未處于妊娠或哺乳期。所有健康對照者符合以下入選標準：①無肝炎、梅毒、艾滋病等傳染病病史和惡性腫瘤史。②無糖尿病、高血壓、心腦血管疾病及免疫系統(tǒng)疾病史。③與試驗組年齡和性別相匹配。④無主要臟器功能衰竭。⑤未合并其他肺部或呼吸系統(tǒng)疾病。⑥未處于妊娠或哺乳期。

1.8 統(tǒng)計學處理采用SPSS 21.0處理數(shù)據(jù)，血漿外泌體濃度不符合正態(tài)分布，故采用中位數(shù)和四分位數(shù)進行描述，使用Mann-WhitneyU非參數(shù)檢驗進行兩組間差異分析，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 比率熒光探針定量檢測外泌體的原理外泌體比率熒光探針定量方法的檢測原理如圖1所示。選擇發(fā)夾型CD63核酸適配體作為外泌體捕獲適配體，同時在5’端修飾Cy5熒光探針，在3’端修飾生物素。利用生物素和鏈霉親和素之間的特異性結合將Cy5-Apt固定到MNPs上，構建MNPs-Apt。將雙鏈特異性熒光探針SGⅠ特異性嵌入發(fā)夾型CD63核酸適配體的莖部，從而構建MNPs-Apt-SGⅠ。當外泌體存在時，發(fā)夾型CD63核酸適配體特異性識別并結合外泌體表面蛋白CD63，導致發(fā)夾型結構改變，SGⅠ探針脫離MNPs-Apt-SGⅠ，引起磁珠上SGⅠ熒光強度大幅減弱，而Cy5熒光恒定，將兩種熒光探針的熒光強度比值與外泌體濃度之間建立標準曲線，可以實現(xiàn)對外泌體的定量檢測。

2.2 外泌體的表征及MNPs-Apt-SGⅠ的構建結果見圖2。在透射電子顯微鏡下觀察到外泌體均呈杯盤狀小囊泡，大部分直徑為30～150 nm；超濾聯(lián)合共沉淀法提取的外泌體濃度約為2.41×1010個/mL；外泌體膜上的CD63和TSG101蛋白在相對分子質量約30 000和48 000處、HSP70蛋白在相對分子質量約70 000處有表達，可確認提取到的小囊泡為外泌體。在496 nm波長的激發(fā)光下，MNPs-Apt-SGⅠ在601 nm處有明顯的熒光峰值出現(xiàn)，說明SGⅠ熒光探針成功修飾在免疫磁珠表面，MNPs-Apt-SGⅠ構建成功。

圖1 外泌體比率熒光探針定量檢測方法的檢測原理

A：超濾共沉淀法提取的外泌體透射電子顯微鏡圖(紅色箭頭標注為外泌體)；B：超濾共沉淀法提取的外泌體NTA分析；C：外泌體CD63、TSG101和HSP70的表達；D：比率熒光磁珠的SGⅠ熒光光譜

2.3 MNPs-Apt-SGⅠ檢測外泌體的可行性分析如圖3A所示，在激光共聚焦顯微鏡下，溶液中僅有發(fā)夾探針Cy5-Apt時，從暗場中觀察不到紅色熒光，而當Cy5-Apt與外泌體孵育后，從圖中可以觀察到熒光信號很強的點，提示Cy5-Apt可以與外泌體特異性結合。如圖3B所示，Cy5熒光探針的熒光強度在不同濃度的外泌體環(huán)境中變化不大；如圖3C所示，SGⅠ熒光基團的熒光強度隨外泌體濃度的增大而減小；如圖3D所示，隨著SGⅠ熒光染料濃度的增大，體系的熒光強度基本不變，因此可以判定MNPs對SGⅠ熒光染料無明顯吸附。

A：激光共聚焦顯微鏡鑒定Cy5-Apt對外泌體的結合；B：Cy5熒光探針在不同濃度外泌體中的熒光穩(wěn)定性；C：SGⅠ熒光染料在不同濃度外泌體中熒光變化；D：MNPs對SGⅠ熒光染料無明顯吸附性

2.4 檢測條件的優(yōu)化及方法學評價檢測條件優(yōu)化見圖4A～E。圖4F顯示，外泌體濃度在8.0×104～ 1.0×107個/μL范圍內，Δ(FC/FS)與外泌體濃度呈良好的線性關系，標準曲線線性擬合方程為y=3.49×lg(x/104)-0.63;y:Δ(FC/FS),x:外泌體濃度，決定系數(shù)(R2)為0.996。

由表1可知，無外泌體胎牛血清配制的低、中、高3個濃度(分別為1.0×105、1.0×106、8.0×106個/μL)的外泌體加標溶液中平行測定3次，計算得到RSD為0.6%～26.4%，表明在中、高濃度時精密度較好；3個濃度的加標回收率分別為94.5%、95.4%和97.2%，表明準確度較好。

A：MNPs用量的優(yōu)化；B：Cy5-Apt濃度的優(yōu)化；C：SGⅠ探針濃度的優(yōu)化；D：MNPs-Apt-SGⅠ與外泌體反應時間的優(yōu)化；E：MNPs-Apt-SGⅠ與外泌體反應溫度的優(yōu)化；F：外泌體定量檢測的標準曲線

表1 比率熒光探針定量檢測方法的精密度RSD和加標回收率(n=3)

2.5 特異性及血漿樣品檢測見圖5。由圖5A可知，當檢測目標濃度一樣時，外泌體的熒光信號比值明顯最大。結果表明，該方法檢測外泌體的特異性較好。

為驗證該方法的實際應用能力，將其應用于血漿外泌體的檢測，結果顯示肺癌患者組的血漿外泌體濃度總體分布范圍高于健康對照組(P<0.01)(圖5B)。因此，該方法可用于血漿中外泌體的定量，具有較高的實際應用價值。

A：比率熒光定量檢測方法的特異性(n=3)；B：比率熒光定量檢測方法對兩組血漿樣本中外泌體的檢測結果；*：兩組相比，P<0.01

3 討論

迄今為止，多種分析方法，包括NTA、Western blot法和酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)，已廣泛用于外泌體的檢測。NTA能夠實現(xiàn)簡單、快速，不破壞外泌體原始狀態(tài)定量，但定量準確性容易受到脂蛋白或蛋白質聚集體的干擾，無法選擇性地檢測特定的外泌體[12,17]。Western blot法和ELISA法可以通過識別癌癥外泌體和正常外泌體的特異性蛋白質來進行區(qū)分，但由于低靈敏度或定量分析受限制[18-19]，限制了它們在臨床診斷中的應用。該研究構建的比率熒光探針定量檢測方法能夠極大地削減探針濃度、溫度、極性、環(huán)境的pH值、穩(wěn)定性等諸多因素的干擾，可通過兩個波長處熒光強度的比值與目標物濃度之間的關系來定量目標物含量。該方法不需要繁瑣的外泌體分離過程，且檢測所需的樣品消耗較低，簡化了操作步驟，具有良好的靈敏度。特異性的方法學評價結果顯示該方法對環(huán)境中可能與外泌體共存的白蛋白、脂質體、微囊泡反應較差，對外泌體特異性較強，可有效避免其他物質的干擾。此外，該研究構建的比率熒光探針定量檢測方法用于分析血漿中外泌體濃度時，與以往研究結果中腫瘤細胞外泌體分泌水平高于正常細胞的研究結果[20-21]相一致，說明該方法可用于血漿中外泌體的定量，具有一定的臨床應用價值。