王倩，劉師文，龔甜

（江西省疾病預(yù)防控制中心, 江西 南昌330029）

登革病毒經(jīng)伊蚊叮咬傳播，可引起登革熱，嚴(yán)重者還可引起登革出血熱以及登革休克綜合征?；加械歉餆岬牟∪藭饕獣霈F(xiàn)發(fā)熱、皮疹、關(guān)節(jié)痛、顏面潮紅、胸部發(fā)紅出血、全身肌肉酸痛等癥狀，嚴(yán)重者會出現(xiàn)心肌損傷以及腎功能損傷，登革休克綜合征是登革病毒感染最嚴(yán)重的臨床表現(xiàn)，其主要癥狀為全身循環(huán)衰竭[1]，而在發(fā)病的早期這些癥狀表現(xiàn)為輕微并且與其他上呼吸道疾病有類似的臨床癥狀[2-3]，易誤診。 人體對登革病毒普遍易感，首次感染后會產(chǎn)生特異性抗體并可維持多年，當(dāng)再次感染其他型別登革病毒時， 會因為抗體依賴感染增強(qiáng)作用 （Antibody dependent enhancement，ADE） 出現(xiàn)更嚴(yán)重的癥狀并發(fā)展為重癥登革熱。 登革病毒的實驗室快速檢測對于及時診斷、減少重癥病例的發(fā)生和登革熱疫情的防控非常重要，本文闡述了登革病毒的實驗室檢測方法，對近年來登革病毒的檢測技術(shù)進(jìn)行綜述。

一 登革病毒的結(jié)構(gòu)與型別

登革病毒為單股正鏈RNA 病毒， 是黃病毒科、黃病毒屬，基因組全長約11kb[4]?；蚪M由1 個開放閱讀框（Open reading frame，ORF）和非編碼區(qū)（5’UTR，3′UTR） 組成，ORF 可翻譯和加工為三種結(jié)構(gòu)蛋白和七種非結(jié)構(gòu)蛋白， 分別為衣殼蛋白（C蛋白）、膜蛋白（M 蛋白）和包膜蛋白（E 蛋白）以及NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B 和NS5。 E 蛋白主要起中和反應(yīng)， 抗體交叉反應(yīng)也由其引發(fā)；NS1 基因長約1056bp， 編碼的NS1 蛋白是登革病毒非結(jié)構(gòu)蛋白中唯一的糖蛋白， 該糖蛋白在登革病毒4 個分型中均具有較高的穩(wěn)定性， 可在感染細(xì)胞的表面表達(dá)，并且可以分泌到細(xì)胞外[5]。NS3 和NS5 主要對基因組的復(fù)制和蛋白的加工起催化作用；NS2A、NS2B、NS4A 和NS4B 作為轉(zhuǎn)膜蛋白，功能是將NS3 和NS5 轉(zhuǎn)運(yùn)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)囊泡上[6]。5′端的I 型帽子結(jié)構(gòu)可以保護(hù)其免受酶降解，同時促進(jìn)翻譯；3′ 端無poly(A)尾結(jié)構(gòu)，高度保守，可能與病毒復(fù)制相關(guān)[7-8]。 登革病毒與其他黃病毒(包括黃熱病病毒、西尼羅河病毒、日本腦炎病毒和蜱傳腦炎病毒等) 之間約有40%的氨基酸相似性[9]，這也是導(dǎo)致登革病毒與其他黃病毒檢測中存在交叉反應(yīng)的原因之一。 DENV 根據(jù)病毒包膜蛋白E 的抗原性不同，分為4 個血清型（DENV1-4)，而同一血清型病毒之間往往還存在若干不同亞型，研究表明，同一血清型的不同亞型之間存在約3%的氨基酸水平差異和6%的核苷酸水平差異[10]，以DENV-1 為例，5 個亞型之間核苷酸相似性約為92%，5′UTR核苷酸序列完全相同，3′UTR 二級結(jié)構(gòu)各不相同，可能影響病毒的致病性； 氨基酸序列相似性約為98%，5 個亞型蛋白中，NS2A 蛋白中的變化概率最高，可能影響病毒的復(fù)制能力[11]。

二 登革病毒的實驗室檢測

1 病毒分離

病毒分離培養(yǎng)是檢測登革病毒感染的金標(biāo)準(zhǔn)[12]。目前用于培養(yǎng)登革病毒最主要的細(xì)胞為白紋伊蚊C6/36 細(xì)胞，其敏感性較高，典型病變特征為細(xì)胞呈空泡狀[13]。 Richard G.Jarman 團(tuán)隊研究發(fā)現(xiàn)， 通過伊蚊胸內(nèi)接種C6/36 細(xì)胞的陽性率為79.4%（1226/1544），高于直接接種于C6/36 細(xì)胞的陽性率的陽性率62.5%（966/1544）[14]。

標(biāo)本采集的時間是登革病毒分離成功與否的重要因素。在感染的急性期（發(fā)病4 d 內(nèi)）采集的樣本分離率可達(dá)85%，而從發(fā)病第5 d 開始陽性率則減少為65%， 這是由于感染后5 d 左右開始產(chǎn)生抗體[14-15]。 使用原代單核細(xì)胞來源的巨噬細(xì)胞(MDMs)培養(yǎng)，也許可以改善抗體對某些黃病毒分離率的降低， 有學(xué)者在患者標(biāo)本病毒分離前使用MDMs 預(yù)培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)可以提高寨卡病毒從人血漿中分離率[16]，而登革病毒與寨卡病毒不僅有相似的傳播媒介，也有著極為相似的結(jié)構(gòu)，對于重點疫區(qū)未在發(fā)病急性期采樣的登革熱患者病毒分離率的提高可能有一定的提示。

雖然登革病毒可以通過其他的檢測方法在患者的血液、尿液、唾液中檢出，但目前在尿液和唾液中暫無成功分離出登革病毒的試驗， 因此血清仍然是病毒分離的首選標(biāo)本類型。 當(dāng)使用血清接種細(xì)胞時，預(yù)稀釋能夠提高分離率[17-18]，可能由于血清稀釋降低了血清對細(xì)胞的毒性作用的干擾。除了血清以外，全血、血漿和外周血淋巴細(xì)胞也成為了許多學(xué)者病毒分離的研究對象。 Klungthong Chonticha 等[19]使用病人全血和血清接種C6/36 細(xì)胞對比發(fā)現(xiàn)， 全血的病毒分離陽性率78.2%（18/23）高于血清分離陽性率43.4%（10/23）。H L Wang等[20]使用血清和血漿接種偽盾伊蚊AP-61 細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，血漿的病毒分離陽性率為33.3%(14/42)，高于血清分離陽性率19.4%(14/72)，Robert McNair Scot團(tuán)隊[21]將332 例登革熱病毒感染病例接種恒河猴腎細(xì)胞（LLC-MK2)，外周血淋巴細(xì)胞（PBLs）中陽性率為22.9%，高于血漿陽性率6.9%。 另外，Nai-Ming Cheng[22]在登革熱患者呼吸道成功分離到4株登革病毒， 這提示呼吸道樣本或許也可以用于登革病毒分離。

2 血清學(xué)檢測

酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）和膠體金（ICT）法是目前登革病毒抗體和抗原最常用的血清學(xué)檢測方法，而其他血清學(xué)檢測方法如血凝抑制試驗、補(bǔ)體結(jié)合實驗等由于操作較復(fù)雜，應(yīng)用較少。

2.1 抗體檢測

2.1.1 IgM 檢測 DENV IgM 一般在初次感染的第3 至5 天可以檢出，目前最常使用的IgM 檢測方法為酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法和膠體金（ICT）法檢測患者的血清標(biāo)本。 J.V.PARRY 團(tuán)隊[23]使用ELISA方法對唾液標(biāo)本進(jìn)行IgM 與IgG 抗體檢測， 陽性檢出率為92%，Andries Anne-Claire[24]發(fā)現(xiàn)唾液中的IgM 和IgG 檢測的靈敏度接近血漿樣本。 一項研究發(fā)現(xiàn)患者發(fā)病第7 天在尿液檢出IgM[25]。 Andries Anne-Claire 團(tuán)隊[24]發(fā)現(xiàn)，登革熱輕癥患者無法檢測到IgM， 因為當(dāng)腎小球濾過膜嚴(yán)重受損時,膜通透性增加,使IgM 這種分子量大的五聚體經(jīng)尿液排出，尿液中IgM 才會增多。 研究發(fā)現(xiàn)，尿液中DENV IgM 呈陽性的患者似乎病情更為嚴(yán)重，尿液IgM 陽性和陰性的血尿素氮肌酐比值為14.6%與8.2%，住院率分別為62.0%與35.7%[26]。 這提示尿液DENV IgM 可能是臨床早期嚴(yán)重程度的標(biāo)志。因此，DENV IgM 檢測優(yōu)先選擇血清作為標(biāo)本類型，在無法采血的情況，也可用尿液或者唾液作為替代的標(biāo)本類型。

2.1.2 IgG 檢測 DENV IgG 抗體一般在初次感染后10 d，再次感染后3 d 出現(xiàn)，在第3 周左右達(dá)到高峰。 在一項登革病毒IgM 與IgG 抗體檢測的試驗中，原發(fā)性登革熱感染患者IgM 水平升高而IgG檢測不出來，而大多數(shù)繼發(fā)性登革熱患者(86%)的IgG 水平升高而IgM 檢測不出來，推測IgG 檢測可用于區(qū)分原發(fā)性和繼發(fā)性DENV 感染[27]。 應(yīng)用ELISA 法檢測DENV 特異性IgM 和IgG 抗體，根據(jù)兩者的相對水平即IgM/IgG 比值聯(lián)合DENV RNA 來區(qū)分初次感染和二次感染是目前最方便、最常用的方法[28]。

2.1.3 IgA 檢測 秦成峰[29]使用膠體金免疫層析法可在登革熱患者發(fā)病2~13 d 于尿液中檢出DENV IgA， 并且發(fā)現(xiàn)重癥患者IgA 水平顯著高于輕癥患者，可作為臨床監(jiān)測病情發(fā)展的快速方法。 唾液中IgA、IgG 和IgM 的濃度約為每100 毫升19.4 mg、1.4 mg 和0.2 mg[23]，Grace Yap 等[30]用抗原捕獲抗登革熱IgA ELISA 技術(shù)（ACA-ELISA）檢測登革熱病人唾液， 發(fā)現(xiàn)在發(fā)熱后的3 d 內(nèi)陽性率為70%，在發(fā)熱后3 至8 d 上升至90%以上（在繼發(fā)病例中高達(dá)100%），靈敏度高于ELISA 法檢測血清IgM，后者在登革熱確診患者發(fā)熱后前3 d 的陽性率僅10%， 發(fā)熱第6 天后才上升到90%左右。 雖然ACA-ELISA 檢測唾液IgA 具有操作簡單、快速、無侵入性、成本低的優(yōu)點，但其與樣本中繼發(fā)性感染者的比例有很大關(guān)系。

2.2 NS1 抗原檢測 DENV 非結(jié)構(gòu)蛋白1 （NS1）是臨床上公認(rèn)的DENV 感染早期檢測的生物標(biāo)志物[31]。 研究表明，發(fā)展為重癥登革熱的患者更有可能出現(xiàn)NS1 抗原檢測陽性， 尤其是在發(fā)病第5 天后，NS1 抗原也因此被定義為重癥登革熱的標(biāo)志[32-33]。 目前諸多研究者將NS1 抗原的檢測與其他方法對比，余清[34]采用ELISA 方法對25 例登革熱患者進(jìn)行NS1 抗原檢測與IgM 聯(lián)合IgG 抗體檢測法進(jìn)行對比， 發(fā)現(xiàn)NS1 抗原檢測陽性率為96%（24/25） 高于IgM 聯(lián)合IgG 抗體檢測法的陽性率84%（21/25）；石亞玲[35]使用膠體金免疫層析（GICA）法檢測NS1 抗原，發(fā)現(xiàn)其與PCR 檢測的陽性符合率為89.87%， 優(yōu)于GICA 法檢測IgM、IgG 抗體對于PCR 檢測的陽性符合率64.88%， 而使用NS1 抗原和IgM/IgG 抗體聯(lián)合檢測結(jié)果與PCR 結(jié)果最接近， 且特異性良好， 因此條件允許的情況下，多種方式結(jié)合能提高檢出率。 有研究研制了一種無標(biāo)記的化學(xué)抗性免疫傳感器， 在模擬的人工唾液中無需標(biāo)記抗體孵育10 min 就能檢測到濃度低至1 ng/mL 的DENV NS1[36]，另一項研究中標(biāo)記抗體后孵育2 h 檢測到濃度低至0.5 ng/mL 的DENV NS1[24]。

3 分子生物學(xué)檢測

3.1 反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) （Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR） RTPCR 通過使病毒RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA 再以此為模板擴(kuò)增從而檢測病毒基因組。 多項研究使用RT-PCR 方法對登革熱患者的標(biāo)本類型上進(jìn)行比較，Chonticha Klungthong 團(tuán)隊[37]的研究中使用巢式PCR（nested RT-PCR）的方法，對比登革熱患者全血、血漿與血清標(biāo)本的陽性率，發(fā)現(xiàn)全血檢出率是三者中最高的。 發(fā)病3 d 內(nèi)，血清RT-PCR 檢出率為100%，而尿液與唾液聯(lián)合則能達(dá)到80%；發(fā)病后期，即發(fā)病6~16 d，尿液與唾液的聯(lián)合檢出率高于血清[24,38-40]。一項研究[41]發(fā)現(xiàn)納米陷阱(NT)顆粒與某些親和劑（如丙烯酸和活性紅120）等的化學(xué)誘導(dǎo)結(jié)合可以增加8~16 倍的病毒基因組拷貝數(shù)，且實驗在多種病毒（ZIKV、DENV 和CHIKV）混合的尿液樣本中有良好的特異性， 但該研究目前還處于模型感染階段， 需要在含有多種傳染性蟲媒病毒的臨床樣本中驗證。

3.2 實時熒光定量PCR （Quantitative real-time PCR，qPCR） 實時熒光定量PCR 是指在PCR 反應(yīng)體系中借助熒光信號來檢測病毒基因組。 目前，實時熒光定量PCR 分為探針法和染料法， 具有很高的靈敏性和特異性，越來越被廣泛使用。 常規(guī)的標(biāo)本類型為血清， 在發(fā)病第2 天即可在血中檢測到DENV RNA。 最早在發(fā)病第3 天能在尿液中檢出DENV RNA，至第7 至8 天陽性率最高，為73.2%，最長能在發(fā)病第14 天檢出[42]。 EssiM.Korhonen[43]發(fā)現(xiàn)， 在登革熱癥狀出現(xiàn)后第7 至13 天， 尿液中DENV RNA 檢出率(72%)高于血清(31%)和唾液(50%)，與邱爽[44]的分析結(jié)果一致。 這提示尿液中病毒陽性持續(xù)時間更長，尿液檢測檢出窗口更寬、無創(chuàng)、安全，可以作為一種實驗室診斷方法的補(bǔ)充。

有研究者使用同種熒光PCR 試劑盒對比核酸提取方法， 同時使用同種核酸提取方對比不同熒光PCR 試劑盒， 結(jié)果為柱提法提取與自合成引物熒光PCR 的靈敏度最高[45]。 對于低病毒含量的樣本，不同樣本類型、核酸提取方法，不同試劑的選擇可能直接影響病毒的檢出。有研究建立了針對4種亞型登革病毒的一種相對成本更低， 最低檢出限為4.88 copies/uL 的方法[46]，適用于登革病毒的快速檢測與分型。

3.3 其他分子生物學(xué)方法

3.3.1 實時熒光逆轉(zhuǎn)錄重組酶介導(dǎo)核酸擴(kuò)增技術(shù)（RT-RAA） 在重組酶介導(dǎo)核酸擴(kuò)增技術(shù)的基礎(chǔ)上.利用熒光染料釋放光能的變化動態(tài)反映病毒量。 在39℃反應(yīng)20 min，即可完成檢測，特異性與DENV 四種不同血清型間以及其他黃病毒屬病毒均無交叉反應(yīng)， 檢測的靈敏度為102copies/uL，試驗的重復(fù)性好[47]。

3.3.2 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-連接酶檢測技術(shù)(PCRLDR) 應(yīng)用PCR-LDR 可實現(xiàn)DENV 1-4 血清型的多重檢測和分型技術(shù)。 在C 基因和E 基因處設(shè)計了73 條PCR 引物進(jìn)行PCR 反應(yīng)后于一個多重LDR 中進(jìn)行靶向反應(yīng)， 所產(chǎn)生的熒光標(biāo)記的連接產(chǎn)物在通用陣列上檢測。 350 例急性期患者血清中，與實時熒光定量PCR 結(jié)果相比，靈敏度和特異性均在98%以上，具有快速、靈敏、特異、高通量的特點，可同時檢測所有四種血清型DENV[48]。

3.3.3 逆轉(zhuǎn)錄重組酶聚合酶擴(kuò)增-側(cè)向流層析試紙條檢測技術(shù)(RT-RPA-LFD) 借助重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)，結(jié)合側(cè)向流層析技術(shù)建立的檢測方法，在40℃反應(yīng)20 min， 即可完成檢測， 能同時檢測DENV1-4，檢出限為10 copies/反應(yīng)。 該檢測方法可以直接肉眼讀取結(jié)果，特異性強(qiáng)，但其缺點為成本較高[49]。

三 總結(jié)與展望

登革熱為我國法定乙類傳染病， 且尚無特效治療藥物及防治疫苗， 對于臨床病例和流行病區(qū)的病例快速準(zhǔn)確地實驗室診斷在登革熱疫情防控中顯得尤為重要。 根據(jù)不同的場景，可以選擇不同的檢測方法，例如：海關(guān)等現(xiàn)場檢測可以使用膠體金免疫層析法進(jìn)行快速篩查， 實時熒光定量PCR方法進(jìn)行確證； 而臨床工作中， 則更傾向于使用DENV IgM/IgG 法聯(lián)合熒光定量PCR 法來確診病例。

目前， 登革病毒實驗室檢測的標(biāo)本類型主要為血液標(biāo)本。 而在尿液、唾液等樣本中可檢出登革病毒核酸和抗體為采血困難的嬰幼兒以及重癥患者采集無創(chuàng)樣本提供了可能[44]，為研究易于推廣的無創(chuàng)快速篩查登革病毒技術(shù)提供了方向。 2019 年全國發(fā)生大范圍的登革熱暴發(fā)疫情， 我國基層病毒性傳染病實驗室條件差、檢測能力弱，因此，開發(fā)適合于我國農(nóng)村、邊遠(yuǎn)山區(qū)、海島等基層醫(yī)療水平欠發(fā)達(dá)地區(qū)使用的檢測登革病毒檢測試劑是急需攻克的難題也是今后研究的目標(biāo)。