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評(píng)價(jià)MALDI-TOF MS 在快速鑒定腹膜透析相關(guān)腹膜炎病原菌的價(jià)值

2022-12-06 05:40吳清念劉春林黃德兵
關(guān)鍵詞:腹膜炎革蘭腹膜

吳清念,劉春林,黃德兵

(佛山市南海區(qū)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科,廣東 佛山528200)

腹膜透析是治療終末期腎病的有效手段之一[1]。 腹膜炎是腹膜透析患者常見的并發(fā)癥,嚴(yán)重的腹膜炎或多次腹膜炎發(fā)作是導(dǎo)致患者退出腹膜透析的主要原因,治療不及時(shí),一方面會(huì)導(dǎo)致腹膜超濾能力下降加劇病情;另一方面,造成醫(yī)療費(fèi)用增加,死亡率可高達(dá)20%[2-3]。 明確腹膜炎感染病原菌有助于臨床進(jìn)行針對(duì)性治療, 但現(xiàn)有基于培養(yǎng)的傳統(tǒng)檢測(cè)方法,通常耗時(shí)18~48 h,并不能及時(shí)滿足臨床的需要。 近年來,基質(zhì)輔助激光解離電離飛行時(shí)間質(zhì)譜 (Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight,MALDI-TOF MS,簡(jiǎn)稱MS)在臨床微生物的鑒定應(yīng)用得到廣泛關(guān)注,具有快速、經(jīng)濟(jì)、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)[4-5]。因而,本研究擬評(píng)價(jià)MALDITOF MS 在快速鑒定腹膜透析相關(guān)腹膜炎病原菌的價(jià)值,以期為臨床提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本來源 收集2018 年1 月至12 月在本院住院臨床診斷腹膜透析相關(guān)腹膜炎患者125 例,將腹膜透析液培養(yǎng)陽性45 例作為樣本來源。

1.2 傳統(tǒng)鑒定方法 腹膜透析液檢測(cè)采用美國BD9120 全自動(dòng)血培養(yǎng)系統(tǒng),細(xì)菌分離及鑒定依據(jù)全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程第三版。 取腹膜透析液培養(yǎng)陽性瓶并從中吸取培養(yǎng)液涂片, 干燥后固定并進(jìn)行革蘭染色; 同時(shí)接種固體培養(yǎng)基包括哥倫比亞血瓊脂平板、麥康凱平板和巧克力平板(均購自江門市凱林貿(mào)易有限公司)。 菌株的鑒定采用梅里埃VITEK 2 Compact 細(xì)菌鑒定藥敏儀。

1.3 MALDI-TOF MS 方法

1.3.1 標(biāo)本前處理 采用差速離心聯(lián)合分離膠促凝管富集法:第一步,用5 mL 注射器從陽性瓶中抽取5 mL 培養(yǎng)液至無菌潔凈的試管中,1 000 r/min離心10 min(將大部分紅細(xì)胞、白細(xì)胞及大分子雜質(zhì)分離至底部),用加樣槍吸取上清液轉(zhuǎn)移至分離膠促凝管。 第二步,將上清液3 500 r/min 離心15 min,棄去上清液,加70%乙醇反復(fù)吹打沉淀物,然后1 000 r/min 離心10 min, 用加樣槍吸取上清液轉(zhuǎn)移至1 mL Ep 管,13 000 r/min 離心2 min,棄去上清液。第三步,向EP 管中加入生理鹽水900 μL,充分混勻懸液1 min,離心菌體細(xì)胞13 000 r/min,2 min(洗去乙醇避免影響圖譜質(zhì)量),留下沉淀物備用。

1.3.2 標(biāo)本檢測(cè) 將50 μL 70%甲酸水溶液加入沉淀物中,通過移液槍反復(fù)吹打,然后進(jìn)行漩渦充分混勻。 進(jìn)一步加入50 μL 乙腈,通過移液槍反復(fù)吹打混合懸液。 13 000 r/min,2 min 離心微生物提取物。 將1 μL 微生物提取物上清液吸取到MALDI靶板上,室溫晾干。 加入1 μL HCCA 基質(zhì)液覆蓋在樣本上,室溫晾干。 將MALDI 靶板放入質(zhì)譜儀檢測(cè)。 以上嚴(yán)格按照質(zhì)譜操作流程進(jìn)行。

1.3.3 試劑耗材 MALDI-TOF MS 儀及其配套試劑乙腈、 甲酸、HCCA 基質(zhì)液、96 孔不銹鋼靶板均購自德國Bruker 公司; 血清分離促凝膠管購自廣州科普醫(yī)療生物技術(shù)有限公司。 質(zhì)控菌株包括大腸 埃 希 菌 (ATCC25922)、 金 黃 色 葡 萄 球 菌(ATCC25923)均購自廣東省臨床檢驗(yàn)中心。

1.3.4 統(tǒng)計(jì)分析 所有數(shù)據(jù)在EXCEL 2003 軟件包處理,與傳統(tǒng)方法為對(duì)照,計(jì)算MS 質(zhì)譜儀鑒定的一致率和準(zhǔn)確度。

2 結(jié)果

在本次研究中, 共有125 例腹膜透析相關(guān)腹膜炎患者, 腹膜透析液培養(yǎng)陽性45 例, 檢出率36%。 其中送檢腹透液培養(yǎng)523 瓶,陽性報(bào)警瓶為112 瓶。 單一感染42 例占93.3%,混合感染3 例占6.7%(大腸埃希菌+表皮葡萄球菌、 金黃色葡萄球菌+糞腸球菌、銅綠假單胞菌+表皮葡萄球菌)。 以傳統(tǒng)鑒定方法為參照, 傳統(tǒng)鑒定方法與MALDITOF MS 法總體一致性為80%,其中對(duì)革蘭陰性菌一致性較高為86.9%,革蘭陽性菌為70.6,見表1。

3 討論

本研究首次報(bào)道了,MALDI-TOF MS 在快速鑒定腹膜透析相關(guān)腹膜炎患者腹透液病原菌的價(jià)值,結(jié)果提示,傳統(tǒng)鑒定方法與MALDI-TOF MS 法總體一致性為80%, 其中對(duì)革蘭陰性菌一致性較高為86.9%,革蘭陽性菌為70.6,展示了較好的鑒定能力。

MALDI-TOF MS 是一種檢測(cè)微生物的新型工具,具有快速、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)勢(shì)[4-5]。 大量的文獻(xiàn)報(bào)道[6-8],MS 能夠?qū)蝹€(gè)細(xì)菌菌落快速鑒定,MS 數(shù)據(jù)庫能夠覆蓋常見的細(xì)菌、 真菌以及分枝桿菌。 MS還可以直接檢測(cè)臨床樣本比如血液、 尿液、 腹水等。 與直接鑒定單個(gè)菌落的不同,直接檢測(cè)樣本,其前處理方法與正確鑒定率有很大的關(guān)系。 目前,MS 直接檢測(cè)血培養(yǎng)陽性病原菌比較成熟,提取細(xì)菌蛋白方法有Sepsityper 試劑盒、 分離膠促凝管、濾 膜 吸 附 法 等[9]。 Wüppenhorst 等 報(bào) 道[10],應(yīng) 用Sepsityper 試劑盒,MS 對(duì)500 個(gè)需氧和厭氧陽性瓶檢測(cè),正確鑒定率89.5%。 另一篇報(bào)道[11],比較不同富集法聯(lián)合MS 檢測(cè)中段尿病原菌的價(jià)值,分離膠促凝管離心和差速離心富集聯(lián)合MS 檢測(cè),總體鑒定一致性分別為86.7%和81.9%。 最近丁秀榮等報(bào)道[12],采用差速離心法評(píng)價(jià)MS 對(duì)196 陽性瓶為單株感染腹水,菌株的種鑒定符合率為77.6%,其中革蘭陰性菌的種75.9%,革蘭陽性菌的種鑒定符合率為80.2%,但他們對(duì)6 瓶混合菌感染樣本,均鑒定出其中一種菌。 與上述研究稍有不同,本研究采用差速離心聯(lián)合分離膠促凝管富集法對(duì)腹透液陽性瓶直接檢測(cè), 結(jié)果提示總體細(xì)菌鑒定一致性達(dá)80%,對(duì)革蘭陰性桿菌鑒定率較高達(dá)86.9%。 尤其值得注意的是, 本研究中3 個(gè)混合感染樣本,MS準(zhǔn)確地鑒定出2 個(gè)混合細(xì)菌感染樣本, 作者主要是基于陽性培養(yǎng)液革蘭染色涂片結(jié)果, 同時(shí)采用MS 混合菌庫模式手工分析圖譜峰,都得到了較滿意的結(jié)果。 與本研究樣本處理方法不同,蘆嘉報(bào)道[13],采用腹水短期培養(yǎng)后再進(jìn)行MS 檢測(cè),單一細(xì)菌生長(zhǎng)的樣本鑒定結(jié)果與常規(guī)方法符合率達(dá)到94.1%,高于本研究(符合率80%),究基原因可能是病原譜構(gòu)成不同,以及標(biāo)本類型不一樣(腹透液VS 腹水), 細(xì)胞和蛋白含量都可能影響細(xì)菌蛋白的提純。 此外,有學(xué)者報(bào)道,同一份樣本多孔涂布在靶板上, 增加檢測(cè)次數(shù)有助于提高鑒定的準(zhǔn)確性, 這可以嘗試地運(yùn)用在鑒定結(jié)果不理想的樣本中[14]。

總之, 本研究采用差速離心聯(lián)合分離膠促凝管富集法對(duì)腹透液陽性瓶直接檢測(cè), 得到較高的準(zhǔn)確性,能夠?yàn)榕R床提供病原學(xué)證據(jù),助于臨床早期使用抗生素改善患者的預(yù)后。

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