程姣姣 阮祥燕 杜 娟 谷牧青

(首都醫(yī)科大學附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院/北京婦幼保健院內分泌科，北京 100026)

隨著癌癥診斷與治療技術的進步，兒童、青少年、年輕女性癌癥患者的5年存活率明顯提高，有的5年存活率可高達90%以上[1]，但抗癌治療導致早發(fā)性卵巢功能不全(premature ovarian insufficiency, POI)的發(fā)生率明顯增加。影響因素包括年齡、化學藥物治療(以下簡稱化療)藥類型、劑量、放射治療(以下簡稱放療)部位、累積劑量等[2]。目前的生育力保護(fertility preservation, FP)方法主要包括卵巢組織凍存(ovarian tissue cryopreservation, OTC)、卵母細胞凍存和胚胎凍存[3]。對于青春期前女童和放射治療聯(lián)合化學藥物治療(以下簡稱放化療)無法延遲的女性來說，OTC是唯一的FP方法[4]。卵巢組織凍存每次移植后卵巢功能恢復率可高達77%～95%，移植后卵巢功能恢復率累積可達100%，妊娠率約55%，活產(chǎn)率約為40%[5]。截止到2021年，全球已有200多例嬰兒通過此技術誕生[6]，越來越多研究[7-8]表明OTC技術安全、有效，2019年美國生殖醫(yī)學學會(American Society of Reproductive Medicine, ASRM)[4]也聲明OTC技術不再是試驗性技術。

卵巢轉移風險很高的癌癥患者因再引入惡性細胞的風險高，不適合進行卵巢組織移植，但國際已有多個團隊移植了白血病患者的卵巢組織，沒有復發(fā)報道[9-11]。未成熟卵母細胞體外成熟(invitromaturation, IVM)獲取第二次減數(shù)分裂中期(metaphase II, MⅡ)卵母細胞能安全地恢復生育力。成熟卵母細胞及卵母細胞玻璃化冷凍已成為臨床常規(guī)，并且對IVM培養(yǎng)系統(tǒng)不斷優(yōu)化以獲得更高的成功率。卵巢組織卵母細胞體外成熟(invitromatured ovarian tissue oocytes, OTO-IVM)也越來越受到重視，可額外增加患者獲益。本文主要圍繞IVM及其優(yōu)化以及OTO-IVM在FP的應用進展。

1 卵母細胞體外成熟

IVM是指生長卵泡來源的未成熟卵丘卵母細胞復合體(cumulus-oocyte complexes, COCs)體外培養(yǎng)成熟至MⅡ期的過程。1994年Trounson等[12]報道了全球首例IVM活產(chǎn)，產(chǎn)婦是一名多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome, PCOS)患者。截至目前，全球已有5 000多名IVM嬰兒出生[13]，IVM作為體內成熟卵母細胞體外受精(invitrofertilization, IVF)的替代方法的潛在應用受到越來越多的關注，IVM刺激周期更短，注射更少，相關藥物和監(jiān)測成本更低，更減輕患者的負擔[14]。IVM最初引入臨床是作為一種比傳統(tǒng)卵巢刺激更安全的選擇，IVM的候選患者包括卵巢過度刺激綜合征(ovarian hyper-stimulation syndrome, OHSS)風險高的患者，如PCOS或卵巢多囊樣改變。研究[15]顯示PCOS不孕患者應用IVM，成熟率高達84%，受精率高達80%，每個周期的臨床妊娠率高達50%。

2021年ASRM聲明IVM技術不再被認為是試驗性的[16]。竇卵泡數(shù)(antral follicle counting, AFC)高的患者是IVM技術好的候選者，但應意識到與IVF比，囊胚形成率、胚胎植入和妊娠率可能降低。卵母細胞胞質內單精子顯微注射(intracytoplasmic sperm injection, ICSI)可與IVM聯(lián)合應用[17]。由于IVM活產(chǎn)數(shù)相對較少，關于IVM的畸形和發(fā)育安全性尚不能充分評估，但初步研究是令人放心的。

IVM的適應證已擴大到生育力保護和罕見情況，如卵巢抵抗綜合征(resistant ovary syndrome, ROS)[18]或反復缺陷的卵母細胞成熟。ROS的發(fā)病機制是卵泡刺激素受體(follicle stimulating hormone receptor,FSHR)基因突變[19]，卵泡對內源性或外源性FSH無反應，特征是原發(fā)性閉經(jīng)，乳房、腋毛和陰毛發(fā)育良好，血清卵泡刺激素(follicle stimulating hormone, FSH)和黃體生成素(luteinizing hormone, LH)濃度升高，而AFC和抗苗勒管激素(anti-Müllerian hormone, AMH)濃度正常，卵泡很少發(fā)育到竇卵泡期，很難自然受孕，通常不得不接受卵子捐贈。已有研究[20-21]報道在ROS患者中采用IVM技術實現(xiàn)妊娠和活產(chǎn)，ROS患者采用IVM技術的活產(chǎn)率約為33.3%，IVM為ROS患者獲得自身生物學的后代提供了可能。

2 卵巢組織卵母細胞體外成熟

2.1 卵巢組織卵母細胞體外成熟概況

COCs最早是經(jīng)陰道卵泡抽吸法收集，新方法包括腹腔鏡/開腹時從卵巢或對側卵巢原位抽吸卵泡，以及在卵巢皮質凍存時從切除的卵巢組織或處理卵巢組織后的培養(yǎng)液中抽吸體外卵泡，后一種方案被稱為OTO-IVM，是一種很有前途的腫瘤患者FP方法，被用以最大限度地保護生育力[22]。收集途徑的不同，收集COCs的成熟度不同，從陰道抽吸卵泡收集的COCs來自較大的卵泡，因此更成熟，而從切除的卵巢組織中或從皮質準備過程體外回收的COCs來自小竇卵泡(small antral follicles, SAF)，因此更不成熟。在卵巢組織取材前經(jīng)超聲引導下取未成熟卵母細胞，或者在卵巢組織取材時從原位的對側卵巢中抽吸肉眼可見的卵泡，結合從離體卵巢組織中獲取的未成熟卵泡，可增加整體的獲取未成熟卵母細胞數(shù)[23-24]。

OTO-IVM最先由Revel等[25]提出，可以最大限度地保護接受卵巢切除術的患者的生育力[26]。OTO-IVM可以在沒有任何卵巢刺激且在月經(jīng)周期任意時間獲取未成熟卵母細胞，同時還可以與其他手術相結合。很多原始卵泡主要集中于卵巢皮質中，因此將卵巢髓質去除，將皮質切成8 mm×4 mm的皮質片，然后慢速程序化凍存或玻璃化凍存，往往在卵巢組織處理的培養(yǎng)液中含有相當多的未成熟卵母細胞，應收集通過IVM技術成熟后凍存，可為將來提供安全的配子，OTO-IVM技術對于卵巢組織移植惡性細胞污染風險高的癌癥患者是一個選擇。

無論是從卵巢表面可見的竇卵泡(直徑3～5 mm)，還是從卵巢組織處理后的盤子中脫落的小卵泡(直徑0.5～6.0 mm)和中卵泡(直徑7～11 mm)分離出的未成熟卵母細胞均具有體外成熟的潛力。在OTC時獲取的卵母細胞獲得最大體外成熟率有最佳的年齡段，成熟率約29%～38%[27-29]，但也有報道[30]IVM成熟率高達68%。卵巢組織低溫轉運以及較長的轉運時間與較低的IVM成熟率有關[31]，但卵巢組織轉運不應該被認為是OTO-IVM的限制，卵巢組織轉運對卵母細胞發(fā)育能力的影響仍不能確定，需進一步評估[32]。目前已有5例健康嬰兒通過此技術誕生[33-34]。

研究[28]表明，OTO-IVM可以保存較高數(shù)量的成熟卵母細胞和胚胎，但妊娠率較低，妊娠結局較差，建議該方法保留給有較高AFC的患者，并且不能取代卵巢組織移植。大約需要20個MⅡ期卵母細胞才能獲得1個活產(chǎn)嬰兒[35]，OTO-IVM可以作為OTC的補充方法，但IVM不能被推薦為單一的生育力保護方法。OTO-IVM患者中約42%只能獲得≤1個的MⅡ期卵母細胞。OTO-IVM方法耗時且目前還沒有可用于0.5～6.0 mm小卵泡的完善培養(yǎng)系統(tǒng)，還未納入臨床常規(guī)實踐。盡管OTO-IVM前景好，但證據(jù)仍少，驗證確認重復性是至關重要的，包括對OTO-IVM后出生孩子的隨訪。

2.2 青春期前卵巢組織卵母細胞體外成熟

卵巢組織凍存是青春期前女孩保護生育力的標準方法。白血病是青春期前女童進行卵巢組織凍存的常見診斷，因此為青春期前女童開發(fā)體外培養(yǎng)的方法是非常重要的。研究[36]顯示，青春期前的卵巢含有很高比例的異常卵泡。在<6歲和≥30歲患者中IVM成熟率極低(<10%)，有研究[37]表明月經(jīng)初潮前患者IVM成熟率(24.7%)明顯低于月經(jīng)初潮后的患者(31.0%)。開發(fā)IVM系統(tǒng)的主要挑戰(zhàn)之一是根據(jù)不同階段的卵母細胞需求調整培養(yǎng)條件，因為不同年齡和青春期成熟階段的卵泡數(shù)量有顯著差異，青春期前女孩的卵泡在體外表現(xiàn)出與成人不同的生長軌跡，因此，為成人開發(fā)的培養(yǎng)系統(tǒng)可能不適用于青春期前女童[36]。

3 卵母細胞體外成熟的優(yōu)化研究

3.1 獲能卵母細胞體外成熟

卵母細胞成熟過程是復雜的，需實現(xiàn)核和胞質成熟。核成熟包括染色體聚集、分離和極體排出，細胞質成熟包括細胞器的重新分布和細胞骨架細絲的動態(tài)變化，協(xié)調才能保證卵母細胞的發(fā)育能力，IVM成熟率低與胞質和胞核非同步成熟有關。在體內，減數(shù)分裂停滯為胞質成熟提供了必要的時間，在LH濃度激增后恢復減數(shù)分裂。一旦COCs從卵泡中釋放出來，減數(shù)分裂就會恢復，與此同時，卵母細胞失去了與卵丘細胞的縫隙連接，停止了營養(yǎng)和信號分子的供應，使得細胞質不成熟，意味著卵母細胞的細胞器具有生發(fā)泡(germinal vesicle, GV)期的典型結構和定位[38]。

細胞核和細胞質不同步的問題可以通過實施雙相體外成熟系統(tǒng)來解決，一種提高卵母細胞成熟潛力的預成熟培養(yǎng)(prematuration culture, PMC)或“獲能”(capacitation, CAPA)，該方案稱為“CAPA-IVM”[39]。第一步是卵母細胞暫時停止減數(shù)分裂，并延長卵母細胞與卵丘細胞之間的相互作用，卵母細胞的獲能依賴于與卵丘細胞的緊密相互作用，第二步，減數(shù)分裂恢復，COCs最終成熟。

第一步，在PMC培養(yǎng)液中添加C型利鈉肽(C-type natriuretic peptides, CNPs)，使人卵母細胞處于減數(shù)分裂停滯狀態(tài)。CNPs是一種由壁層顆粒細胞產(chǎn)生并分泌到卵泡液中的生理性卵母細胞成熟抑制劑，是卵母細胞中有效的抑制磷酸二酯酶3(phosphodiesterase 3-inhibitor, PDE3)的天然分子，被證明更好地保留了卵丘與卵母細胞的相互作用，這一步驟稱為獲能[40]。CNPs與卵丘細胞表達的利鈉肽受體2(natriuretic peptide receptor 2, Npr2)結合誘導環(huán)磷酸鳥苷(cyclic guanosinc monophosphate, cGMP)的生成，cGMP通過縫隙連接通訊(gap-junctional communication, GJC)進入卵母細胞，通過競爭卵母細胞特異性PDE3A的水解活性來調節(jié)環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate, cAMP)濃度[41]，cAMP濃度對于維持卵母細胞減數(shù)分裂停滯非常重要[42]，高濃度的cAMP還有其他機制，cAMP從卵丘細胞通過GJC進入卵母細胞；cAMP由卵母細胞自身通過膜上的G蛋白偶聯(lián)受體產(chǎn)生[43]。作為對LH的應答，通過降低CNP、Npr2的表達水平以及降低Npr2的鳥苷酸環(huán)化酶活性來恢復減數(shù)分裂。研究[39]表明，在PCOS患者中，采用CNP作為減數(shù)分裂抑制劑的CAPA-IVM比傳統(tǒng)IVM系統(tǒng)更能促進胚胎發(fā)育，并獲得良好的臨床妊娠率。研究[44]表明，應用CAPA-IVM系統(tǒng)可提高婦科惡性腫瘤患者的OTO-IVM成功率。CNP介導的CAPA-IVM已被證明能顯著提高SAF的IVM成熟率和發(fā)育能力[45]。盡管雙相IVM已應用于人，但培養(yǎng)液還未商業(yè)化，不能保證各中心的效果和安全性是一致的。但雙相IVM在臨床上的引入被認為是近年來最顯著的進展[46]。

3.2 卵母細胞體外成熟其他優(yōu)化研究

COCs在體外通過增加LH受體的表達以增加對FSH刺激的應答，更容易恢復減數(shù)分裂。Cadenas等[47]探討IVM液中添加不同重組FSH濃度對人卵母細胞IVM的影響及其對周圍卵丘細胞關鍵因子基因表達的影響。從每位患者的髓質中平均可收集到15～36個未成熟卵母細胞，未受到外源性促性腺激素刺激，也沒有進入到卵泡選擇階段，可能是研究FSH在人IVM過程中作用的更好起點。研究[47]表明在IVM培養(yǎng)液中加入70 IU/L FSH，通過上調卵丘細胞中LH受體和下調FSHR可促進卵母細胞核成熟。FSH濃度是否會影響卵母細胞的發(fā)育能力和生殖結局還有待進一步研究，但有助于開發(fā)優(yōu)化從未受卵巢刺激患者的SAF中提取的卵母細胞的IVM方案，可能是通過在將COCs暴露于LH前采用FSH刺激卵丘細胞中LH受體的表達來實現(xiàn)的。

研究[48]表明，卵泡液中含有激素和生長因子，這些激素和生長因子對卵母細胞IVM非常重要。中期因子是一種通過NOTCH通路發(fā)揮作用的生長因子，已被證明加入IVM培養(yǎng)液中可顯著提高成熟率。SAF卵泡液蛋白質組學分析，鑒定出2 000多種不同的蛋白質，中期因子是重要的生長因子之一。因此改進和開發(fā)更有效的IVM系統(tǒng)是可能的[49]。

在體內，LH激增導致顆粒細胞釋放表皮生長因子(epidermal growth factor, EGF)，EGF對圍排卵期很重要，包括卵母細胞減數(shù)分裂的重新啟動。有研究[50]表明在培養(yǎng)液中添加EGF對COCs的IVM有益處。雙調蛋白(amphiregulin, AREG)是成熟卵泡卵泡液中含量最豐富的EGF配體，AREG是卵母細胞成熟和能力的一個有用的標志物和重要的調節(jié)因子[51]。有研究[52-54]探討雙調蛋白在CAPA-IVM中的潛在應用，結果表明雙調蛋白在觸發(fā)卵母細胞成熟和發(fā)育過程中有益，包括更快地激活排卵級聯(lián)，促進氧化還原動態(tài)平衡和適當?shù)募に睾铣桑欢?，還需要更大規(guī)模的研究來進一步研究與驗證。

Xie等[52]在培養(yǎng)液中添加溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid, LPA)可提高卵母細胞成熟率，LPA是一種膜磷脂代謝物，具有生長因子和激素樣作用，存在于人體卵泡液中，濃度為10～25 mmol/L。Lee[53]研究顯示白細胞介素6和胰島素樣生長因子1是LPA促進人卵母細胞成熟的關鍵。研究以人脂肪來源的間充質干細胞(adipose-derived mesenchymal stem cells, ASC)條件培養(yǎng)液(conditioned medium, CM)為補充劑，改善卵母細胞體外發(fā)育和后續(xù)胚胎發(fā)育的IVM培養(yǎng)液，并證明了ASC-CM在豬卵母細胞體外成熟過程中的有效性，ASC-CM中存在的多種生長因子/細胞因子通過調節(jié)mRNA/蛋白的表達，積極參與COCs的發(fā)育，為進一步建立最優(yōu)的IVM條件提供了強有力的基礎。

雖然活性氧是卵母細胞新陳代謝的天然產(chǎn)物，但超生理水平的活性氧可導致氧化應激，氧化應激可氧化RNA、DNA和蛋白質，破壞細胞膜的完整性，縮短端粒，從而嚴重損害卵母細胞的功能[54]。目前認為線粒體功能受損可導致活性氧產(chǎn)生過多，但高水平的活性氧也會導致線粒體功能障礙。在卵母細胞成熟過程中，線粒體DNA拷貝數(shù)急劇增加，線粒體分布發(fā)生明顯變化，由于卵母細胞成熟需要大量的ATP來持續(xù)轉錄與翻譯，因此獲得合適數(shù)量的功能線粒體是至關重要的。為提高體外成熟卵母細胞的線粒體功能，以提高卵母細胞和胚胎的發(fā)育能力，已提出IVM液的補充劑，大多基于沉默調節(jié)蛋白1(sirtuin1, SIRT1)功能的上調，可增加線粒體的活性[55]，很可能通過有絲分裂促進卵母細胞線粒體的生物合成和降解以及穩(wěn)定線粒體膜電位。調節(jié)SIRT1功能的最常用的抗氧化劑之一是褪黑素，主要優(yōu)點之一是它是由卵丘細胞自然分泌的，對人卵母細胞的研究[56]表明，褪黑素可通過降低過量的Ca2+濃度和維持線粒體膜電位來改善線粒體的功能。另一種用于補充IVM系統(tǒng)的抗氧化劑是白藜蘆醇，植物性多酚化合物，有研究表明IVM培養(yǎng)液中添加1.0 μm白藜蘆醇可改善紡錘體的形態(tài)和更正確的染色體定位[57]。另一種很有前途的線粒體靶向IVM培養(yǎng)的藥物是抗氧化劑米托醌甲磺酸鹽(mitoquinone mesylate,MitoQ)，可在沒有任何載體的情況下被線粒體有效的攝取，在線粒體內部，MitoQ吸附在內膜上，對抗脂質過氧化[58]。雖然目前已有關于不同線粒體靶向補充劑對體外培養(yǎng)的有益效果，但還沒有一種被引入臨床實踐。

此外，為了保持和體內相似的細胞形態(tài)和功能，提出了三維(three-dimensional, 3D)培養(yǎng)系統(tǒng)的概念，即在膠原蛋白、基質、纖維蛋白或其他生物材料(如3D支架)中培養(yǎng)細胞，這些材料可為細胞生長提供3D環(huán)境，模擬體內的生理條件，更好地保存了體細胞和卵母細胞之間的生理溝通，可能還可以更好地維持COCs的結構和通過縫隙連接進行溝通，并確保適當?shù)墓δ芑顒覽59]。為人類卵母細胞體外成熟的研究開辟了新視角，隨著其進一步發(fā)展，被認為是提高人卵母細胞發(fā)育能力的一種很有前途的方法。

4 總結與展望

IVM技術是一項在IVF前就已建立的技術，近年來，CAPA-IVM雙向IVM系統(tǒng)明顯提高了IVM的成功率。此外，IVM技術與卵巢組織凍存移植的結合，可提高患者生育力保護的效率，而且對于卵巢攜癌風險高的患者也是一個安全的選擇。