萬(wàn)勝君 柯昌斌

湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院麻醉科，湖北十堰 442000

1992 年，Ran 等[1]從牛氣管中分離出第一個(gè)鈣激活氯通道調(diào)節(jié)劑（calcium-activated chloride channel regulator,CLCA）蛋白，并預(yù)測(cè)這是一種對(duì)氯離子通道阻滯劑具有陰離子選擇性和敏感性的通道蛋白。1995 年，Cunningham 等[2]在牛氣管的上皮細(xì)胞中克隆出一個(gè)與Ran 等[1]發(fā)現(xiàn)類似的鈣激活氯通道蛋白，將其命名為bCLCA1，這就是第一個(gè)CLCA 基因的發(fā)現(xiàn)。隨后該基因家族成員的數(shù)量不斷增長(zhǎng)，到目前為止已在包括人、牛、小鼠、大鼠、豬、狗和馬7 個(gè)物種中發(fā)現(xiàn)CLCA基因[3-4]。CLCA 家族的蛋白質(zhì)最初被認(rèn)為是允許氯離子通過(guò)細(xì)胞膜的通道，直到2005 年，Gibson 等[5]發(fā)現(xiàn)這些蛋白質(zhì)通過(guò)激活鈣依賴的氯通道（calcium-activated chloride channel，CaCC）來(lái)觸發(fā)氯離子穿過(guò)細(xì)胞膜的運(yùn)動(dòng)。

人體基因組存在4 種CLCA 基因，分別是CLCA1、CLCA2、CLCA3 和CLCA4。CLCA1 是人體內(nèi)該家族第一個(gè)被克隆和鑒定的基因。研究表明，CLCA1 蛋白參與了炎性氣道疾病[6]、腸道疾病[7]和惡性腫瘤[8]等的發(fā)生和進(jìn)展。充分了解CLCA1 蛋白的結(jié)構(gòu)、表達(dá)分布以及其在相關(guān)疾病的作用機(jī)制，可為疾病的治療提供有價(jià)值的參考。

1 CLCA1 的分子結(jié)構(gòu)與分布

1.1 CLCA1 的分子結(jié)構(gòu)

CLCA1 是定位于1 號(hào)染色體短臂（p22-p31）上具有14 個(gè)內(nèi)含子和15 個(gè)外顯子的長(zhǎng)31 902 bp 的基因，其前端有一個(gè)包含L1 轉(zhuǎn)座因子片段的典型啟動(dòng)子區(qū)域，編碼相對(duì)分子質(zhì)量約為125 kD 的前體蛋白[9]，這是一種約由900 個(gè)氨基酸組成的分泌自裂解蛋白。

1.2 CLCA1 的分布

CLCA1 蛋白在多種動(dòng)物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，在小鼠、大鼠、豬、貓、牛和馬中鑒定和克隆了同源基因。CLCA1主要存在于正常的大腸、小腸和闌尾中，尤其在隱窩細(xì)胞中表達(dá)相對(duì)豐富，在病變的肺、胰腺、卵巢和健康的黏膜組織，如子宮、睪丸和腎臟也有一些表達(dá)[10-13]。

2 CLCA1 的分子特性

CLCA1 蛋白具有高度保守的蛋白結(jié)構(gòu)域，對(duì)其進(jìn)行純化的蛋白質(zhì)、肽和全面的功能分析，證明它是一種新型的鋅金屬蛋白酶，具有自我催化裂解功能。CLCA1 現(xiàn)唯一已知的底物是其自身，在胞內(nèi)合成后經(jīng)過(guò)自催化裂解使得兩個(gè)裂解產(chǎn)物片段都分泌至胞外。CLCA1 的N 端信號(hào)序列引導(dǎo)蛋白質(zhì)進(jìn)入分泌途徑，并進(jìn)行自催化裂解，從而產(chǎn)生約90 kD 和38 kD的N 端和C 端片段[14]。其N 端產(chǎn)物包含3 個(gè)結(jié)構(gòu)域，分別為鋅依賴的金屬蛋白酶催化結(jié)構(gòu)域（CAT）、富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)域（Cys）、von Willebrand A 型結(jié)構(gòu)域（vWA），C 端產(chǎn)物為Ⅲ型纖連蛋白結(jié)構(gòu)域（FnⅢ）。N端產(chǎn)物CAT 內(nèi)具有類似于基質(zhì)金屬蛋白酶和去整合素金屬蛋白酶的保守HExxE 催化基序，vWA 內(nèi)具有保守的金屬離子依賴黏附位點(diǎn)。

3 CLCA1 的基本功能

CLCA1 的主要功能為激活CaCC，利用速率理論分析建立的模型證明CLCA1 通過(guò)降低離子在孔隙中轉(zhuǎn)運(yùn)的能壘從而提高CaCC 的電導(dǎo)，增加內(nèi)源性鈣依賴性氯離子電流的幅度[15]。對(duì)于CaCC 的激活，CLCA1的自催化裂解發(fā)揮不可或缺的作用，因?yàn)檫@種激活過(guò)程需要自裂解暴露包含CAT/Cys 和vWA 結(jié)構(gòu)域的N端片段[16]。

4 CLCA1 的生理和病理作用

氯離子通道在生物體內(nèi)廣泛分布，相比于氯離子的運(yùn)輸，他們能更好地傳導(dǎo)其他陰離子。氯離子通道在物質(zhì)跨細(xì)胞上皮運(yùn)輸、細(xì)胞的增殖與分化、凋亡，乃至參與細(xì)胞免疫應(yīng)答和細(xì)胞興奮性調(diào)節(jié)等過(guò)程中都具有關(guān)鍵作用。因此，作為氯離子通道調(diào)節(jié)劑的CLCA1 在生物體內(nèi)也具有十分重要的作用。

4.1 CLCA1 在呼吸系統(tǒng)中的作用

CLCA1 在呼吸道黏膜表面表達(dá)3 種CLCA 蛋白，但調(diào)節(jié)黏液蛋白基因表達(dá)和隨之產(chǎn)生的黏液是CLCA1 特有的功能。CLCA1 由杯狀細(xì)胞和其他產(chǎn)生黏蛋白的細(xì)胞選擇性表達(dá)，通過(guò)啟動(dòng)絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號(hào)通路，在體內(nèi)表達(dá)黏液蛋白，從而刺激黏液產(chǎn)生，并分泌到氣道黏液層[17]。

在維持氣道環(huán)境穩(wěn)態(tài)中，氣道黏液通過(guò)發(fā)揮黏膜免疫和黏膜清除能力構(gòu)成氣道防御系統(tǒng)的一部分，梗阻性黏液產(chǎn)生的主要來(lái)源是黏液細(xì)胞化生（mucous cell metaplasia，MCM），即小氣道上皮細(xì)胞分化為產(chǎn)生黏液的杯狀細(xì)胞。MCM 是由炎癥免疫細(xì)胞在應(yīng)對(duì)過(guò)敏原、病原體等攻擊時(shí)產(chǎn)生的白細(xì)胞介素-13（inter leukin-13，IL-13）、IL-4、IL-9等輔助性T細(xì)胞2（helper T cell 2，Th2）觸發(fā)的。在慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）、支氣管哮喘等疾病中黏液分泌過(guò)度是一個(gè)主要的臨床和病理特征，當(dāng)機(jī)體遭受上述疾病時(shí)，氣道內(nèi)的杯狀細(xì)胞群有擴(kuò)大的趨勢(shì)，即發(fā)生MCM。氣道黏液的最關(guān)鍵成分之一是黏蛋白MUC5AC，這是一種凝膠形成的可溶性黏多糖組成的糖蛋白。

4.1.1 支氣管哮喘 IL-9 在哮喘的氣道重塑中發(fā)揮重要作用，其在哮喘患者氣道上皮細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)。IL-9對(duì)支氣管上皮細(xì)胞有多種影響，包括肥大、轉(zhuǎn)化為杯狀細(xì)胞表型等。Th2 型超敏反應(yīng)產(chǎn)生IL-4、IL-5、IL-9和IL-13 等細(xì)胞因子，其中IL-4、IL-13 與IL-9有一定的重疊作用，進(jìn)一步推動(dòng)哮喘的演變進(jìn)程。

哮喘患者氣道上皮CLCA1 mRNA 表達(dá)上調(diào)[18]。研究表明，CLCA1 上調(diào)的部分原因是IL-9，在IL-9 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的肺組織中CLCA1 表達(dá)顯著增加，氣管內(nèi)注入IL-9 和Th2 細(xì)胞因子后CLCA1 的表達(dá)也明顯增多[19]。如前所述，IL-9 在哮喘黏液分泌中起重要作用，用人原代肺上皮細(xì)胞培養(yǎng)系證實(shí)，IL-9 直接上調(diào)MUC5AC。而CLCA1 似乎與MUC5AC 的高分泌也有關(guān)。這兩個(gè)基因都是在腫瘤壞死因子α 的刺激下，被誘導(dǎo)產(chǎn)生于氣道黏膜組織中的[20]，將CLCA1 引入人肺黏液上皮樣癌細(xì)胞（NCI-H292）可以誘導(dǎo)黏液的產(chǎn)生和MUC5AC 的表達(dá)[21]。但在另一項(xiàng)研究中，用siRNA轉(zhuǎn)染介導(dǎo)敲除NCI-H292 細(xì)胞系中的CLCA1 基因表達(dá)未能降低MUC5AC mRNA 或蛋白質(zhì)水平[22]，這兩種相互矛盾的觀點(diǎn)使得CLCA1 和MUC5AC 之間的聯(lián)系更具探索性。另外，IL-13 也可通過(guò)驅(qū)動(dòng)氣道上皮細(xì)胞CLCA1 過(guò)表達(dá)激活涉及MAPK13 的信號(hào)級(jí)聯(lián)，有效促進(jìn)哮喘黏液分泌?？傊?，在哮喘氣道重塑過(guò)程中CLCA1 通過(guò)IL-9、IL-13 等細(xì)胞因子啟動(dòng)一系列機(jī)制來(lái)參與MUC5AC 的表達(dá)和隨之而來(lái)的黏液分泌。

4.1.2 囊性纖維化（cystic fibrosis，CF）CF 在肺部通常表現(xiàn)為慢性梗阻性病變。它由囊性纖維化跨膜電導(dǎo)調(diào)節(jié)因子（cystic fibrosis transmembrane conductance regulator，CFTR）基因突變引起。CFTR 的突變會(huì)擾亂正常的氯離子轉(zhuǎn)運(yùn)，導(dǎo)致黏液鹽分不足和水分不足。

CLCA1 和CFTR 的組織表達(dá)譜有重疊，表明這兩個(gè)基因可能同時(shí)參與CF 的發(fā)病過(guò)程[23]。在CFTR 缺陷小鼠中發(fā)現(xiàn)的致命性腸道疾病可以通過(guò)上調(diào)CLCA1的表達(dá)來(lái)糾正。當(dāng)CF 患者發(fā)生伴隨強(qiáng)烈炎癥反應(yīng)的持續(xù)性氣道表面感染時(shí)，支氣管黏膜中IL-9 及其受體IL-9R 和CLCA1 的表達(dá)增加[6]，以類似于哮喘的方式，驅(qū)動(dòng)修復(fù)氣道上皮損傷的IL-9 杯狀細(xì)胞增生通路。

4.1.3 COPD COPD 以杯狀細(xì)胞增生和黏液過(guò)度分泌為特征。CLCA1 在COPD 患者氣道內(nèi)表達(dá)顯著增加[24]。如前所述，CLCA1 通過(guò)啟動(dòng)MAPK 信號(hào)通路來(lái)表達(dá)黏液蛋白，在COPD 患者中這一通路高度激活，成為阻塞性黏液產(chǎn)生的主要來(lái)源。

4.2 CLCA1 在消化系統(tǒng)中的作用

腸道黏液通過(guò)潤(rùn)滑和限制上皮與寄生在腸道的細(xì)菌之間的接觸來(lái)保護(hù)黏液層下面的上皮。黏蛋白2（mucins 2，MUC2）提供腸道黏液的結(jié)構(gòu)骨架，MUC2分泌后可形成類似網(wǎng)狀的片狀結(jié)構(gòu)堆積在一起，形成一種能夠阻止細(xì)菌穿透的篩分黏液結(jié)構(gòu)網(wǎng)。

在腸道分泌的黏液中，CLCA1 沿著腸軸具有類似于MUC2 的黏液結(jié)構(gòu)表達(dá)模式，由于它的N 端裂解產(chǎn)物中含有一個(gè)具有金屬離子依賴性黏附位點(diǎn)的vWA 結(jié)構(gòu)域，CLCA1 可作為腸黏液中的一種內(nèi)源性金屬蛋白酶水解處理MUC2，成為腸黏液加工的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子之一。

4.2.1 潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）UC 是由黏液結(jié)構(gòu)破壞、腸上皮屏障功能持續(xù)失調(diào)引起的一種結(jié)腸黏膜炎癥性疾病。UC 患者結(jié)腸上皮細(xì)胞培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)CLCA1 表達(dá)顯著下調(diào)[25]，CLCA1 表達(dá)的降低可能影響腸道黏液加工，破壞黏液屏障功能而導(dǎo)致UC 的發(fā)生。

4.2.2 囊性纖維性腸黏液病 在囊性纖維化患者中可觀察到腸道黏液停滯梗阻。在CF 模型中，CLCA1 的轉(zhuǎn)基因修復(fù)降低了其在小腸中的表達(dá)，改善了黏液阻塞的表型。另外，在囊性纖維化患者中，CLCA1 變異也與胎糞性腸梗阻有關(guān)[26]。

4.3 CLCA1 在癌癥中的作用

人和動(dòng)物體內(nèi)的離子通道通過(guò)影響細(xì)胞體積、細(xì)胞內(nèi)pH 值、信號(hào)分子的產(chǎn)生以及蛋白激酶和磷酸酶的活性而參與腫瘤發(fā)生發(fā)展進(jìn)程。因此，在上皮細(xì)胞的離子傳導(dǎo)過(guò)程中具有重要意義的CLCA 家族在腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移中同樣發(fā)揮著獨(dú)特的作用。CLCA1 的轉(zhuǎn)錄還被證明與原癌基因c-myc 的轉(zhuǎn)錄持續(xù)相關(guān)[27]。

4.3.1 CLCA1 在結(jié)直腸癌中的作用 絕大多數(shù)結(jié)直腸癌患者是由控制β-連環(huán)蛋白降解的APC 基因失活突變?cè)斐傻?，這兩個(gè)基因都參與Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路。Wnt 信號(hào)異常激活導(dǎo)致β-連環(huán)蛋白在細(xì)胞質(zhì)中積累和核轉(zhuǎn)位，這是癌細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制。

體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CLCA1 表達(dá)上調(diào)可能抑制Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）過(guò)程[28]，已知異常的Wnt 信號(hào)可以觸發(fā)EMT 過(guò)程，這在癌癥轉(zhuǎn)移中也起著至關(guān)重要的作用。在EMT 過(guò)程中，上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為間充質(zhì)細(xì)胞，失去細(xì)胞間的黏附性和細(xì)胞極性，獲得遷移和侵襲性，揭示了CLCA1 能夠調(diào)節(jié)Wnt/β-連環(huán)蛋白驅(qū)動(dòng)的腸細(xì)胞自發(fā)分化的機(jī)制。CLCA1 可能參與控制結(jié)直腸上皮細(xì)胞的增殖與分化，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，從而在結(jié)直腸癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移中起到抑制作用。

利用人腸癌細(xì)胞系（Caco-2）發(fā)現(xiàn)CLCA1 是腸癌細(xì)胞和腸道組織從增殖到分化的調(diào)節(jié)因子，CLCA1通過(guò)增強(qiáng)黏附分子E-cadherin 和腸堿性磷酸酶的表達(dá)促進(jìn)腸上皮分化[29]。細(xì)胞從增殖到分化的轉(zhuǎn)變可能是由包括E-cadherin 介導(dǎo)的細(xì)胞-細(xì)胞黏附在內(nèi)的特定生化事件觸發(fā)的。在結(jié)直腸癌中，E-cadherin 在高侵襲性低分化癌中的表達(dá)常被下調(diào)，因此通過(guò)上調(diào)CLCA1 來(lái)增加E-cadherin 的表達(dá)可能促進(jìn)細(xì)胞分化，降低癌組織的惡性程度。

基于以上理論可推測(cè)，提高CLCA1 的表達(dá)在結(jié)直腸癌的發(fā)生轉(zhuǎn)移和惡性程度的控制中起重要作用。CLCA1 在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)低于癌旁正常組織，血清和組織中CLCA1 水平與結(jié)直腸癌組織學(xué)分級(jí)、轉(zhuǎn)移和腫瘤分期呈負(fù)相關(guān)。

4.3.2 CLCA1 在卵巢癌中的作用 卵巢癌的腹腔轉(zhuǎn)移主要依靠多細(xì)胞聚集物（multicellular aggregates，MCAs），CLCA1 對(duì)細(xì)胞聚集有影響，其在MCAs 形成過(guò)程中顯著升高，使用siRNA 敲除CLCA1 降低了癌細(xì)胞形成MCAs 的能力。蛋白質(zhì)組學(xué)分析顯示，CLCA1 在卵巢癌細(xì)胞系（OV-90）中表達(dá)增加[8]。

4.3.3 CLCA1 在胰腺癌中的作用 基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)現(xiàn)，CLCA1 在胰腺癌中是一種潛在的腫瘤抑制因子，其表達(dá)水平與患者生存期呈負(fù)相關(guān)[30]。CLCA1在正常的胰腺中不表達(dá)，但它存在于超過(guò)一半的胰腺癌組織中[10]，并可分泌到胰腺囊腫液和血流中。因此，CLCA1 可作為胰腺癌的備選生物標(biāo)志物。

4.4 CLCA1 與骨癌痛

骨癌痛是原發(fā)性骨腫瘤或晚期侵襲性腫瘤引起的一種嚴(yán)重的并發(fā)癥。眾所周知，脊髓背角是外周感覺信號(hào)整合和中樞痛覺超敏反應(yīng)神經(jīng)環(huán)路信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵部位。在前期的高通量基因測(cè)序工作中，檢測(cè)到CLCA1 在小鼠骨癌痛模型中脊髓背角層面的表達(dá)下降約60%。據(jù)此，圍繞CLCA1 是否參與骨癌痛的發(fā)生發(fā)展而展開的一系列工作正在進(jìn)行中。

5 總結(jié)與展望

CLCA1 通過(guò)發(fā)揮金屬蛋白酶及氯離子通道調(diào)節(jié)作用，參與調(diào)控上皮細(xì)胞內(nèi)陰離子的傳導(dǎo)從而影響?zhàn)ひ悍置?、電解質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、信號(hào)通路傳導(dǎo)、細(xì)胞增殖與分化等生理及病理過(guò)程，而成為相關(guān)疾病的重要潛在靶點(diǎn)和標(biāo)志物。然而，CLCA1 基因的發(fā)現(xiàn)到目前為止不過(guò)二十余年，關(guān)于它的研究?jī)H局限在上述幾類疾病中，在其他病理狀態(tài)例如骨癌痛中CLCA1 是否發(fā)揮作用，尚待更深入和完善的研究。目前，針對(duì)CLCA1 而衍生的相關(guān)疾病治療手段和臨床藥物正處于缺乏階段。因此，面對(duì)這一空缺，在未來(lái)針對(duì)相關(guān)疾病的藥物發(fā)掘和探索中，CLCA1 具備十分重要的研究?jī)r(jià)值。