姚澤欣綜述，張 冰，王潔嫻，程 飚審校

0 引 言

濃縮血小板(platelet-rich plasma, PRP)是指自體全血通過離心的方法提取出的血小板濃縮物，含有高濃度的血小板、白細(xì)胞及大量蛋白。PRP制品主要以富血小板血漿、(富)血小板凝膠(platelet-rich gel, PRG)和血小板裂解液(platelet lysate,PL)等多種形式存在。在20世紀(jì)80年代之前，有關(guān)PRP的研究主要集中在血液病或凝血系統(tǒng)等血液學(xué)領(lǐng)域。此后20年里，血小板中的生長(zhǎng)因子被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)。高濃度血小板濃縮液中的生長(zhǎng)因子釋放至局部損傷組織時(shí)，可顯著促進(jìn)修復(fù)細(xì)胞的增殖、分化與遷移，加速細(xì)胞外基質(zhì)合成，促進(jìn)局部血管再生和建立有效的微循環(huán)系統(tǒng)。多種生長(zhǎng)因子的發(fā)現(xiàn)掀起了研究血小板與生長(zhǎng)因子的熱潮。近年來，隨著理化分析技術(shù)的不斷進(jìn)步，人們對(duì)血小板的結(jié)構(gòu)及功能的認(rèn)知有了新突破，PRP在臨床的應(yīng)用范圍逐漸擴(kuò)大，應(yīng)用方式也越來越多樣化。

隨著對(duì)PRP的深入研究和臨床應(yīng)用的廣泛開展，市面上出現(xiàn)了多種不同性狀的PRP制品，也隨之出現(xiàn)了不同的命名方式和分類體系。名稱的多樣性表明不同名稱的PRP產(chǎn)品性狀可能不同，修復(fù)組織的功效也有所區(qū)別，但繁多的命名方式也造成了該領(lǐng)域血液制品分類混亂的現(xiàn)象，給廣大醫(yī)務(wù)人員造成困惑。因此，本文主要就PRP應(yīng)用的發(fā)展和分類作一綜述，旨在匯總現(xiàn)階段血小板的分類與臨床應(yīng)用，為臨床和科研工作理清思路，提供參考。

1 PRP的研究進(jìn)展

1.1 結(jié)構(gòu)與功能PRP最早來源于輸血醫(yī)學(xué)，一直沿用至今。最初人們一直認(rèn)為血小板只在血液系統(tǒng)里發(fā)揮凝血相關(guān)的作用，因此僅用于治療血小板減少癥。直到1987年，Witte等[1]將血小板中釋放出來并可促進(jìn)細(xì)胞增殖的生長(zhǎng)因子命名為血小板源性生長(zhǎng)因子(platelet-derived growth factor, PDGF)，指出生長(zhǎng)因子并非儲(chǔ)存在血小板的致密顆粒里，而是可能儲(chǔ)存在血小板的α顆粒里。生長(zhǎng)因子的發(fā)現(xiàn)揭示了血小板不僅具有凝血功能，而且高濃度的血小板還能分泌多種生長(zhǎng)因子，具有加速止血，加強(qiáng)創(chuàng)面愈合等功效。迄今為止，血小板中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有30余種生物活性因子和纖維蛋白，其中多種因子在止血或組織愈合中起著重要作用[2]，這一發(fā)現(xiàn)開啟了PRP在臨床組織修復(fù)的新時(shí)代。

PRP的數(shù)量和功能與PRP激活后釋放生長(zhǎng)因子的類型及數(shù)量有關(guān)，常見的生長(zhǎng)因子有PDGF(a-b)，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transforming growth factor, TGF)，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)，表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor, EGF)，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(fibroblast growth factor, FGF)，結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(connective tissue growth factor CTGF)和胰島素樣生長(zhǎng)因子(insulin like growth factor-1,IGF-1)，但血小板數(shù)量和生長(zhǎng)因子濃度之間并非呈簡(jiǎn)單的正相關(guān)關(guān)系。研究表明，血小板被凝血酶激活之后釋放出有活性的細(xì)胞因子，與間充質(zhì)干細(xì)胞、成骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和表皮細(xì)胞等靶細(xì)胞的跨膜蛋白受體結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)蛋白，引起基因序列的表達(dá)，指導(dǎo)細(xì)胞增殖、基質(zhì)形成、類骨生成、膠原合成等，從而促進(jìn)組織修復(fù)和組織再生[3-4]。

1.2 臨床研究與應(yīng)用隨著對(duì)PRP機(jī)制和應(yīng)用的進(jìn)一步研究，PRP已被廣泛應(yīng)用于心臟外科、眼科、口腔頜面外科、心血管外科、整形美容外科、骨科、神經(jīng)外科、婦產(chǎn)科及泌尿外科等諸多領(lǐng)域[5-8]，并在多種難治性疾病的治療中取得了較多成果，證實(shí)PRP有促進(jìn)修復(fù)組織的作用。

PRP目前在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的臨床應(yīng)用最為廣泛，包括促進(jìn)傷口愈合，治療脫發(fā)，改善皮膚狀態(tài)和修復(fù)肌肉骨骼[9-11]。PRP在傷口愈合的臨床應(yīng)用已經(jīng)被多項(xiàng)研究所證實(shí)。Feng等[12]使用富血小板血漿凝膠治療76名慢性傷口患者并進(jìn)行隨訪，結(jié)果表明傷口愈合情況良好，提示富血小板血漿凝膠在治療慢性傷口方面具有安全性高、繼發(fā)性損傷少等優(yōu)勢(shì)。Shao等[13]在研究中提出PRP的應(yīng)用作為治療糖尿病足潰瘍的輔助療法具有廣闊遠(yuǎn)景。Jason等[14]總結(jié)了PRP在皮膚病學(xué)中的應(yīng)用，認(rèn)為 PRP中含有的生長(zhǎng)因子具有促進(jìn)干細(xì)胞的新膠原發(fā)生，血管生成和增殖以及軟組織重塑等功能，在治療脫發(fā)，美容以及改善痤瘡疤痕等方面具有發(fā)展前景。PRP與激光治療，微針，皮膚填充劑和自體脂肪注射等其他治療方式相結(jié)合已顯示出協(xié)同作用，可增強(qiáng)整體美容效果。Chou等[15]討論了PRP在頜面再生方面的應(yīng)用，并認(rèn)為其有望在口腔頜面外科，牙周外科，整形外科和運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)中得到應(yīng)用。Davood等[16]探究了PRP在肌肉骨骼病變治療中的應(yīng)用，結(jié)果表明PRP可緩解疼痛并改善關(guān)節(jié)功能，在肌肉骨骼疾病的治療中得到越來越多的應(yīng)用。

近年來，PRP在生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有了新的應(yīng)用與發(fā)展。Zadehmodarres等[17]對(duì)10例因子宮內(nèi)膜生長(zhǎng)不良而有冷凍解凍胚胎移植(frozen-thawed embryo transfer, FET)取消史的患者給予了PRP治療。給藥后10例患者均表現(xiàn)為子宮內(nèi)膜厚度高于7 mm，5例在FET后懷孕。一次妊娠以流產(chǎn)告終，四次妊娠持續(xù)妊娠，結(jié)果表明PRP可有效誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜發(fā)育。Konstantinos等[18]分別對(duì)患有卵巢發(fā)育不良、卵巢早衰、圍絕經(jīng)期和更年期的四類患者進(jìn)行了PRP治療并觀察相應(yīng)激素水平。結(jié)果表明，PRP卵巢內(nèi)輸注可有效促進(jìn)卵泡生成，恢復(fù)卵巢功能，提高激素水平。一項(xiàng)關(guān)于勃起功能障礙的動(dòng)物模型數(shù)據(jù)研究表明，在大鼠海綿狀神經(jīng)損傷后，局部注射PRP可增效勃起功能的恢復(fù)[16]。Wu等[19]一項(xiàng)嚙齒動(dòng)物研究亦表明，通過孔內(nèi)壓力和免疫熒光神經(jīng)染色測(cè)量，經(jīng)血小板源性生長(zhǎng)因子濃度優(yōu)化的PRP可改善勃起功能。

由于活化的血小板可以釋放抗炎介質(zhì)，在臨床上可用于與慢性疼痛相關(guān)的各種臨床病理狀況等方面，如運(yùn)動(dòng)損傷，骨科病變，脊柱疾病和復(fù)雜的慢性傷口，起到減輕炎癥和疼痛的作用[20]。在研究神經(jīng)性疼痛是否會(huì)因PRP促進(jìn)軸突再生和靶向再神經(jīng)支配而減輕或消退時(shí)，發(fā)現(xiàn)PRP在緩解輕度至重度慢性神經(jīng)性疼痛(繼發(fā)于受損的非再生神經(jīng))患者的疼痛方面的潛力。在接受治療的患者中，所有患者在PRP手術(shù)后三周內(nèi)疼痛開始減輕，神經(jīng)性疼痛在手術(shù)后至少6年內(nèi)仍然消除或減輕。Koji等[22]回顧了PRP治療退化腰間盤對(duì)椎間盤性腰痛患者的研究并對(duì)其影響進(jìn)行了臨床研究評(píng)估，所有研究均報(bào)道PRP在減輕背痛方面是安全有效的。血小板還可分泌多種具有天然免疫活性的多肽類物質(zhì), 被命名為血小板源性抗菌肽 (platelet-derived antibacterial peptides, PDAPs) ，在炎癥調(diào)節(jié)、殺菌、抗腫瘤和治療膿毒血癥等多方面都具有重要的作用[23]。

盡管PRP在臨床的功效和應(yīng)用得到了越來越多研究的證實(shí)，但是由于臨床使用的PRP制備方法尚未標(biāo)準(zhǔn)化，個(gè)體差異化較大，并且來自臨床研究的數(shù)據(jù)十分有限，導(dǎo)致研究結(jié)果存在局限性。因此，人們迫切需要在細(xì)胞和分子水平上進(jìn)行基礎(chǔ)研究，以提高對(duì)PRP作用模式的了解，同時(shí)嚴(yán)密設(shè)計(jì)臨床應(yīng)用研究方案，以便更好地了解和應(yīng)用。

2 PRP的分類

2.1 激活PRP再生特性是基于血小板活化時(shí)生物活性蛋白的產(chǎn)生和釋放，包括多種生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子。長(zhǎng)期以來，根據(jù)PRP的激活狀態(tài)一般可將其分為兩類，即未激活的PRP和激活的PRP。2018年，國(guó)際血栓與止血學(xué)會(huì)(International society on thrombosis and haemostasis, ISTH)在科學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(Scientific standardization committee, SSC)會(huì)議上對(duì)血小板在再生醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用和新分類系統(tǒng)提出建議，將PRP根據(jù)激活狀態(tài)擴(kuò)展為三種：無(wú)激活劑的PRP、激活的PRP和凍融的PRP[24]。未激活PRP包括血小板、白細(xì)胞、纖維蛋白原和血漿內(nèi)多種蛋白，而激活后的PRP則包含更多分子成分。Xu等[25]和Barrientos等[26]的研究表明，激活的PRP在促進(jìn)細(xì)胞增殖，加快創(chuàng)面愈合等方面均優(yōu)于未激活的PRP。激活方法、激活時(shí)間以及激活時(shí)機(jī)對(duì)PRP的狀態(tài)均有一定影響[24]。PRP的激活方式有許多種，如加入氯化鈣和(或)凝血酶，直接暴露于體內(nèi)的膠原，進(jìn)行冷凍-解凍處理、電處理、聲波處理以及光處理等[20]。激活方式及激活劑的劑量不同，獲得的生物活性成分也不盡相同[27]。楊域等[28]研究證實(shí)，凝血酶和鈣離子激活PRP后對(duì)血小板凝膠形成、生長(zhǎng)因子及微囊泡釋放的作用有顯著性差異。通過加入不同種類和劑量的激活劑來調(diào)整PRP釋放活性物質(zhì)的種類和濃度，可滿足不同的臨床治療需求。富含血小板的纖維蛋白(platelet-rich fibrin, PRF)是PRP提取的最新發(fā)展，無(wú)需對(duì)血液進(jìn)行任何生化修飾，即不需要抗凝劑，凝血酶或氯化鈣。迄今為止，這種技術(shù)是最簡(jiǎn)單，也是最經(jīng)濟(jì)的[29]。

2.2 離心血小板濃縮制品的制備方法各異，共同之處在于將血漿進(jìn)行離心處理以富集血小板，但離心方法并無(wú)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，常見的離心方法有一次離心法，二次離心法和三次離心法。不同文獻(xiàn)對(duì)于PRP制備過程中的離心速度和離心時(shí)間差異較大，Slitcher等[30]早在1976年提出的兩次離心方案為第一次以1000×g離心9 min，第二次以3000×g離心20 min。同年，Kahn等[31]則是以3800 rpm的轉(zhuǎn)速單次離心4 min以獲得PRP。隨著PRP在臨床的廣泛應(yīng)用，對(duì)PRP制備技術(shù)的研究也逐漸增多，離心力和離心時(shí)間更是不盡相同，Croise等[32]統(tǒng)計(jì)了2007年至2018年發(fā)表的所有關(guān)于PRP制備的文獻(xiàn)，探究不同離心方法和條件對(duì)血小板濃度和(或)生長(zhǎng)因子釋放率的影響。盡管多種條件都能提高血小板濃度并且達(dá)到治療效果，但離心力過強(qiáng)或離心時(shí)間過長(zhǎng)時(shí)，血小板可能面臨被破壞甚至失效的風(fēng)險(xiǎn)。由于使用設(shè)備及制備條件的不同，即使在轉(zhuǎn)數(shù)和離心時(shí)間相同的情況下，離心半徑的變化也會(huì)導(dǎo)致離心力隨之改變，因此在制備血小板濃縮制品時(shí)應(yīng)該標(biāo)明離心力。Choukroun與Dohan在2006年提出的PRF在制備過程中只需一次離心且不需要添加任何外來物質(zhì)，被稱為“第二代PRP”(針對(duì)PRP為第一代PRP而言)[33-37]。在2006年由Sacoo等[38]提出的濃縮生長(zhǎng)因子(concentrated growth factors, CGF)是通過特制的不間斷變速離心機(jī)自動(dòng)加速和減速離心后提取而成，根據(jù)選用的離心管不同，CGF可制成液態(tài)、凝膠態(tài)和松散凝膠態(tài)，滿足不同的臨床需求。近年來，部分文獻(xiàn)認(rèn)為CGF在生長(zhǎng)因子濃度方面優(yōu)于PRP和PRF，且CGF中富含有較高濃度的CD34+細(xì)胞，生物學(xué)效應(yīng)更加高效，并稱之為“第三代PRP”。但實(shí)際上這些PRP制品各有優(yōu)缺，三者之間除在開發(fā)時(shí)間節(jié)點(diǎn)上存在先后順序外，彼此之間的優(yōu)劣并未涇渭分明。因此，筆者認(rèn)為將PRP、PRF、CGF進(jìn)行斷代具有一定的局限性，不如將其均視為PRP發(fā)展進(jìn)程中的重要形式，供臨床醫(yī)師各取所需開展研究與治療。

2.3 白細(xì)胞濃度全血經(jīng)第一次離心后可分為三層：紅細(xì)胞(RBCs)，緩沖層(buffy coat, BC)和貧血小板血漿(platelet-poor plasma, PPP)。BC通常呈白色，包含大部分的血小板和白細(xì)胞，又稱為白膜層。有文獻(xiàn)認(rèn)為，分離白細(xì)胞后的PRP可減少微聚物的形成，有利于降低PRP輸注后的栓塞發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)和非溶血性輸血反應(yīng)的發(fā)生[39-40]。然而，有研究指出白細(xì)胞在PRP中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，包括抗感染和免疫調(diào)節(jié)作用[41-44]。此外，白細(xì)胞還能產(chǎn)生大量的VEGF[45-46]。血小板中含有相似數(shù)量的血管生成刺激物(如VEGF和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子)和抑制劑(如內(nèi)皮抑素和血小板反應(yīng)蛋白-1)[47]，白細(xì)胞來源的VEGF對(duì)于促進(jìn)血管生成可能至關(guān)重要。因此，Dohan等[29]在2009年提出了按照白細(xì)胞含量和纖維蛋白密度對(duì)PRP進(jìn)行分類的方法。根據(jù)纖維蛋白密度的不同，可將PRP分為PRP和PRF；根據(jù)白細(xì)胞的含量進(jìn)一步分為低濃度白細(xì)胞的貧白細(xì)胞PRP(pure platelet-rich plasma, P-PRP)和貧白細(xì)胞PRF(pure platelet-rich fibrin, P-PRF)，以及高濃度白細(xì)胞的富白細(xì)胞PRP(leukocyte- and platelet-rich plasma, L-PRP)和富白細(xì)胞PRF(leukocyte- and platelet-rich fibrin, L-PRF)。P-PRP是不含白細(xì)胞且激活后具有低密度纖維蛋白網(wǎng)絡(luò)的PRP制劑，最早是作為輸注血小板的附加應(yīng)用而開發(fā)的，后來廣泛應(yīng)用于臨床的多個(gè)學(xué)科，促進(jìn)多種組織的修復(fù)和再生。P-PRF同樣不含白細(xì)胞，但激活后具有高密度的纖維蛋白。這些制品僅以活化的凝膠形式存在，不能像傳統(tǒng)的纖維蛋白膠一樣注射或使用。L-PRP含有高濃度的白細(xì)胞和低密度的纖維蛋白，類似于纖維蛋白凝膠但溶解迅速。開發(fā)制備L-PRP方法的最初目的是在沒有輸血實(shí)驗(yàn)室支持的情況下可以在日常實(shí)踐中使用PRP，因此，在L-PRP的制備方案中，血小板和白細(xì)胞通?？杀挥行占捅４?，但結(jié)果的重現(xiàn)率并不理想，往往會(huì)導(dǎo)致所使用的PRP成分不清楚。L-PRF被認(rèn)為是第二代血小板濃縮物[48]，其在制備過程中無(wú)需添加任何抗凝血?jiǎng)┗蚰z劑，在低速離心過程中觸發(fā)血小板活化和纖維蛋白聚合而產(chǎn)生PRF凝塊[49]。PRF凝塊以纖維蛋白將大部分血小板和白細(xì)胞高效收集固定，且不易溶解，可如天然血凝塊一般緩慢重塑，具有成本低，操作簡(jiǎn)便，可大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)勢(shì)，已被法國(guó)、意大利和以色列等國(guó)家列為主要技術(shù)[43]。

2.4 多指標(biāo)分類按照白細(xì)胞含量和纖維蛋白密度的分類方式為PRP多指標(biāo)分類提供了思路。Delong等[50]在2012年提出了PAW分類系統(tǒng)，P代表血小板的絕對(duì)數(shù)量，A代表血小板激活方式，W代表白細(xì)胞濃度高低。PAW系統(tǒng)相對(duì)Dohan系統(tǒng)，除白細(xì)胞濃度之外，還強(qiáng)調(diào)了血小板的絕對(duì)數(shù)量和激活方式。Mautner等[51]基于前兩者的分類系統(tǒng)，加入紅細(xì)胞的指標(biāo)，在2015年提出了PLRA分類系統(tǒng)，P(Platelet)代表血小板濃度，L(Leukocyte)代表白細(xì)胞濃度，R(Red blood cells)代表紅細(xì)胞濃度，A(Activation)代表激活。2016年，Magalon等[52]提出了一個(gè)更全面的DEPA分類，D(Dose)代表劑量，E(Efficient)代表效率，P(Purity)代表純度，A(Activation)代表活化。這種分類方式基于四個(gè)不同的參數(shù)，對(duì)全血和最終的PRP制品進(jìn)行全面質(zhì)控評(píng)估。但這一分類并未考慮到，未激活一類PRP臨床應(yīng)用時(shí)，活細(xì)胞注入帶來的一些影響。到了2017年，Lana等[53]加入更多指標(biāo)，提出MARSPILL分類系統(tǒng)，更加細(xì)化和完善了PRP制品的分類。M(Machine/Handmade)代表機(jī)器制備或手工制備，A(Activation)代表激活，R(Red blood cells)代表紅細(xì)胞，S(Spin)代表離心次數(shù)，P(Platelet)代表血小板，I(Image guidance)代表是否使用影像引導(dǎo)，L(Leukocyte)代表白細(xì)胞，L(Light activation)代表是否光激活。但這種方法，勢(shì)必受到限制，因?yàn)樵谘“寤罨矫妫延忻}沖電場(chǎng)、超聲等更多方式出現(xiàn)。

2018年，國(guó)際血栓與止血學(xué)會(huì)(ISTH)在科學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(SSC)會(huì)議上，將血小板是否激活，樣本中血小板的計(jì)數(shù)范圍和制備方法作為分類標(biāo)準(zhǔn)，制定了一系列統(tǒng)一的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)并規(guī)范了血小板在再生醫(yī)學(xué)中的使用[54]。ISTH分類是迄今為止較全面的分類之一。有研究在2019年提出PRP制品的命名應(yīng)考慮其變量，如血小板、白細(xì)胞、紅細(xì)胞等，甚至將激活、破裂情況也納入變量計(jì)算之中，這將使不同組間結(jié)果比較成為可能，且對(duì)于質(zhì)量評(píng)估和注意事項(xiàng)十分重要[55]。2020年，有研究提出了以代碼的形式來表征PRP相關(guān)參數(shù)的新型分類方法，用6位代碼(N1N2-N3N4-N5N6)表示[56]。6位序列中的每個(gè)數(shù)字代表一個(gè)特定變量：N1(血液中的基本血小板濃度，如1=100,000-200,000血小板/μL)、N2(PRP中的血小板濃度，如1=100,000-200,000血小板/μL)、N3(PRP中的紅細(xì)胞濃度，0=紅細(xì)胞數(shù)量<1×106/μL，1 = 紅細(xì)胞數(shù)量>1×106/μL)、N4(PRP中的白細(xì)胞濃度，如0=低于基本水平，1 = 1-2倍基本水平)、N5(外部激活，0=未激活，1=激活)和N6(鈣添加，0=未添加，1=添加)，旨在快速識(shí)別并給出每個(gè)研究中使用的PRP類型。

3 結(jié) 語(yǔ)

綜上所述，經(jīng)過多年的基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用，PRP修復(fù)組織的機(jī)理研究和應(yīng)用都取得了巨大的進(jìn)展，新的適應(yīng)證也仍在被持續(xù)發(fā)現(xiàn)和研究。但PRP的應(yīng)用仍存在較多爭(zhēng)議，主要原因在于PRP制品的多樣性或異質(zhì)性。隨著PRP應(yīng)用的深入發(fā)展，越來越多的結(jié)構(gòu)和功能在不斷增加血小板的命名難度。分類系統(tǒng)的出現(xiàn)，一定程度上解決了不同研究數(shù)據(jù)間無(wú)法比較的問題，為將來臨床根據(jù)不同組織、不同治療目的確定使用何種亞型PRP制品提供數(shù)據(jù)方案，有助于進(jìn)一步推動(dòng)PRP的研究和發(fā)展。