姜婉婷 楊 楠 陳 晨 郭曉瑞 唐中華 王洪政*

（1. 東北林業(yè)大學(xué)化學(xué)化工與資源利用學(xué)院，哈爾濱 150040；2. 東北林業(yè)大學(xué)森林植物生態(tài)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150040）

硒（selenium，Se）是人和動(dòng)物必需的微量元素，而植物體在自然界Se 循環(huán)轉(zhuǎn)化等方面具有重要作用，使得近年來植物Se 研究領(lǐng)域也受到普遍關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，Se是植物的非必需有益元素，低質(zhì)量濃度的Se（≤5 mg·L-1）可以促進(jìn)植物的生長，提高植物在逆境下的光合能力，增加植物中Se 的含量，提高其產(chǎn)量和品質(zhì)［1］。在Se 的生理濃度范圍內(nèi)，Se 還可以促進(jìn)植物對(duì)土壤中其他礦質(zhì)元素的吸收［2］，同時(shí)，Se還可以拮抗重金屬［3］。但是，高濃度的Se 則會(huì)對(duì)植物產(chǎn)生毒害作用，主要包括葉片萎黃、植物總生物量減少和光合效率降低［4］。目前，Se 脅迫對(duì)植物生長生理水平的影響已得到較好的表征，如：李登超等［5］研究發(fā)現(xiàn)低質(zhì)量濃度的Se（≤1.0 mg·L-1）會(huì)促進(jìn)小白菜（Brassica.campestrisssp.chinensis）的生長，增加其生物量，而高質(zhì)量濃度的Se（≥2.5 mg·L-1）則會(huì)抑制其生長；Cabral 等［6］對(duì)水稻（Oryza sativa）施加Na2SeO3的研究發(fā)現(xiàn)，高濃度的Se處理明顯增強(qiáng)了水稻抗氧化酶系統(tǒng)的活性，但Se 對(duì)植物在代謝水平影響的報(bào)道較少。植物代謝物的研究可以準(zhǔn)確反映植物在不同生長時(shí)期或受到某種刺激前后的小分子代謝產(chǎn)物的變化，從而得到植物在特定狀態(tài)下代謝規(guī)律的變化。研究植物在不同濃度Se 處理下的代謝變化，對(duì)于揭示植物在面對(duì)低/高Se 時(shí)做出不同反應(yīng)的機(jī)制具有重要意義。

斜莖黃芪（Astragalus adsurgens）是豆科（Legu?minosae）黃芪屬（Astragalus）多年生草本植物，其適應(yīng)性強(qiáng)，產(chǎn)量高、品質(zhì)好、營養(yǎng)豐富［7］，同時(shí)它生物量大，根系發(fā)達(dá)，抗干旱和病蟲害能力強(qiáng)，對(duì)Se具有較高的耐性和富集能力，在加拿大發(fā)現(xiàn)斜莖黃芪Se 積累量高達(dá)44 mg·kg-1［8］。在本研究以斜莖黃芪為試驗(yàn)材料，在水培條件下研究不同濃度Se 處理對(duì)其生長形態(tài)、光合參數(shù)以及初生代謝物質(zhì)等的影響，以期在代謝水平上探討硒富集植物對(duì)Se的響應(yīng)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

斜莖黃芪種子購買自河北省安國市元泰藥用植物種子站。色譜級(jí)甲醇、乙腈購于北京百靈威化學(xué)有限公司，去離子水（電阻率高于18.2 MΩ·cm-1）取 自Milli-Q 水 純 化 系 統(tǒng)（Millipore，USA）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)及Se處理過程

精選出籽粒飽滿、均勻的黃芪種子，用體積分?jǐn)?shù)10%次氯酸鈉溶液浸泡15 min 后，再用蒸餾水沖洗4～5 次以進(jìn)行表面消毒。消毒后的種子在蒸餾水中吸脹24 h 后播種到濕潤的蛭石中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中培養(yǎng)容器下部始終浸沒在1/2強(qiáng)度的MS 營養(yǎng)液中。培養(yǎng)條件：每天保持14 h 光照，溫度30 ℃（晝）/25 ℃（夜），相對(duì)濕度保持在70%左右。

幼苗出土3 周后進(jìn)行Se 處理（Na2SeO3），共設(shè)置4 個(gè)處理質(zhì)量濃度：0（CK）、5、20、100 μmol·L-1。每處理設(shè)3 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)包括24 株幼苗。處理時(shí)長為4周，處理期間每4 d更換一次處理液。

1.2.2 生長指標(biāo)的測(cè)定

在處理結(jié)束后，將幼苗從培養(yǎng)容器中小心取出并用流水沖去培養(yǎng)介質(zhì)，然后使用直尺（1 mm）測(cè)量幼苗植株的株高和根長，并記錄數(shù)據(jù)。

1.2.3 光合參數(shù)的測(cè)定

光合色素的含量采用程貴文等［9］的方法。采用丙酮-無水乙醇混合液進(jìn)行光合色素浸提來測(cè)定斜莖黃芪幼苗第二葉序葉片的葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素和類胡蘿卜素的含量。葉片熒光參數(shù)參考Cen 等［10］的方法，采用便攜式調(diào)制葉綠素?zé)晒鈨x（PAM-2500，WALZ，Germinay）測(cè)定斜莖黃芪幼苗第三葉序葉片的葉綠素?zé)晒鈪?shù)。

1.2.4 幼苗Se元素含量測(cè)定

斜莖黃芪中Se 的含量參照馬月花等［11］的方法。用去離子水將斜莖黃芪根系和地上部分沖洗干凈后于80 ℃烘干。將烘干樣品磨碎后，準(zhǔn)確稱取0.300 g 放入消煮管中，并加入10 mL 硝酸-高氯酸混合液（V∶V=5∶1）進(jìn)行消煮。消煮結(jié)束后消煮管內(nèi)加入5 mL 體積分?jǐn)?shù)2%硝酸并溫浴后轉(zhuǎn)移至25 mL 容量瓶中，用體積分?jǐn)?shù)2%硝酸溶液進(jìn)行定容。

溶液樣品中Se元素的含量使用電感耦合等離子發(fā)射光譜儀（ICP-OES Optima 8000）進(jìn)行測(cè)定，其具體含量由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出。

1.2.5 初生代謝產(chǎn)物分析

采用劉洋［12］的方法進(jìn)行測(cè)定。初生代謝產(chǎn)物經(jīng)衍生化后使用配備非極性DB-5 毛細(xì)管色譜柱（30 m×250 μm ID，J＆W Scientific，F(xiàn)olsom，CA）的Agilent 5975C 氣相色譜-質(zhì)譜儀（Agilent Technolo?gies，USA）進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)。高純氦氣被用作載氣，載氣流速1.0 mL·min-1。程序升溫：8 ℃·min-1，60～125 ℃；4 ℃·min-1，125～210 ℃；5 ℃·min-1，210～270 ℃；10 ℃·min-1，270～305 ℃，305 ℃維持3 min。進(jìn)樣口的溫度為260 ℃，EI 源溫度為260 ℃，電壓為-70 V。質(zhì)量掃描范圍：m/z50～600，延遲5 min開始采集，采集速度為20譜/s。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用IBM SPSS Statistics 19.0 進(jìn)行單因素方差分析，SIMCA-P14.1 進(jìn)行偏最小二乘法分析（PLSDA），通過KEGG 數(shù)據(jù)庫和MetaboAnalyst（http：//www.metaboanalyst.ca）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行代謝途徑的富集和篩選，并采用Simplot14.0 和Excel 軟件繪制圖表，R（www.r-project.org/）繪制氣泡圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同質(zhì)量濃度Se 處理對(duì)斜莖黃芪幼苗生長的影響

在水培體系中，不同濃度的Se 處理4 周對(duì)斜莖黃芪幼苗生長產(chǎn)生了不同的影響。從圖1 和圖2A 可以看出，與對(duì)照相比，5 μmol·L-1Se 處理顯著促進(jìn)了斜莖黃芪的生長，處理結(jié)束后其根長和株高分別比對(duì)照增加了30.3%和32.9%。與低濃度Se 處理相反，100 μmol·L-1Se 處理后斜莖黃芪株高明顯變矮，且植株底部葉片出現(xiàn)黃化萎蔫現(xiàn)象。與對(duì)照相比，100 μmol·L-1Se 處理下，斜莖黃芪株高和根長分別被抑制了73.2%和28.1%。通過根冠比數(shù)據(jù)（見圖2B）發(fā)現(xiàn)，不同濃度Se 處理對(duì)根系和地上部的影響沒有表現(xiàn)出明顯差異。鑒于20 μmol·L-1Se處理并未顯著影響斜莖黃芪幼苗根系和地上部的生長（見圖1，圖2：A～B），為了更好地研究外源Se供應(yīng)在斜莖黃芪中扮演“雙刃劍”的機(jī)制，我們?cè)谝韵略囼?yàn)中將Se 處理設(shè)置為0、5 和100 μmol·L-1。

圖1 不同濃度Se處理對(duì)斜莖黃芪形態(tài)的影響Fig.1 Effect of different Se treatments on the morphology of A.adsurgens seedlings

圖2 不同濃度Se處理對(duì)斜莖黃芪生長的影響不同小寫字母表示處理間差異顯著（P<0.05），下同F(xiàn)ig.2 Effect of different Se treatments on the growth of A.adsurgens seedlings Different lowercase letters indicate significant difference at P<0.05 lev?el，the same as below

2.2 不同質(zhì)量濃度Se 處理對(duì)斜莖黃芪幼苗Se 吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)的影響

隨著Se 處理濃度的升高，斜莖黃芪根系和地上部Se 含量均逐步升高，且均與處理濃度呈良好的線性關(guān)系（見圖3：A～B）。在相同處理濃度下，斜莖黃芪地上部Se 含量明顯低于根系，在不同濃度Se 處理中Se 的轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)均不高于0.20（見圖3C）。此外，隨著處理濃度的增加，根系中Se 向地上部轉(zhuǎn)運(yùn)的比例逐漸下降，100 μmol·L-1處 理 下Se 轉(zhuǎn) 運(yùn) 系 數(shù) 比5 μmol·L-1處 理 降 低 了83.5%。

圖3 斜莖黃芪幼苗對(duì)Se的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)Fig.3 The adsorption and translocation of Se in A.adsurgens seedlings

2.3 不同質(zhì)量濃度Se 處理對(duì)斜莖黃芪幼苗光合作用的影響

5 μmol·L-1Se 處理顯著增加了斜莖黃芪新生葉片中葉綠素a 和葉綠素b 的含量，其中葉綠素b含量比對(duì)照升高了30.6%（見圖4）。與低濃度Se處理不同，高濃度Se 處理下斜莖黃芪葉片中葉綠素a、葉綠素b 和類胡蘿卜素的含量均顯著下降，與對(duì)照相比，3 種色素含量分別降低了52.4%、32.9%和48.9%。

圖4 不同濃度Se處理對(duì)斜莖黃芪光合色素含量的影響Fig.4 Effects of Se treatments with different concentrations on the photosynthetic pigment content of A.adsurgens

通過測(cè)定不同濃度Se處理下葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)（見表1），發(fā)現(xiàn)5 μmol·L-1Se 處理下斜莖黃芪幼苗最小熒光值Fo、最大熒光值Fm以及最大量子產(chǎn)率Fv/Fm都出現(xiàn)了小幅下降，而PSⅡ?qū)嶋H的量子效率ΦPSⅡ和非光化學(xué)猝滅qN出現(xiàn)了小幅升高。在100 μmol·L-1Se處理下，最大量子產(chǎn)率Fv/Fm出現(xiàn)了顯著降低，非光化學(xué)猝滅qN則比對(duì)照升高了14.7%。

表1 Se處理對(duì)斜莖黃芪幼苗葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響Table 1 Effects of Se treatments on chlorophyll fluores‐cence parameters of A.adsurgens seedling

2.4 不同濃度Se處理對(duì)斜莖黃芪初生代謝的影響

我們對(duì)不同濃度Se處理后斜莖黃芪地上部和根系初級(jí)代謝產(chǎn)物物進(jìn)行檢測(cè)，通過比自帶的NIST 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行定性分析，最終共鑒定出101 種初生代謝產(chǎn)物。從圖5中可以看出，通過有監(jiān)督的偏最小二乘判別分析（PLS-DA）方法可以將每對(duì)處理組之間很好地分開。

圖5 斜莖黃芪初生代謝產(chǎn)物PLS-DA得分圖橫坐標(biāo)表示對(duì)X軸矩陣的解釋率，縱坐標(biāo)表示對(duì)Y軸矩陣的解釋率；A，C.0 μmol·L-1 vs 5 μmol·L-1；B、D.0 μmol·L-1 vs 100 μmol·L-1Fig.5 PLS-DA scores of primary metabolites of A.adsurgens Abscissa：Interpretation rate of the X matrix；Ordinate：The interpretation rate of the Y matrix；A，C.0 μmo·lL-1 vs 5 μmo·lL-1；B，D.0 μmo·lL-1 vs 100 μmo·lL-1

依據(jù)PLS-DA 模型分析的第一主成分變量投影重要度（VIP>1）結(jié)合t檢驗(yàn)的P值（P<0.05）對(duì)斜莖黃芪地上部和根系中不同質(zhì)量濃度Se處理間差異代謝物進(jìn)行篩選，篩選結(jié)果見表2。在不同處理濃度根系代謝物對(duì)比結(jié)果中，斜莖黃芪100 μmol·L-1Se 處理與對(duì)照組之間差異代謝物數(shù)量明顯多于5 μmol·L-1Se 處理，前者共篩選得到29 個(gè)差異代謝物，其中Se 處理引起上調(diào)的差異代謝物有23個(gè)，引起下調(diào)的差異代謝物有6 個(gè)；后者篩選得到的差異代謝物數(shù)量僅為前者的51.7%。與根系結(jié)果不同，5 μmol·L-1Se處理與對(duì)照地上部間篩選得到的差異代謝物數(shù)量稍高于100 μmol·L-1。此外，我們發(fā)現(xiàn)在所有處理和部位中，Se 處理引起上調(diào)的差異代謝物數(shù)量均大大高于下調(diào)代謝物。

表2 不同濃度Se 處理下斜莖黃芪地上部和根部差異代謝物的數(shù)量Table 2 The amount of different metabolites in the shoots and roots of A. adsurgens under different concentrations of Se

將斜莖黃芪不同組織部位以及不同濃度Se處理間篩選出的差異化合物導(dǎo)入到KEGG 代謝通路中，分析后發(fā)現(xiàn)5 μmol·L-1處理與對(duì)照間地上部有19條代謝通路存在差異，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝、氨酰-tRNA 生物合成、來自組氨酸和嘌呤的生物堿的生物合成、檸檬酸循環(huán)（TCA 循環(huán)）、光合生物中的碳固定等途徑被顯著富集，其中丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝富集程度較大（見圖6A）。參與丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝途徑的差異代謝物有L-丙氨酸（上調(diào)12.34 倍）、L-谷氨酸（上調(diào)8.16 倍）、富馬酸（上調(diào)6.95 倍）、琥珀酸（下調(diào)2.23 倍）。100 μmol·L-1處理與對(duì)照地上部共存在9條差異代謝通路，精氨酸和脯氨酸代謝以及鳥氨酸、賴氨酸和煙酸衍生生物堿的生物合成這2條代謝通路被顯著富集，參與這2條途徑的差異代謝物質(zhì)主要有L-谷氨酸（上調(diào)4.64 倍）、富馬酸（下調(diào)2.23倍）和腐胺（上調(diào)2.08倍）（見圖6B）。

在根系差異代謝物代謝通路富集中，5 μmol·L-1處理與對(duì)照之間只篩選出1 條有明顯差異的代謝通路，即精氨酸和脯氨酸代謝途徑（見圖6C），參與此代謝途徑的差異代謝物質(zhì)有L-脯氨酸（上調(diào)9.31 倍）和腐胺（上調(diào)10.6 倍）。而在100 μmol·L-1處理與對(duì)照對(duì)比中共篩選出18 條代謝通路，乙醛酸和二羧酸代謝、鳥氨酸、賴氨酸和煙酸衍生生物堿的生物合成、氨酰-tRNA生物合成、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝等代謝通路被顯著富集，其中乙醛酸和二羧酸代謝富集程度較大（見圖6D）。參與乙醛酸和二羧酸代謝途徑的差異代謝物有琥珀酸（上調(diào)21.95 倍）、酒石酸（上調(diào)15.46 倍）、乙醇酸（上調(diào)3.83倍）、草酸（上調(diào)1.75倍）。

圖6 代謝通路分析氣泡圖A. 5 μmol·L-1—地上部；B. 100 μmol·L-1—地上部；C. 5 μmol·L-1—根系；D. 100 μmol·L-1—根系；Count.富集到代謝通路上的代謝物個(gè)數(shù)；-log1（0Pvalue）.代謝通路中檢測(cè)到的差異代謝物與該通路中總代謝物的比值，顏色越深表示富集程度越大Fig.6 Metabolic pathway analysis bubble chart A. 5 μmol·L-1—Shoot；B. 100 μmol·L-1—Shoot；C. 5 μmol·L-1—Root；D. 100 μmol·L-1—Root；Count.The number of metabolites enriched in the metabolic pathway；-log1（0Pvalue）.The ratio of the differential metabolites detected in the metabolic pathway to the total metabolites in the path?way，the darker the color，the greater the enrichment degree

3 討論

低濃度的Se 對(duì)多種植物來說是一種有益元素，但是Se 在較高濃度時(shí)可以引起植物的中毒反應(yīng)，最為基本的可見癥狀為生長速率降低、葉片萎黃特別是在年輕的葉子中等，郭元坤等［13］研究發(fā)現(xiàn)，低濃度Se（≤25 mg·L-1）能顯著促進(jìn)野葛幼苗的生長，提高葉綠素的含量，而高濃度Se（≥25 mg·L-1）則會(huì)抑制其生長。本研究得到了相似的結(jié)果：5 μmol·L-1Se 處理后顯著促進(jìn)了斜莖黃芪的生長，而在100 μmol·L-1Se 處理下，斜莖黃芪幼苗生長受到了顯著抑制，其根系長度和地上部高度均明顯降低。在多種脅迫條件下，例如干旱、鹽度和高溫或低溫，會(huì)破壞光合裝置的組成部分，并降低其光合能力［14］。葉綠素?zé)晒馐菣z測(cè)植物光化學(xué)反應(yīng)狀況的重要參數(shù)，可準(zhǔn)確揭示植物光系統(tǒng)對(duì)光能的吸收、傳遞、耗散和分配等情況［15-16］。在本研究中，不同濃度Se 處理下斜莖黃芪幼苗的生長狀況與其光合色素含量以及葉綠素?zé)晒鈪?shù)表現(xiàn)出了較好的一致性，低濃度Se 處理下新葉光合色素含量升高和PSⅡ?qū)嶋H的量子效率均出現(xiàn)升高，說明低濃度Se顯著促進(jìn)了斜莖黃芪幼苗的光合作用從而提高其生長速率。與此相反，在高濃度Se 處理下，斜莖黃芪葉片光合色素含量和最大量子產(chǎn)率Fv/Fm降低，非光化學(xué)猝滅qN 升高，表明高濃度Se處理嚴(yán)重影響了斜莖黃芪幼苗的光合作用并最終導(dǎo)致了其生長減緩。

黃芪屬多種植物對(duì)Se具有較高的耐性和富集能力［17］，斜莖黃芪即為其中一種。研究表明，植物可以從環(huán)境中吸收無機(jī)硒，并將其轉(zhuǎn)化為有機(jī)硒儲(chǔ)存起來，如：王永勤等［18］發(fā)現(xiàn)對(duì)大蒜無論是土壤施Se、葉面噴施Se、浸種，均能不同程度增加大蒜中Se 的含量。我們的研究結(jié)果顯示，20 μmol·L-1Se 處理4 周并未對(duì)斜莖黃芪根系和地上部生長造成顯著影響，并且其根系和地上部Se 含量與處理濃度間呈良好的線性關(guān)系，表明斜莖黃芪幼苗對(duì)Se 脅迫具有較高的耐性。此外，我們發(fā)現(xiàn)斜莖黃芪吸收的Se 主要積累在根部，向地上部分轉(zhuǎn)運(yùn)的比例相對(duì)較少，且隨著Se處理濃度的升高，轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)出現(xiàn)明顯下降，說明斜莖黃芪可以通過限制根系吸收的Se 向地上部的轉(zhuǎn)運(yùn)來減少Se 處理下地上部受到的傷害，從而提高植株對(duì)Se處理的耐性。

當(dāng)植物體所處的環(huán)境發(fā)生變化時(shí)，植物體的代謝途徑會(huì)隨著發(fā)生變化，從而引起代謝產(chǎn)物的類型和含量也會(huì)發(fā)生改變。本研究中，低濃度Se處理下，斜莖黃芪根系和地上部多個(gè)與氨基酸代謝相關(guān)的途徑被上調(diào)，如根系中的脯氨酸和精氨酸途徑以及地上部的谷氨酸、天冬氨酸和丙氨酸途徑。植物體內(nèi)氨基酸在蛋白質(zhì)合成中起著重要作用，同時(shí)對(duì)氮源的同化和庫源的轉(zhuǎn)運(yùn)也發(fā)揮了重要功能。因此，我們推測(cè)這些氨基酸代謝途徑的增強(qiáng)與低濃度下Se促進(jìn)斜莖黃芪生長具有著密切聯(lián)系。與低濃度Se 處理不同，100 μmol·L-1Se處理更多的引起了與次生物質(zhì)合成密切相關(guān)的代謝途徑的上調(diào)，如精氨酸和脯氨酸代謝、鳥氨酸、賴氨酸和煙酸衍生生物堿的生物合成以及乙醛酸和二羧酸代謝等代謝途徑。植物在面臨不利環(huán)境條件時(shí)，會(huì)將更多的物質(zhì)和能量用于次生代謝過程，以減輕不利環(huán)境條件對(duì)植物體造成的傷害。斜莖黃芪在高濃度Se 處理時(shí)，引起根系和地上部在次生代謝中扮演重要角色的初生代謝產(chǎn)物含量的升高，這一方面會(huì)導(dǎo)致用于生長發(fā)育的初生代謝產(chǎn)物的減少，從而延緩植物生長速度，另一方面則加強(qiáng)了次生代謝進(jìn)程，提高斜莖黃芪幼苗對(duì)Se脅迫的抵抗能力。

4 結(jié)論

斜莖黃芪對(duì)不同濃度Se 處理具有不同的響應(yīng)，低濃度Se 促進(jìn)了幼苗生長，而高濃度Se 則抑制了幼苗生長。低濃度和高濃度Se對(duì)斜莖黃芪幼苗生長的影響均與促進(jìn)或降低了葉片光合作用能力相關(guān)。通過對(duì)斜莖黃芪的初級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，斜莖黃芪主要通過降低根系吸收的Se 向地上部的運(yùn)輸以及提高植株與次生代謝相關(guān)的初生代謝物質(zhì)代謝水平來提高幼苗對(duì)高濃度Se處理的適應(yīng)能力。