黃志慧 張一寧 李娜娜 鄭寶江 張玉紅*
(1. 東北林業(yè)大學(xué)森林植物生態(tài)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗室,哈爾濱 150040;2. 黑龍江省林源活性物質(zhì)生態(tài)利用重點(diǎn)實(shí)驗室,哈爾濱150040;3. 東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,哈爾濱 150040)
近年來由于人類活動、工業(yè)化進(jìn)程加快和環(huán)境污染,導(dǎo)致大氣層中的臭氧層逐漸被破壞,致使到達(dá)地面環(huán)境中UV-B 紫外線(280~315 nm)輻射不斷增加[1]。已有的研究表明[2],過量的UV-B 輻射影響植物的光合生長和生理代謝作用,對植物造成不同程度的傷害,甚至?xí)?dǎo)致植物的死亡??緹煟∟icotiana tabacum)在增補(bǔ)中UV-B 處理后,葉綠素含量下降,而且下降幅度與輻射強(qiáng)度呈正相關(guān)[3];葡萄(Vitis vinifera)在UV-B 輻射增強(qiáng)處理后會導(dǎo)致光合速率、氣孔導(dǎo)度、胞間CO2濃度和蒸騰速率受到抑制[4]。植物為適應(yīng)環(huán)境,維持正常的生理活動,能夠通過多種途徑最大限度地調(diào)節(jié)自身防御系統(tǒng)來抵御不利環(huán)境的影響。適宜強(qiáng)度的UV-B輻射可以促進(jìn)杜仲(Eucommia ulmoides)的葉綠素含量的提高[5];不同強(qiáng)度UV-B 輻射能夠提高香蒲(Typha orientalis)中超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)和抗壞血酸過氧化物酶(APX)等抗氧化酶的活性,以及滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和次生代謝產(chǎn)物的含量來緩解對不利環(huán)境的適應(yīng)[6]。藥用植物作為植物中的特殊部分,UV-B 輻射會通過影響植物的生理代謝,進(jìn)而對藥用植物中次生代謝產(chǎn)物的合成效率、含量和產(chǎn)量發(fā)揮作用[7]。劉英等[5]研究表明,不同UV-B 輻射強(qiáng)度能促使1 年和3 年生的杜仲中黃酮、總酚、單寧等次生代謝產(chǎn)物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均顯著提高,而中、高強(qiáng)度UV-B 輻射能夠?qū)е骂嵡眩ˋtropa belladon?na)葉片與莖中次生代謝產(chǎn)物——莨菪堿和東莨菪堿含量的顯著降低[8]。因此,研究藥用植物在UV-B 輻射下的對植物生理特性及次生代謝產(chǎn)物的響應(yīng),對藥用植物的資源培育、生長發(fā)育和開發(fā)利用有著重要的實(shí)踐意義。
菥蓂(Thlaspi arvense)是十字花科(Cruciferae)菥蓂屬(Thlaspi)一年生草本植物,在我國廣泛分布,常生長在山坡、草地和路旁[9]。菥蓂是我國傳統(tǒng)的藥用植物,含有黑芥子苷、芥子酶等次生代謝產(chǎn)物,被歷版中華人民共和國藥典所收錄,全草可入藥,有清肝明目、清熱利尿、解毒和祛風(fēng)濕等功效[10]。目前對菥蓂的研究主要集中在其有效成分的提取、分離以及化學(xué)成分的鑒定等方面[11],而對菥蓂的逆境生理少有研究。本文通過增補(bǔ)UV-B輻射對菥蓂的光合指標(biāo)、滲透調(diào)節(jié)產(chǎn)物、抗氧化酶系統(tǒng)和次生代謝產(chǎn)物含量的研究,可為菥蓂的抗逆性培育和進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。
于2020 年4 月初,在東北林業(yè)大學(xué)森林植物生態(tài)學(xué)教育部重點(diǎn)試驗室的溫室內(nèi)進(jìn)行菥蓂的培育。菥蓂種子采自黑龍江省北安市。種子播種在土壤配比為V(腐殖質(zhì)土)∶V(蛭石)=3∶1 的長方形塑料盆里,待菥蓂生長到4~6 片葉時移植到花盆中,每盆移栽3 株,進(jìn)行日常管理,確保水分、養(yǎng)分供應(yīng)。當(dāng)菥蓂2個月齡時,選取生長狀況相對一致的菥蓂幼苗,分成3組,每組40盆,放置在2 m×1 m的矩形架內(nèi),四周均用黑布遮擋,每組之間用黑布隔開,以防止干擾。在自然光照基礎(chǔ)上,于植株上方懸掛40 W紫外燈管(北京光電研究所)作為增補(bǔ)UV-B 的光源(280~310 nm),每天照射12 h(06:00—18:00),陰雨天除外。2 種處理的UV-B 輻射強(qiáng)度分別為3.26 μW·cm-2(T1)、9.78 μW·cm-2(T2)。以正常光照生長的菥蓂幼苗為對照(CK),為保證植物所受光照一致,在對照組上方設(shè)置與試驗組相同高度的空燈架。UV-B 輻射強(qiáng)度通過紫外輻照計(UV340B,西安欣寶科儀有限公司)進(jìn)行測定。分別進(jìn)行UV-B 照射處理(0、6、12、24、36、48、60 h),每個時間段處理結(jié)束后的第2 天同一時間取樣,樣品經(jīng)液氮冷凍后轉(zhuǎn)移至冰箱中-80 ℃保存,用于各項指標(biāo)的測定。依據(jù)預(yù)試驗結(jié)果確定進(jìn)行UV-B照射處理48 h后的第2天上午分別進(jìn)行光合指標(biāo)的測定。試驗期間統(tǒng)一管理,定期澆水,減少其他干擾。每個處理設(shè)置3次重復(fù)。
選擇晴天的08:00—11:00,利用便攜式光合儀(Li-6400,美國LI-COR 公司)測定凈光合速率(Pn)、氣孔導(dǎo)度(Gs)、胞間CO2摩爾分?jǐn)?shù)(Ci)、蒸騰速率(Tr)。測定時CO2摩爾分?jǐn)?shù)設(shè)定為450 μmol·mol-1、光合有效輻射強(qiáng)度為800 μmol/(m2·s),溫度為25 ℃。氣孔限制值(Ls)利用如下公式計算:
式中:Co表示測定時環(huán)境的CO2摩爾分?jǐn)?shù),為450 μmol·mol-1。
在菥蓂葉片暗適應(yīng)20 min 后,利用便攜式葉綠素?zé)晒鈨x(PAM-2500,德國WALZ 公司)進(jìn)行葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測定。分別測量各處理下葉片的初始熒光強(qiáng)度(Fo)、最大熒光強(qiáng)度(Fm)、PSⅡ最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)、PSⅡ潛在光化學(xué)效率(Fv/Fo)、非光化學(xué)淬滅系數(shù)(QNP)、光化學(xué)淬滅系數(shù)(Qp)和電子傳遞速率(RET)。
葉綠素a、葉綠素b 含量的測定參照J(rèn)IANG等[12]的方法,取菥蓂葉片0.05 g,放入離心管中,加入5 mL 二甲基亞砜,60 ℃避光超聲提取至葉片組織變白,采用紫外分光光度計(UV-2250,日本島津公司)測定649、665 nm 波長下的吸光值。利用下面公式計算葉綠素a(CChla)、葉綠素b 質(zhì)量分?jǐn)?shù)(CChlb):
采用高俊鳳[13]的方法測定以下生理指標(biāo):丙二醛含量的測定采用硫代巴比妥酸(TBA)比色法,可溶性蛋白含量的測定采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法,可溶性糖含量的測定采用蒽酮比色法,脯氨酸含量的測定采用酸性茚三酮染色法,過氧化物酶(POD)活性測定采用愈創(chuàng)木酚法,過氧化氫酶(CAT)活性測定采用紫外吸收法,超氧化物歧化酶(SOD)活性測定采用氮藍(lán)四唑(NBT)光化還原法??箟难徇^氧化物酶(APX)活性測定采用Zhnag等[14]的方法進(jìn)行測定。
總酚、總黃酮含量測定:稱取菥蓂烘干后的葉片0.5 g,研磨成粉狀倒入50 mL 具塞離心管中,每組3 次重復(fù),向離心管中加入甲醇25 mL,稱其重量并計數(shù),然后進(jìn)行超聲處理(250 W,40 kHz)30 min,靜置室溫,再次稱重并用甲醇補(bǔ)足損失的重量,搖勻離心(10 000 r?min-1,20 min),后吸取上清液,用于測定總酚、總黃酮含量。采用福林酚法[15]測定總酚含量,氯化鋁比色法[15]測定總黃酮含量。
黑芥子苷含量測定[16]:選取新鮮菥蓂葉片2 g置于預(yù)冷的研缽中,加入40%乙醇5 mL 在冰上研磨形成勻漿,每組3 次重復(fù),將勻漿轉(zhuǎn)移到50 mL離心管中,再用40%乙醇10 mL 沖洗2~3 次研缽,搖勻后放入冰箱4 ℃靜置30 min,將其超聲處理(250 W,40 kHz)1.5 h 后過濾,濾液用于黑芥子苷含量的測定。采用HPLC 法測定菥蓂中黑芥子苷的含量。
利用SPSS 17.0 軟件分析試驗數(shù)據(jù),采用單因素方差分析方法比較各處理間的差異。采用Dun?can法,對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較(α=0.05)。
2.1.1 對菥蓂葉片氣體交換參數(shù)的影響
由表1可知,UV-B輻射T1和T2處理下菥蓂葉片的凈光合速率顯著低于CK,而氣孔限制值則與之相反,T1和T2處理組顯著高于CK(P<0.05),但兩參數(shù)在T1 和T2 處理組之間無顯著差異。菥蓂葉片的氣孔導(dǎo)度、胞間CO2摩爾分?jǐn)?shù)與蒸騰速率隨UV-B 輻射強(qiáng)度的增加而下降,T1 和T2 處理組均顯著低于對照組CK(P<0.05),并且T2 處理組均大于T1處理組。
表1 不同強(qiáng)度UV-B輻射對菥蓂葉片氣體交換參數(shù)的影響Table 1 Effects of different intensities of UV-B radiation on gas exchange parameters of T.arvense leaves
2.1.2 對菥蓂葉綠素?zé)晒馓匦缘挠绊?/p>
由表2 可知,在T1 和T2 處理下的Fm、Fv/Fm、Fv/Fo、Qp和RET均顯著低于對照組(P<0.05),并且2個處理組間差異顯著(P<0.05),T2 低于T1。Fo在CK、T1 和T2 處理組間差異均不顯著。T1 和T2 處理組的QNP均顯著高于CK(P<0.05),但2 個處理組間無顯著差異,紫外脅迫提高了菥蓂葉片的QNP。
表2 不同強(qiáng)度UV-B輻射對菥蓂葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響Table 2 Effects of Different Intensities of UV-B radia‐tion on chlorophyll fluorescence parameters of T.arvense
2.1.3 對光合色素含量的影響
T1 和T2 處理組隨輻射時間的延長,葉綠素a含量呈現(xiàn)先升高后降低,再升高再下降的雙峰曲線,輻射強(qiáng)度越大,峰值到達(dá)的時間越早。葉綠素b 含量與葉綠素a 含量的變化趨勢相似,但在24 h之前,各處理組間沒有顯著差異(P>0.05)(見圖1)。葉綠素a 含量在處理36 h 之前T2 組高于T1組,隨后則T2顯著低于T1組(P<0.05),而葉綠素b在24h 和36h 時T2 顯著高于T1,隨后則T1 高于T2,且隨著處理時間延長呈下降趨勢,但無論是葉綠素a 還是葉綠素b 在24h 之后T1 和T2 組均顯著高于CK(P<0.05)。
圖1 不同強(qiáng)度UV-B輻射處理對菥蓂葉綠素含量影響不同小寫字母代表同一輻射時間內(nèi),各處理組之間差異顯著(P<0.05),下同F(xiàn)ig.1 Effects of UV-B radiation treatments at different intensities on Chlorophyll content of T.arvense Different lowercase letters represent the same radiation time,and there were significant differences among the treatment groups(P<0.05),the same as below
如圖2 所示,同一輻射強(qiáng)度下,4 種物質(zhì)的含量均隨輻射時間的延長呈先升高后降低趨勢,丙二醛和可溶性糖含量均在處理12 h 時出現(xiàn)峰值,并且丙二醛峰值T2>T1>CK 組,而可溶性糖在48 h之前2個處理組均顯著高于CK,但T1和T2組之間卻無顯著差異(P>0.05);游離脯氨酸中T2 組和T1組分別在12和24 h出現(xiàn)峰值,而可溶性蛋白含量比游離脯氨酸的出峰時間晚了12 h,分別在24和36 h達(dá)到峰值,并在48 h之內(nèi)T1和T2組均顯著高于CK,除24 h外,T1均顯著高于T2(P<0.05)。
圖2 不同強(qiáng)度UV-B輻射對菥蓂葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響Fig.2 Effects of different intensities of UV-B radiation on osmotic regulators in leaves of T.arvense
在增補(bǔ)2 種UV-B 輻射強(qiáng)度處理下,菥蓂中過氧化物酶、過氧化氫酶、超氧化物岐化酶和抗壞血酸過氧化物酶4種抗氧化酶活性,均隨輻射時間的延長呈先升高后下降的趨勢;POD 活性在36 h 時達(dá)到峰值,并且T2處理組顯著高于T1處理組(P<0.05),隨后則T2 處理組顯著低于T1 處理組,且隨著時間延長呈下降趨勢;對于CAT和SOD,T1組和T2 組分別在12 h 和6 h 達(dá)到峰值,CAT 活性在12 h之后均表現(xiàn)為T1 顯著高于T2,并在36 h 之前2 個處理組顯著高于CK,之后低于CK,而SOD 活性在24 h 之前2 個處理組顯著高于CK,之后(除48 h)T2 顯著高于T1 和CK,而T1 和CK 之間無顯著差異;APX 活性中T1 組和T2 組分別在處理后的12 h和24 h 出現(xiàn)峰值,并且在24 h 之前T1 顯著高于T2,隨后則(除48 h外)2個處理間無顯著差異(P>0.05)在整個輻射過程中2 個處理組的活性均顯著高于對照組(見圖3)。
圖3 不同強(qiáng)度UV-B輻射對菥蓂葉片抗氧化酶活性的影響Fig.3 Effects of different intensities of UV-B radiation on the activities of antioxidant enzymes in the leaves of T.arvense
由圖4 可知,在增補(bǔ)UV-B 輻射下隨輻射時間的延長,2個處理組中菥蓂葉片的總黃酮含量有上升趨勢,T1、T2處理分別從24 h和12 h后均顯著高于CK(P<0.05)并且2 個處理組間從24 h 開始無顯著差異(P<0.05);菥蓂中的總酚,隨輻射時間的延長呈先升高后降低趨勢,不同輻射強(qiáng)度下的總酚含量達(dá)到峰值的時間不同,T2 組(36 h)早于T1 組(48 h),總酚峰值也是T2 處理組(8.701 mg·g-1)大于T1 處理組(8.446 mg·g-1),但差異不顯著(P>0.05),在整個處理過程中T1 和T2 處理組均顯著高于CK,并且除12 h 處理外,2 個處理組間無顯著差異(P<0.05);在增補(bǔ)UV-B 輻射下隨輻射時間的延長,菥蓂葉片中黑芥子苷的含量呈先上升后下降趨勢,T1 和T2 處理在6 h 時達(dá)到峰值,并且2個處理組的峰值均顯著高于CK,且T2>T1(P<0.05),T1(2.868 mg·g-1)和T2(3.292 mg·g-1)處理組的黑芥子苷的含量分別是對照(1.725 mg·g-1)的1.66 和1.91 倍,隨輻射時間的延長,T1 和T2 處理組中黑芥子苷的含量分別在24 h 和60 h 均顯著低于CK組(P<0.05),并且T1組呈逐漸下降趨勢。
圖4 不同強(qiáng)度UV-B 輻射處理對菥蓂葉片次生代謝物質(zhì)的影響Fig.4 Effects of UV-B Radiation Treatments at different intensities on secondary metabolites in the leaves of T.arvense
光,包括UV-B(280~320 nm),是控制植物生長發(fā)育的最重要的環(huán)境因素之一。光提供能量來支持植物光合作用和生長發(fā)育及生理代謝。不同波長的光提供不同的環(huán)境信號來改變植物的發(fā)育過程。UV-B 輻射光與其他波長的光不同,是由于UV-B 的高能量和吸收它的分子范圍有限,過量會導(dǎo)致植物細(xì)胞受損。因此,植物為保護(hù)自己免受UV-B 的傷害,植物會根據(jù)受傷害程度啟動體內(nèi)廣泛的防御系統(tǒng),來抵御和修復(fù)自己所遭受的UV-B傷害,最大程度上維持正常的生命活動[17]。
光合作用在植物生長發(fā)育過程中起著重要作用,增補(bǔ)UV-B 輻射下植物的光合作用受到一定程度影響[4]。本研究中隨紫外輻射增強(qiáng),菥蓂中凈光合速率、蒸騰速率、氣孔導(dǎo)度、胞間CO2質(zhì)量濃度不斷降低,而氣孔限制值卻增加,這可能是植物在UV-B輻射下由于受氣孔因素所造成部分氣體交換參數(shù)的下降[18]。增補(bǔ)紫外輻射使菥蓂葉片的Fv/Fm、Fv/Fo、Fm、Qp、QNP、RET等葉綠素?zé)晒鈪?shù)值下降,可能是植物葉片受到了光抑制,使PSⅡ反應(yīng)中心活性受到影響,并且電子傳遞受阻以及光能合成化學(xué)能效率降低[19],對黃檗(Phellodendron amu?rense)葉片在增補(bǔ)UV-B 輻射下也得到相同的結(jié)果[20],有研究表明,葉綠素作為植物進(jìn)行光合作用的重要色素之一,可以通過含量的高低直接或間接影響植物的生長發(fā)育進(jìn)程[21],本試驗中隨著輻射時間的延長,葉綠素含量呈先小幅度上升后下降趨勢,雖然在輻射后期2個處理組中葉綠素含量呈下降趨勢但仍高于對照,因此紫外輻射促進(jìn)了菥蓂葉綠素含量的合成,可能與植物抗紫外脅迫能力的強(qiáng)弱有關(guān)[5]。
植物在UV-B 輻射下,會加快膜質(zhì)過氧化的速度,丙二醛含量可以間接體現(xiàn)出植物膜系統(tǒng)結(jié)構(gòu)的受損程度[22],在本研究中隨輻射時間的延長,菥蓂中丙二醛含量呈先上升后下降趨勢,可能是隨著UV-B 輻射時間的延長,菥蓂葉片中部分抗氧化酶活性不斷升高,活性氧自由基被直接或間接地清除,減輕了膜系統(tǒng)的受損程度,致使丙二醛的含量逐漸減少[6]。多數(shù)植物在脅迫環(huán)境下都可通過自身的滲透調(diào)節(jié)系統(tǒng)來緩解脅迫帶來的壓力進(jìn)而維持正常的生理活動[23],本研究中游離脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白均隨輻射時間的延長呈先升高后降低趨勢,這與孟凡來等[24]對甘薯(Dioscorea esculenta)的研究結(jié)果相似,除游離脯氨酸其他滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的2個處理組均大于或等于對照組,而游離脯氨酸在輻射末期處理組低于對照,可能是隨著輻射劑量的積累,游離脯氨酸的積累受到抑制[25]。
逆境下植物體內(nèi)會產(chǎn)生大量的活性氧自由基,將導(dǎo)致植物進(jìn)行光合作用時受到損害,而植物清除活性氧自由基可以通過體內(nèi)的抗氧化酶系統(tǒng)來進(jìn)行[22],本研究表明,4 種抗氧化酶都表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢,而SOD、CAT 活性先于其他2種抗氧化酶達(dá)到峰值,并且輻射強(qiáng)度越大,出現(xiàn)的峰值越早,可能是隨著UV-B 輻射逐漸增加,植物體內(nèi)活性氧自由基大量累積,最先接受到清除信號的是SOD[26],而SOD 在植物細(xì)胞內(nèi)主要是將O2-歧化為 -·O2和H2O2,然后通過CAT、POD 和APX 直接或間接的清除H2O2,它們之間相互協(xié)作使植物保持正常的生理活動[27],但CAT 在處理末期T1 和T2 均低于對照,可能在長時間輻射劑量累積下超出了菥蓂自我調(diào)節(jié)的閾值導(dǎo)致CAT 活性下降,而其他3 種抗氧化酶均高于對照或與對照無顯著變化,可能是因為菥蓂適應(yīng)能力增強(qiáng)所導(dǎo)致。
植物在逆境下以細(xì)胞分化為主細(xì)胞生長為輔,而次生代謝產(chǎn)物是植物細(xì)胞分化產(chǎn)生的一種特定物質(zhì)[28]。孟祥才等[29]活性氧假說中認(rèn)為植物在逆境下產(chǎn)生的活性氧會影響抗氧化酶活性的變化,而次生代謝產(chǎn)物含量會增加。本研究中,在增補(bǔ)UV-B 輻射下,菥蓂中的總黃酮含量持續(xù)增高,并且總黃酮和總酚含量分別在輻射處理24 h 和12 h 之后均顯著(P<0.05)高于對照,作為能夠吸收有害輻射物質(zhì)的黃酮和酚類物質(zhì)多存在于表皮細(xì)胞的液泡里,隨著紫外輻射劑量的增加和時間的延長,植物啟動應(yīng)激防御系統(tǒng),會促使植物本身快速合成黃酮和酚類物質(zhì),進(jìn)而促進(jìn)植物對脅迫環(huán)境下的抵御能力,緩減紫外輻射對自身的傷害[30]。黑芥子苷是一種含氮、含硫的次生代謝產(chǎn)物,是菥蓂中重要的芥子油苷類物質(zhì),本研究中菥蓂在增補(bǔ)UV-B 輻射下,黑芥子苷的含量在短時間內(nèi)呈先上升后下降趨勢,而在輻射未期黑芥子苷的含量低于對照,可能是由于菥蓂在受到UV-B 輻射后,引起體內(nèi)碳/氮分配發(fā)生了變化,使碳從植物生長為主轉(zhuǎn)移到了產(chǎn)生具有保護(hù)、防御功能的、以碳為基礎(chǔ)的初生代謝和次生代謝產(chǎn)物中,從而不利于以氮為基礎(chǔ)的含氮次生代謝產(chǎn)物的合成[8]。
兩種輻射強(qiáng)度下菥蓂的凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、蒸騰速率、胞間CO2質(zhì)量濃度等光合指標(biāo)、葉綠素最大熒光參數(shù)(Fm)、PSⅡ原初光能轉(zhuǎn)換效率(Fv/Fm)和PSⅡ潛在光化學(xué)活性(Fv/F0)等葉綠素?zé)晒鈪?shù)均隨輻射強(qiáng)度增大而降低;葉綠素a和葉綠素b、丙二醛、可溶性蛋白、可溶性糖和脯氨酸等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、超氧化物岐化酶、過氧化氫酶、過氧化物酶和抗壞血酸過氧化氫酶活性、總酚和黑芥子苷等次生代謝產(chǎn)物含量均隨輻射時間增加呈現(xiàn)先上升后下降趨勢,而總黃酮含量呈逐漸上升趨勢,在輻射未期與對照差異顯著(P<0.05)??傮w而言,在不同輻射強(qiáng)度下,菥蓂通過提高總黃酮和總酚含量的合成、可溶性蛋白和可溶性糖的積累、以及葉綠素含量、超氧化物岐化酶、過氧化物酶和抗壞血酸過氧化氫酶活性的增加,抵抗紫外脅迫對其造成的影響,進(jìn)而得出菥蓂具有較強(qiáng)的抗紫外脅迫能力,這為菥蓂抗逆性培育和進(jìn)一步利用提供理論基礎(chǔ)。