唐思如 王鐵娟 秀 芳 劉夢(mèng)瑤 張 慧

（內(nèi)蒙古師范大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古自治區(qū)高等學(xué)校生物多樣性保護(hù)與可持續(xù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特 010022）

譜系地理學(xué)（phylogeography）最早由Avise 提出，是通過(guò)重建基因譜系，揭示物種形成現(xiàn)有地理分布格局的成因，以及近緣種間或種群間的歷史進(jìn)化關(guān)系［1-3］。對(duì)某個(gè)物種的譜系地理學(xué)研究，更多關(guān)注該物種冰期避難所及在氣候變化過(guò)程中物種范圍的變化等進(jìn)化歷史問(wèn)題［4］。在我國(guó)，譜系地理學(xué)的研究以橫斷山區(qū)和毗鄰的青藏高原地區(qū)為熱點(diǎn)，對(duì)干旱區(qū)的研究也有一定報(bào)道，見(jiàn)于我國(guó)西北部荒漠區(qū)的瀕危植物或一些特有植物的研究［5-9］。草原區(qū)沙地的相關(guān)研究少見(jiàn)，如Xu 等［10］對(duì)科爾沁沙地分布的東北木蓼（Atraphaxis manshurica）進(jìn)行譜系地理學(xué)研究，提出該種的遺傳分化主要發(fā)生在更新世中晚期，與周期性的冰期和季風(fēng)變化相一致。

褐 沙 蒿（Artemisia intramongolica）為 菊 科（Compositae）蒿屬（Artemisia）龍蒿組（Sect.Dracun?culus）半灌木植物，該種集中分布于內(nèi)蒙古典型草原帶的渾善達(dá)克沙地，是該區(qū)域固定沙地和半固定沙地的主要建群植物，也可見(jiàn)于覆沙高平原上［11］。褐沙蒿與分布于科爾沁沙地與呼倫貝爾沙地的差不嘎蒿（A.halodendron）和分布于鄂爾多斯及其周邊的黑沙蒿（A. ordosica）構(gòu)成典型的沙生地理替代分布［12］，為我國(guó)北方重要的防風(fēng)固沙、水土保持植物，其嫩枝與葉為家畜喜食，具有一定的飼用價(jià)值。對(duì)于褐沙蒿的遺傳分化與多樣性研究有過(guò)一定報(bào)道，集中在片段分析方面，包括RAPD［13］、ISSR［14］、SSR［15］3 種分析方法，而基于序列分析的譜系地理學(xué)研究還未見(jiàn)報(bào)道。作為渾善達(dá)克沙地的特有植物和最為重要的固沙植物之一，其形成與分化的時(shí)空格局及相關(guān)的地球環(huán)境背景尚不清楚，值得深入探討。本研究基于轉(zhuǎn)錄組開(kāi)發(fā)得到的褐沙蒿及其近緣種的2 個(gè)直系同源單拷貝核基因片段，分析褐沙蒿的遺傳結(jié)構(gòu)以及譜系分布格局，探討褐沙蒿的種群擴(kuò)張歷史，為褐沙蒿以及其近緣種間的進(jìn)化遷移提供重要資料，也為渾善達(dá)克沙地形成對(duì)其現(xiàn)有物種的地理分布格局的影響研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

在褐沙蒿自然分布區(qū)范圍內(nèi)共選取8 個(gè)地理種群，地點(diǎn)與生境見(jiàn)表1 和圖1。在每個(gè)種群隨機(jī)選取20 個(gè)個(gè)體，個(gè)體之間間隔10 m 以上。每株植物采集生長(zhǎng)良好的嫩葉約10 g，放入已編號(hào)密封袋中加變色硅膠快速干燥保存，帶回實(shí)驗(yàn)室后置于冰箱中-20 ℃存放。8個(gè)種群的憑證標(biāo)本均存放在內(nèi)蒙古師范大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院標(biāo)本館。

圖1 褐沙蒿采樣分布圖地圖信息來(lái)自國(guó)家基礎(chǔ)地理信息中心（https：//www.webmap.cn）Fig.1 Sampling distribution map of A.intramongolica The map information is from the National Geomatics Center of China（https：//www.webmap.cn）

表1 采樣地點(diǎn)與生境Table 1 Sampling sites and habitats

1.2 研究方法

1.2.1 同源單拷貝核基因開(kāi)發(fā)

利用Illumina HiSeq 4000 測(cè)序平臺(tái)（北京百邁克公司）對(duì)蒿屬龍蒿組10 種植物樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，得到Clean Data，利用Trinity 軟件［16］組裝得到大量Unigene，借助OrthoMCL［17］軟件根據(jù)Blast的結(jié)果，通過(guò)mcl算法分別對(duì)樣品進(jìn)行基因家族聚類(lèi)分析，得到5 000 多條直系同源單拷貝核基因。由于褐沙蒿與黑沙蒿、差不嘎蒿為近緣種［18］，篩選在3 種植物間具有2 個(gè)以上變異位點(diǎn)的基因，由北京擎科生物科技有限公司進(jìn)行引物合成。

1.2.2 DNA提取

采用北京天根生化科技公司的DNAsecure 新型植物基因組DNA 提取試劑盒提取樣品總DNA，然后利用0.7%瓊脂糖凝膠電泳（1xTBE）分離并檢測(cè)條帶，用超微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)濃度后，將DNA 產(chǎn)物統(tǒng)一稀釋至40 ng·μL-1，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 引物篩選與PCR擴(kuò)增

通過(guò)NCBI網(wǎng)站中的Primer-Blast合成的引物，然后在褐沙蒿種群內(nèi)進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，選擇擴(kuò)增效果好、多態(tài)性較高的基因c9065和c7847，c9065引物序列是F：5'-TTCATTGACATGGGAAAGAAATCA-3'和R：5'-TGGTTGCTTCAAATCGTCCG-3'，c7847為F：5'-ATGTTCATGCTGACCCCAAT-3'和R：5'-CCGGATCCTCCATCGATAAC-3'。對(duì) 褐 沙 蒿8 個(gè)種群個(gè)體進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)體系為25 μL：2TaqMasterMix 12.5 μL，DNA模板2.0 μL（80 ng），ddH2O 8.5 μL，引物各1.0 μL（10 μmol·L-1）。PCR 擴(kuò)增程序：70 ℃預(yù)變性1 min，94 ℃變性1 min，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸50 s，循環(huán)2次；接著94 ℃變性20 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸50 s，循環(huán)38 次；最后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物由北京擎科生物科技有限公司完成測(cè)序。分析所有個(gè)體序列的雙峰位點(diǎn)，按照雙峰位點(diǎn)組成類(lèi)型，選擇相應(yīng)個(gè)體克隆測(cè)序，以對(duì)軟件拆分的單倍型序列進(jìn)行矯正。

1.3 數(shù)據(jù)分析

通 過(guò)Chromas 軟 件（http：//technelysium.com.au/）查看測(cè)序峰圖，對(duì)于雜合位點(diǎn)按照IUPAC 編碼標(biāo)準(zhǔn)（R=A/G；Y=C/T；M=A/C；S=C/G；W=A/T）錄入；利用DNASTAR Lasergene v7.1 軟件［19］進(jìn)行序列比對(duì)；用MEGA7 軟件［20］將序列前后切齊，并進(jìn)行手工校正，序列文件以Fasta 格式保存；由于是核基因，具有重組，使用DnaSP 5.10 軟件［21］中的UNPHASE/Genotype 功能將序列拆分，生成單倍型，并通過(guò)克隆測(cè)序結(jié)果對(duì)單倍型進(jìn)行驗(yàn)證，統(tǒng)計(jì)單倍型數(shù)量（h）、計(jì)算單倍型多樣性（Hd）、核苷酸多態(tài)性（π）與基因流（Nm）等指標(biāo)；通過(guò)Arleqiun3.5軟件［22］進(jìn)行分子變異方差分析（AMOVA），統(tǒng)計(jì)種群內(nèi)和種群間的遺傳變異（1 000 次置換檢驗(yàn)）；由PERMUT 軟件［23］計(jì)算種群遺傳分化系數(shù)Gst、Nst值（1 000 次置換檢驗(yàn)）；利用Arleqiun3.5 軟件計(jì)算中性檢驗(yàn)的Tajima’sD、Fu’Fs、SSD、Raggedness index值，通過(guò)DNAsp 5.10 繪制錯(cuò)配圖；利用軟件PO?PART［24］中的Median Joining Network 模型構(gòu)建單倍型網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 遺傳多樣性分析

褐沙蒿c9065片段長(zhǎng)度為485 bp，116 個(gè)個(gè)體共獲得14 個(gè)變異位點(diǎn)和48 種單倍型（GenBank 注冊(cè)序列號(hào)：OL632106-OL632153）；c7847片段長(zhǎng)457 bp，147 個(gè)個(gè)體共獲得19 個(gè)變異位點(diǎn)和40 種單倍型（GenBank 注冊(cè)序列號(hào)：OL632154-OL632193）。褐沙蒿在種的水平上，c9065的Hd為0.871 6，π為0.008 2，c7847的2個(gè)值分別為0.934 8和0.005 9；在種群水平上c9065的Hd為0.808 5～0.931 2，π為0.007 2～0.009 0，c7847的Hd為0.884 1～0.9524，π為0.005 3～0.006 6。按照Grant等［25］提出的標(biāo)準(zhǔn)，Hd>0.5、π>0.005，多樣性程度高（見(jiàn)表2）。因此，褐沙蒿不論是物種水平還是各個(gè)種群均具有較高的多樣性。

表2 褐沙蒿8 個(gè)種群的單倍型多樣性（Hd）與核苷酸多樣性（π）Table 2 Haplotype diversity（Hd）and nucleotide diversi‐ty（π）of eight populations of A.intramongolica

2.2 遺傳結(jié)構(gòu)與單倍型網(wǎng)絡(luò)關(guān)系

分子方差分析結(jié)果表明，基于c9065和c7847的褐沙蒿種群內(nèi)變異分別占99.398%和98.908%，表明絕大多數(shù)遺傳變異來(lái)源于種群內(nèi)（見(jiàn)表3），也因而有著很小的遺傳分化，F(xiàn)st分別為0.006（c9065）和0.011（c7847），處于Hartl 提出的分化很弱范圍（Fst介于0～0.05）［26］?；蛄鱊m能反映種群間基因交流的情況，Nm≥1 為高水平［27］，褐沙蒿c9065和c7847檢測(cè)的基因流分別為6.810 和7.270（見(jiàn)表4），遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于1，說(shuō)明其種群間基因交流非常廣泛，減少了種群間的遺傳分化，與Fst的結(jié)果相互印證。從譜系地理結(jié)構(gòu)來(lái)講，c9065的分析結(jié)果Nst（0.007）Gst（0.011），但差異不顯著（P>0.05），表明褐沙蒿種群不存在譜系地理結(jié)構(gòu)（見(jiàn)表4）。

表3 基于c9065和c7847的褐沙蒿分子方差（AMOVA）分析Table 3 Analysis of molecular variance（AMOVA）of A.intramongolica based on c9065 and c7847

表4 褐沙蒿種群間遺傳分化系數(shù)與基因流Table 4 Genetic differentiation coefficient and gene flow of A.intramongolica

圖2為褐沙蒿的單倍型網(wǎng)絡(luò)圖，其中每個(gè)圓代表一種單倍型，圓的半徑與該單倍型的數(shù)量呈正比，每種顏色分別代表1 個(gè)種群。2 個(gè)核基因的結(jié)果均表現(xiàn)為褐沙蒿網(wǎng)絡(luò)圖較為復(fù)雜，交錯(cuò)連接，主要分為兩大分支A 和B。c9065結(jié)果中，Hap1 在各種群均出現(xiàn)，且出現(xiàn)的次數(shù)最多，其次為Hap2，也在各種群均出現(xiàn)；而分布少的單倍型多，有17種在2～4 個(gè)種群中出現(xiàn)，24 種為種群特有單倍型（見(jiàn)圖2A）。c7847結(jié)果中，Hap2、Hap3、Hap4、Hap5、Hap7、Hap9及Hap12為8個(gè)種群共有單倍型，其中Hap5 出現(xiàn)次數(shù)最多，有16種單倍型在種群中出現(xiàn)的次數(shù)較少，只在2～4 個(gè)種群中出現(xiàn)，13 個(gè)為各種群特有單倍型（見(jiàn)圖2B）。從各單倍型的分布情況看，均未與種群的地理分布相關(guān)。

圖2 基于單拷貝核基因c9065（A）與c7847（B）的單倍型網(wǎng)絡(luò)Fig.2 Haplotype network based on the single-copy nuclear gene c9065（A）and c7847（B）

2.3 褐沙蒿地理種群中性檢驗(yàn)及種群擴(kuò)張分析

對(duì)褐沙蒿所有個(gè)體和種群進(jìn)行中性檢驗(yàn)表明，2 個(gè)基因的Tajima’sD值無(wú)論是總的還是種群水平均不顯著（P>0.05），不拒絕中性進(jìn)化假設(shè)。兩個(gè)基因Fu’sFs總的值均顯著（P<0.05），顯示存在種群擴(kuò)張（見(jiàn)表5）。從錯(cuò)配分析圖來(lái)看，c7847呈單峰，支持Fu’sFs的結(jié)果，但c9065呈雙峰（見(jiàn)圖3）。綜合各指標(biāo)結(jié)果，表明褐沙蒿不存在明顯種群擴(kuò)張。歧點(diǎn)分析結(jié)果顯示，c9065在總體和種群水平上SSD 值與Raggedness index 值均不顯著（P>0.05），c7847兩個(gè)值在總體水平上均顯著，種群水平上多數(shù)顯著（P<0.05）（見(jiàn)表5）。綜合分析各種群的Fu’sFs值、SSD 和Raggedness index 值，位于分布區(qū)東北部的種群BYXL 與XWQ 在2 個(gè)基因上均顯示Fu’sFs值顯著（P<0.05）、SSD 和Rag?gedness index 值不顯著（P>0.05），說(shuō)明存在明顯的種群擴(kuò)張，位于西北部的XSQ 種群多數(shù)指標(biāo)也顯示存在種群擴(kuò)張。綜上所述，褐沙蒿在中性模式下經(jīng)歷了有限的擴(kuò)張。

表5 褐沙蒿種群擴(kuò)張概率Table 5 Probabilities statistics for population expansion of A.intramongolica

圖3 基于單拷貝核基因c9065（A）與c7847（B）褐沙蒿種群錯(cuò)配分析Fig.3 Mismatch analysis diagram for populations of A.intramongolica based on the single-copy nuclear gene c9065（A）and c7847（B）

3 討論

3.1 種群遺傳多樣性與遺傳結(jié)構(gòu)

以往對(duì)褐沙蒿種群遺傳多樣性的研究，無(wú)論是RAPD［13］、ISSR［14］還是SSR［15］有著一致的結(jié)果，均顯示褐沙蒿有著高的遺傳多樣性。本研究通過(guò)轉(zhuǎn)錄組開(kāi)發(fā)得到變異適中的直系同源單拷貝核基因c9065和c7847，分別對(duì)褐沙蒿自然分布范圍內(nèi)8 個(gè)地理種群116 個(gè)、147 個(gè)個(gè)體進(jìn)行單倍型分析，結(jié)果顯示，2個(gè)基因的單倍型多樣性不論是總的還是種群均大于0.5；總的核苷酸多樣性均在0.005以上，表明不論是物種還是種群均有著高的遺傳多樣性。這與之前基于各種片段分析的研究結(jié)果具有一致性，反映出雖然褐沙蒿分布范圍不大，但作為蒿屬這一進(jìn)化類(lèi)群中的一員對(duì)現(xiàn)有生存環(huán)境有著良好的適應(yīng)性。

就種群遺傳結(jié)構(gòu)而言，基于c9065和c7847的AMOVA 分析顯示，褐沙蒿種群內(nèi)變異分別為占99.398%和98.908%。與以往的研究相比，RAPD分析顯示褐沙蒿種群內(nèi)變異占87.96%［13］、ISSR 為92.43%［14］、SSR 為86.02%［15］，結(jié)果具有一致性，即褐沙蒿的變異主要由種群內(nèi)的遺傳變異導(dǎo)致。只是核基因顯示出種群間變異更小，這與核基因得到的變異位點(diǎn)不如片段分析（RAPD、ISSR、SSR）得到的位點(diǎn)豐富有關(guān)。褐沙蒿分布于渾善達(dá)克沙地，該沙地地勢(shì)較為平坦，沒(méi)有明顯的地理阻隔，加之褐沙蒿為風(fēng)媒傳粉，而花粉擴(kuò)散正是基因流動(dòng)的主要形式［28］，因而得到褐沙蒿種群間的基因流很高，分別為6.810（c9065）和7.270（c7847），遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于1，也正是廣泛的基因交流導(dǎo)致褐沙蒿的種群間存在很小的遺傳分化。

3.2 譜系地理結(jié)構(gòu)與種群歷史動(dòng)態(tài)分析

植物譜系地理結(jié)構(gòu)分析中常用的是葉綠體基因片段（cpDNA）和核基因中的ITS［5，29］，但這些常用的片段在蒿屬尤其是近緣種間分辨率不夠，如我們?cè)?jīng)做過(guò)核基因ITS［30］、葉綠體基因片段trnL-F［31］，以及未發(fā)表的多個(gè)葉綠體基因片段，結(jié)果顯示在蒿屬近緣種間具有高度的一致性，在種內(nèi)個(gè)體間基本一致，因而進(jìn)行譜系地理學(xué)研究具有一定的局限性。本研究以褐沙蒿及其近緣種為對(duì)象，開(kāi)發(fā)得到大量的直系同源單拷貝核基因片段，選擇變異適中的基因c9065和c7847，基因片段長(zhǎng)485、457 bp，易于擴(kuò)增，分別獲得14、19 個(gè)變異位點(diǎn)，較豐富，不僅適合褐沙蒿研究，也可用于蒿屬其他物種研究。本研究通過(guò)2 個(gè)核基因計(jì)算遺傳分化系數(shù)Gst和Nst，并進(jìn)行1 000次的置換檢驗(yàn)，顯示c9065的NstGst，但 差 異 不 顯 著（P>0.05），說(shuō)明褐沙蒿在其分布范圍內(nèi)不存在譜系地理結(jié)構(gòu)。從2 個(gè)基因的單倍型網(wǎng)絡(luò)圖可以看出，高頻率的單倍型分布到多數(shù)種群中，存在明顯網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，但同時(shí)各單倍型在種群中交織分布，與種群的地理分布沒(méi)有明顯聯(lián)系，這也與種群間基因交流廣泛，缺乏種群特有的高頻率的單倍型有關(guān)。

蒿屬的化石孢粉最早見(jiàn)于亞洲北部第三紀(jì)漸新世的地層中［32］，林有潤(rùn)提出蒿屬植物在北半球形成分化后，沿著西、東及南三方向遷移而擴(kuò)展分布區(qū)［33］，在我國(guó)形成“三斜帶密集帶譜”，褐沙蒿所屬的龍蒿組植物處于第三條帶譜，即從大興安嶺西部至西藏西北部以北的干旱或半干旱地區(qū)［32］。據(jù)孢粉相關(guān)報(bào)道，我國(guó)北方蒿屬植物主要出現(xiàn)在中新世時(shí)期［34-36］，與前述相吻合。褐沙蒿分布于渾善達(dá)克沙地，渾善達(dá)克沙地是在晚新生代青藏高原隆升的大背景下形成演變的，第四紀(jì)冰期時(shí)，該區(qū)域受東亞季風(fēng)控制，伴隨著氣候的巨變，出現(xiàn)沙丘活化、擴(kuò)展與沙丘固定、收縮的波動(dòng)過(guò)程［37］，這必將對(duì)植被產(chǎn)生的影響。不過(guò)從褐沙蒿的研究結(jié)果來(lái)看，總體水平上，2 個(gè)核基因的Tajima’sD值均不顯著（P>0.05），F(xiàn)u’sFs值顯著（P<0.05），呈現(xiàn)出在中性模式下經(jīng)歷了有限的種群擴(kuò)張。從各種群來(lái)看，位于分布區(qū)東北部的西烏旗（XWQ）和錫林浩特東的BYXL種群存在明顯的種群擴(kuò)張、西北部的西蘇旗（XSQ）種群也存在較明顯的種群擴(kuò)張，反映出分布區(qū)北部種群具有更大的波動(dòng)性。Xu 等［10］對(duì)科爾沁沙地（與渾善達(dá)克沙地相鄰）分布的東北木蓼進(jìn)行種群歷史動(dòng)態(tài)研究，發(fā)現(xiàn)有其中2個(gè)種群的遺傳多樣性水平明顯高出其他種群，因而推測(cè)這2 個(gè)種群的所在地可能是該種在冰期時(shí)的避難所，但本研究中褐沙蒿的各種群多樣性水平差異不大，以往的研究也是如此，因而無(wú)法推斷小型避難所的區(qū)域，尚需渾善達(dá)克沙地其他物種的研究。