胡文海 肖宜安

（1. 井岡山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉安 343009；2. 江西省生物多樣性與生態(tài)工程重點實驗室，吉安 343009）

光合作用是植物受外界影響最為敏感的生理過程，葉片光合作用表現(xiàn)出高度的空間異質(zhì)性［1］，并且葉片光合作用的異質(zhì)性受到葉片發(fā)育程度、環(huán)境因子和病蟲害等因素的影響［2-5］。葉綠素?zé)晒夥治黾夹g(shù)以其快速無損傷、高靈敏度等優(yōu)勢，成為研究植物光合作用的主要手段。目前，葉綠素?zé)晒夥治黾夹g(shù)可分為調(diào)制式和非調(diào)制式兩大類［6］。最初的葉綠素?zé)晒鉁y量儀器主要是微光纖點式熒光儀（例如，德國Walz 公司的Dual-PAM 系統(tǒng)熒光儀和英國Hansatech 公司的FMS 系統(tǒng)熒光儀等），只能測定葉片局部某一點的葉綠素?zé)晒庵?，提供了葉片一個特定位置的熒光信息。由于葉片存在光合異質(zhì)性，葉片水平方向上不同部位的光合能力和葉綠素?zé)晒庵挡⒉灰恢拢?］。因此，測定葉片局部熒光值的方法雖然能在一定程度上反映葉片的光合性能，但并不能代表葉片的整體情況，無法正確地評估全葉的光合特性［5］。

隨著葉綠素?zé)晒獬上駜x器的出現(xiàn)，葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)克服了傳統(tǒng)的點式熒光儀有限點測量的缺陷，可以獲得植物全葉的葉綠素?zé)晒庑盘?，從而得以分析熒光?qiáng)度在葉片的分布情況，為葉片光合異質(zhì)性的研究提供了更方便快捷的應(yīng)用［2，7］。德國Walz 公司研制的ImagingPAM 系列成像系統(tǒng)為葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)的應(yīng)用提供了良好的測量儀器，目前有關(guān)葉綠素?zé)晒獬上裱芯康奈墨I(xiàn)大多為采用該系列儀器。然而，研究者利用熒光成像技術(shù)開展的研究并未完全挖掘出葉片葉綠素?zé)晒獬上袼@取的信息。首先，大多數(shù)研究直接利用軟件獲得局部AOI（Area of Interest）的熒光值，并不能代表葉片整體情況；其次，研究者大多采用熒光參數(shù)平均值進(jìn)行分析，不能反映葉片光合異質(zhì)性。

目前，利用葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)研究葉片光合異質(zhì)性主要有以下4種方法：①通過比較葉片不同部位代表熒光值大小的顏色差異，定性判斷葉片光合特性的異質(zhì)性［5，8］，這種方法只能定性比較而無法定量分析；②利用ImagingPAM 葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng)的操作軟件ImagingWin的Transect功能，獲取熒光成像圖橫斷面，并利用變異系數(shù)（CV）表示異質(zhì)性程度［9］，這種方法只能觀察到橫斷面范圍內(nèi)的熒光異質(zhì)性，并不是全葉比較，且不能進(jìn)行不同葉片間的比較；③對葉片不同部位分別選擇同等大小的AOI，通過比較不同部位AOI的熒光值來比較分析葉片熒光異質(zhì)性［2，5］，這種方法由于AOI選擇的局限性，無法做到對全葉異質(zhì)性的定量分析；④通過開發(fā)圖像提取分析技術(shù)［10-12］，對原始熒光成像圖進(jìn)行再分析，實現(xiàn)熒光參數(shù)值的空間分布和數(shù)值的定量分析，這種方法由于具有較強(qiáng)的圖形處理專業(yè)性而較少為廣大研究者所采用。

事實上，ImagingPAM 熒光成像記錄了熒光成像圖中所有像素點的各熒光參數(shù)熒光值（熒光參數(shù)熒光值指的是某熒光參數(shù)的熒光數(shù)值，其記錄范圍為0～1），通過操作軟件ImagingWin 可以獲取各熒光參數(shù)的每個熒光值所占面積，通過比較其面積占葉片總面積的比例，可以定量分析葉片光合異質(zhì)性，并進(jìn)行不同葉片光合性能的差異比較。遺憾的是，我們未能檢索到相關(guān)分析方法的文獻(xiàn)。本研究基于ImagingPAM 熒光成像技術(shù)（以德國Walz 公司生產(chǎn)的MAXI-IMAGING-PAM 為研究儀器）就植物葉片光合異質(zhì)性定量分析方法作一探討，并進(jìn)行驗證。

1 與異質(zhì)性定量分析相關(guān)的ImagingWin軟件功能

MAXI-IMAGING-PAM 的成像面積為10 cm×13 cm，共有640×480（即307200）個像素點，成像窗口（Image 窗口）內(nèi)每一個像素點所包含的熒光信息均被記錄下來。由于葉片并未完全覆蓋儀器成像窗口，并且葉片上可能存在因病蟲害或環(huán)境脅迫而產(chǎn)生的壞死組織，因此熒光成像圖包含空白區(qū)域、葉片中能激發(fā)熒光的活體區(qū)域和不能激發(fā)熒光的壞死區(qū)域。在熒光參數(shù)異質(zhì)性定量分析中，通過ImagingWin v2.47 軟件中的AOI 選擇和Report 功能估算葉片總面積、活體組織面積和壞死組織面積等參數(shù)。其次，利用ImagingWin 軟件中的Analysis 功能獲取該熒光參數(shù)所有熒光值在葉片上所占面積情況。

1.1 AOI功能

研究者可通過AOI 功能選擇葉片中的研究區(qū)域，通過Report 功能將AOI 區(qū)域內(nèi)的熒光信息輸出。儀器提供了3 種AOI 區(qū)域選擇方案：①Circle（圓形），區(qū)域大小可自主調(diào)整；②Rectangle（矩形），區(qū)域大小可自主調(diào)整；③Polygon（多邊形），通過連續(xù)設(shè)置多邊形點連接成任意形狀。在成像窗口選擇NIR 圖像類型，采用Polygon 方式沿著葉片邊緣選擇AOI 區(qū)域，使之與樣本葉片邊緣盡量重合，可獲得全葉AOI區(qū)域。

1.2 Report功能

利用Report 功能可導(dǎo)出AOI 范圍內(nèi)PSⅡ最大光化學(xué)效率Fv/Fm、Y（Ⅱ）、Y（NPQ）、Y（NO）、非光化學(xué)猝滅（NPQ/4）、光化學(xué)猝滅（qP）等熒光參數(shù)平均值和各熒光參數(shù)Size 值。Size 值為AOI 中各熒光參數(shù)的像素值，配合Options 菜單中選擇或不選擇Mean over AOI 功能，分別獲得以下2種類型的Size數(shù)值。

①Options 菜單中選擇Mean over AOI 功能后，通過Report 導(dǎo)出的熒光值為AOI 范圍內(nèi)所有區(qū)域（包括葉片中能夠激發(fā)出熒光的活體組織和不能激發(fā)出熒光的壞死組織）熒光參數(shù)的熒光平均值。該狀態(tài)下各熒光參數(shù)的Size 值是一致的，為AOI總面積，即包含葉片內(nèi)活體組織和壞死組織在內(nèi)的AOI總面積像素值。

②Options 菜單不選擇Mean over AOI 功能，通過Report 導(dǎo)出的熒光值為AOI 范圍內(nèi)能激發(fā)出熒光的活體組織的各熒光參數(shù)的熒光平均值；而各熒光參數(shù)Size 值則為AOI 范圍內(nèi)該熒光參數(shù)能夠激發(fā)出熒光的活體組織的像素值，其中Fv/Fm參數(shù)的Size 值最大，可估算為AOI 中能激發(fā)出熒光的活體組織面積，即活體面積。

1.3 Analysis功能

在成像窗口選擇Analysis功能，通過設(shè)置某熒光參數(shù)的熒光值下限（Low）和上限（High），可讀取Red Pixel Assessment 中的Number 值（像素值）和Area值（單位為mm2的面積值），這2個值代表了該熒光參數(shù)熒光值在Low-High 區(qū)間的總面積，其軟件設(shè)置的相鄰兩個值之間的最小精度為0.004（少數(shù)為0.003）。為了與Report導(dǎo)出的Size值相統(tǒng)一，統(tǒng)一采用Number 值進(jìn)行分析。利用Analysis 功能，可以讀取該參數(shù)熒光值在所測葉片中分布相關(guān)的面積數(shù)據(jù)。

1.4 幾個面積參數(shù)的定義和估算

根據(jù)上述軟件功能，采用Polygon 方式在NIR圖像類型下，沿著葉片邊緣選擇AOI 區(qū)域，使之與樣本葉片邊緣盡量重合，獲得全葉AOI 區(qū)域。充分考慮葉片中未被選擇進(jìn)AOI 區(qū)域的能夠激發(fā)熒光的活體部分面積，并基于葉片邊緣未被選擇進(jìn)入AOI 區(qū)域且不產(chǎn)生熒光的壞死組織葉面積可忽略不計的假設(shè)，定義并估算以下幾個面積參數(shù)：

①成像窗口總面積（STotal）：根據(jù)儀器說明書，STotal為307200（像素）。

②葉片中不能激發(fā)熒光的壞死面積（SLN）：首先，利用Opions 菜單中選擇Mean over AOI 選項，Report窗口讀取Fv/Fm熒光參數(shù)Size值（SMOA+），該值即為AOI 總面積；然后再利用Opions 菜單中不選擇Mean over AOI 選項，Report 窗口讀取Fv/Fm熒光參數(shù)Size值（SMOA-），該值為AOI區(qū)域內(nèi)能夠激發(fā)熒光的活體面積；將AOI總面積（SMOA+）減去活體面積（SMOA-），即可得到壞死面積（SLN）；即SLN=SMOA+-SMOA-。

③葉片中能激發(fā)熒光的活體面積（SFlu）：考慮到上述Polygon 方式獲取全葉AOI 時，葉片邊緣可能會有未被選擇進(jìn)入AOI 區(qū)域的能夠激發(fā)熒光的活體部分，為此采用Rectangle 或Polygon 方式將全葉整體完全選擇進(jìn)入AOI區(qū)域，Opions菜單中不選擇Mean over AOI 選項，Report 窗口讀取Fv/Fm熒光參數(shù)Size值即為SFlu。

（4）葉片面積（SLeaf）：即葉片中能夠激發(fā)熒光的活體面積（SFlu）與不能激發(fā)熒光的壞死面積（SLN）之和；SLeaf=SFlu+SLN=SFlu+SMOA+-SMOA-。

⑤成像窗口中非葉片的空白區(qū)域面積（SBlank）：即成像窗口總面積（STotal）減去葉片面積（SLeaf）；SBlank=STotal-SLeaf=307200-SLeaf=307200-（SFlu+SMOA+-SMOA-）。

⑥熒光參數(shù)熒光值在0～t區(qū)間內(nèi)的總面積（Size of the fluorescence value range from 0 tot，St）：即某參數(shù)熒光值在0～t區(qū)間內(nèi)的總面積。利用Analysis 功能，將某參數(shù)熒光值下限（Low）設(shè)定為0，上限（High）設(shè)定為t，可獲取一個Number 值，記為Nt；由于Analysis 分析是以成像窗口（包括無葉片區(qū)域）為對象開展的，且除Y（NO）外的其他熒光參數(shù)（例如Fv/Fm）成像窗口中無葉片區(qū)域的熒光值為0，因此這些參數(shù)的St=Nt-SBlank；Y（NO）參數(shù)成像窗口中無葉片區(qū)域的熒光值為1，因此Y（NO）的St=Nt，但S1=N1-SBlank。

⑦熒光參數(shù)熒光值在（t-α）～t區(qū)間內(nèi)的面積（Size of the fluorescence value range from（t-α）tot，ΔSt）：ΔSt=St-S（t-α），α值可根據(jù)研究的實際需要確定，如α可確定為儀器軟件最小精度0.004，也可在不影響試驗結(jié)果的前提下確定為0.04 以減少讀取數(shù)據(jù)的工作量，本研究將對α值大小對試驗結(jié)果的影響作一分析。

2 異質(zhì)性參數(shù)的定義與計算方法

基于上述方法獲取的面積參數(shù)，定義了以下幾個異質(zhì)性參數(shù)及其計算方法，研究者可依據(jù)研究需要自行定義其他異質(zhì)性定量分析參數(shù)。

①變異系數(shù)（Coefficient of variation，CV）：由上述⑦可以獲取葉片各熒光參數(shù)從0～1 范圍內(nèi)的所有熒光值及其所占面積（即像素點數(shù)量），以全葉所有像素點的熒光參數(shù)熒光值為總樣本計算該熒光參數(shù)的變異系數(shù)：

式中：σ為全葉所有熒光參數(shù)值的標(biāo)準(zhǔn)差，μ為所有熒光參數(shù)值的平均值。

②葉片壞死率（Proportion of leaf necrosis，PLN）：葉片中不能激發(fā)熒光的壞死面積（SLN）占葉片面積（SLeaf）的比例。

③熒光參數(shù)熒光值的相對面積（Relative size of the fluorescence value，RSt）：由于不同樣本的葉片面積不一致，因此，將熒光參數(shù)熒光值在0～t區(qū)間內(nèi)的面積（St）除以葉片面積（SLeaf）進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，標(biāo)準(zhǔn)化后的相對面積可進(jìn)行不同處理間葉片的直接比較。

④熒光參數(shù)熒光值在（t-α）～t區(qū)間內(nèi)的面積占葉片面積的比例（Proportion of leaf size in the flu?orescence value range from（t-α）tot，PΔSt）：

3 葉片光合異質(zhì)性定量分析的應(yīng)用

3.1 材料與方法

3.1.1 試驗材料

試驗于2020 年2 月在井岡山大學(xué)進(jìn)行，選擇生長于全光照環(huán)境下，栽培時間長于5年的常綠闊葉植物小葉榕（Ficus microcarpa）成年樹為供試材料。于上午10：00 選擇樹冠外側(cè)陽生葉和樹冠內(nèi)部的陰生葉，帶枝剪下插入水中帶回實驗室進(jìn)行葉綠素?zé)晒獬上駵y定。試驗期間為連續(xù)晴天，夜間最低溫度范圍為1～3 ℃，日最高溫度滿園13～15 ℃，陽生葉環(huán)境午間最大光強(qiáng)約1 500 μmol·m-2·s-1，陰生葉環(huán)境光強(qiáng)約100～200 μmol·m-2·s-1。

3.1.2 試驗方法

按照IMAGING-PAM 操作手冊，采用調(diào)制式IMAGING-PAM 葉綠素?zé)晒鈨x（Walz，德國）進(jìn)行全葉葉綠素?zé)晒獬上駵y定。選取陽生葉和陰生葉各3片，置于IMAG-MAX/GS支架上，并用黑布遮光暗處理30 min，設(shè)置光化光（Actinic light）強(qiáng)度為281 μmol·m-2·s-1，選擇Kinetics 模式，進(jìn)行葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)曲線（持續(xù)260 s）的測定，并導(dǎo)出熒光成像源文件（pim 格式），利用ImagingWin v2.47 軟件導(dǎo)出Fv/Fm、Y（Ⅱ）、Y（NPQ）、Y（NO）等熒光參數(shù)。經(jīng)260 s光化光誘導(dǎo)，植物葉片熒光曲線已平滑，因此選擇誘導(dǎo)曲線最后一次測得的熒光數(shù)據(jù)進(jìn)行異質(zhì)性定量分析。以Fv/Fm參數(shù)的分析為例來說明葉片熒光參數(shù)異質(zhì)性定量分析的應(yīng)用，其他熒光參數(shù)異質(zhì)性分析方法與Fv/Fm類似。

3.1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

利用PASW Statistics18 數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行試驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計檢驗，采用獨立樣本t檢驗分析陽生葉和陰生葉之間的差異性，當(dāng)P<0.05 時認(rèn)為差異顯著。所列數(shù)據(jù)均為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差，n=3。圖表中不同字母表示在5%水平上陽生葉和陰生葉間具有顯著性差異。

3.2 結(jié)果分析與討論

3.2.1 葉片F(xiàn)v/Fm的異質(zhì)性

圖1 是實驗中其中一片陽生葉和陰生葉的Fv/Fm熒光成像圖。由圖1 可知，小葉榕同一葉片不同部位代表Fv/Fm值大小的顏色并不均勻，說明其熒光參數(shù)Fv/Fm具有異質(zhì)性。相對陰生葉而言，陽生葉不同部位的顏色相差更大，且葉尖處存在壞死區(qū)域，無法檢測出熒光。采用Circle方式獲取的同一葉片顏色差異大的兩個AOI區(qū)域和采用Poly?gon 方式獲取全葉AOI 的Fv/Fm值，陽生葉全葉的Fv/Fm為0.617，葉脈兩側(cè)AOI 的Fv/Fm分別為0.675和0.593；陰生葉全葉和葉脈兩側(cè)AOI的Fv/Fm分別為0.692，0.663和0.702。由此可見，隨機(jī)選擇葉片某一部位設(shè)置AOI 所采集的熒光值并不能代表全葉的整體熒光特性。因此，有必要采用全葉作為AOI 來評價葉片的總體熒光特性，并且也需要有恰當(dāng)?shù)闹笜?biāo)來定量分析葉片受傷害程度（如：致死程度與光抑制程度）和熒光特性的異質(zhì)性。表1結(jié)果也顯示，越冬期低溫強(qiáng)光導(dǎo)致小葉榕陽生葉Fv/Fm異質(zhì)性（CV=0.239）顯著高于陰生葉（CV=0.076）；采用ImagingWin 軟件中最小精度間隔區(qū)間（α=0.004）和自定義間隔區(qū)間（α=0.02和0.04）所讀取的數(shù)據(jù)，計算得出的CV值并沒有明顯差異。

表1 越冬期小葉榕陽生葉和陰生葉PSⅡ最大光化學(xué)效率（Fv/Fm）的變異系數(shù)（CV）Table 1 Coefficient of variation（CV）of the maximal PSⅡquantum yield（Fv/Fm）of sun-leaf and shadeleaf in F.microcarpa during overwintering

3.2.2 葉片F(xiàn)v/Fm和壞死率

越冬期的小葉榕陽生葉全葉Fv/Fm為0.613，低于陰生葉的0.712，兩者間存在顯著差異（見圖2）。通過熒光圖像（見圖1）我們可以發(fā)現(xiàn)陽生葉葉尖處有無法檢測出熒光的壞死部分，而陰生葉則難以判斷是否存在壞死部分。根據(jù)我們的方法計算得出，陽生葉的PLN為4.3%，明顯高于陰生葉的0.2%（見圖2）。這意味著越冬期低溫強(qiáng)光對小葉榕陽生葉造成了破壞性傷害，而弱光環(huán)境下低溫雖然也導(dǎo)致了光抑制的發(fā)生，但并未造成不可逆的傷害，并且光異質(zhì)程度越大的葉片其光合異質(zhì)性也越大。我們以前的研究結(jié)果也表明秋季夜間低溫后次日強(qiáng)光照導(dǎo)致小葉榕葉片光合機(jī)構(gòu)發(fā)生破壞性傷害，而遮陰條件下葉片僅發(fā)生可逆光抑制［13］。由于病蟲害和重度非生物脅迫會導(dǎo)致葉片組織壞死，葉片壞死率可作為評價葉片受病蟲害和非生物脅迫傷害程度的有效指標(biāo)。

圖1 越冬期小葉榕陽生葉和陰生葉PSⅡ最大光化學(xué)效率（Fv/Fm）的異質(zhì)性Fig.1 The heterogeneity of the maximal PSⅡquantum yield（Fv/Fm）of sun-leaf and shade-leaf in F. microcarpa during overwintering

圖2 越冬期小葉榕陽生葉和陰生葉的PSII 最大光化學(xué)效率（Fv/Fm）和壞死率（PLN）圖中不同字母表示陽生葉和陰生葉之間差異顯著（P<0.05）；下同F(xiàn)ig.2 The maximal PSII quantum yield（Fv/Fm）and proportion of leaf necrosis（PLN）of sun-leaf and shade-leaf in F.microcarpa during overwintering Different letters indicate significant difference（sP<0.05）between sunleaf and shade-leaf；The same as below

3.2.3 葉片F(xiàn)v/Fm熒光值的分布特征

為了更好地定量分析葉片F(xiàn)v/Fm熒光值的分布特征，我們計算了葉片F(xiàn)v/Fm熒光值的分布區(qū)間及其特征。圖3 是標(biāo)準(zhǔn)化后的Fv/Fm熒光值相對面積圖（RSt-Fv/Fm）。由圖3 可知，陽生葉存在一定比例的Fv/Fm=0 區(qū)域面積（即葉片組織壞死），而陰生葉則基本上所有區(qū)域均能測到Fv/Fm熒光值。與陰生葉相比，陽生葉Fv/Fm熒光值變化區(qū)域范圍相對較大，且主要分布在低值區(qū)域。這表明，冬季陽光照射導(dǎo)致陽生葉部分壞死和葉片光抑制程度的加劇，其異質(zhì)性高于陰生葉。

圖3 越冬期小葉榕陽生葉和陰生葉的相對面積（RSt）對PSⅡ最大光化學(xué)效率（Fv/Fm）的曲線（RSt-Fv/Fm）Fig.3 Curves of relative size（RSt）and the maximal PSⅡquantum yield（Fv/Fm）of sun-leaf and shade-leaf in F.microcarpa during overwintering（RSt-Fv/Fm）

我們采用α=0.004、0.02 和0.04，分別對Fv/Fm熒光值在（t-α）～t區(qū)間內(nèi)的面積占葉片面積的比例作圖（PΔSt-Fv/Fm，見圖4）。由圖4 可知，陽生葉PΔSt最大值（PΔStmax）的Fv/Fm熒光值均明顯低于陰生葉，PΔSt發(fā)生明顯變化的Fv/Fm起始值也顯著低于陰生葉，但兩者PΔSt趨于0的Fv/Fm最大值沒有明顯差異。這表明3 種精度間隔區(qū)間的PΔSt-Fv/Fm圖均體現(xiàn)了陽生葉光抑制程度比陰生葉要高，其Fv/Fm異質(zhì)性也大于陰生葉。但是，由于最小精度間隔區(qū)間（α=0.004）過小，導(dǎo)致部分相鄰區(qū)間PΔSt呈現(xiàn)較大波動，不利于分析。而采用熒光值間距為0.02和0.04 的自定義間隔區(qū)間則有效地解決了這一問題，并且極大地減少了采集數(shù)據(jù)的工作量，因此，研究者可以根據(jù)實際需要確定熒光值的間隔區(qū)間（α）的大小。

圖4 越冬期小葉榕陽生葉和陰生葉PSⅡ最大光化學(xué)效率（Fv/Fm）的分布比例Fig.4 Distribution proportion of leaf size in the maximal PSⅡquantum yield（Fv/Fm）of sun-leaf and shadeleaf in F.microcarpa during overwintering

根據(jù)制作PΔSt-Fv/Fm圖的原始數(shù)據(jù)，對Fv/Fm熒光值的分布特性作了分析（見表2）。采用α=0.004、0.02 和0.04 三種間隔區(qū)間分析并未影響PΔStmax下Fv/Fm熒光值的大小，只影響了其所占面積的比例。但α=0.004 時，由于部分相鄰區(qū)間ΔSt呈現(xiàn)波動導(dǎo)致PΔSt>1 呈現(xiàn)為非連續(xù)區(qū)間（見圖4）。而采用α=0.02 和0.04 間隔區(qū)間則較好地解決了這個問題。并且在α=0.02 和0.04 間隔區(qū)間下，陽生葉PΔSt>1 連續(xù)區(qū)間的Fv/Fm起始值均為0.510，低于陰生葉的0.627；其Fv/Fm最大值除α=0.02 時陽生葉為0.745 外，其余的均為0.784；且所占葉片面積比例均高達(dá)90%以上。當(dāng)α=0.02時，陽生葉PΔSt>10 呈現(xiàn)非連續(xù)區(qū)間；而當(dāng)α=0.04時，陽生葉PΔSt>10 的連續(xù)區(qū)間為0.549～0.706，其所占面積為65.2%，陰生葉的連續(xù)區(qū)間則為0.667～0.784，所占面積為93.5%。因此，對于本研究而言，采用α=0.04，分析PΔSt>10 的Fv/Fm連續(xù)區(qū)間范圍，能夠較好地體現(xiàn)陽生葉和陰生葉Fv/Fm值的分布特征。

表2 越冬期小葉榕陽生葉和陰生葉PSⅡ最大光化學(xué)效率（Fv/Fm）的分布特性Table 2 Distribution characteristics of the maximal PSⅡquantum yield（Fv/Fm）of sun-leaf and shade-leaf in F. micro‐carpa during overwintering

Fv/Fm值的大小可以反映植物葉片受光抑制的程度，沒有遭受環(huán)境脅迫的植物葉片F(xiàn)v/Fm一般在0.80～0.85［14-15］。由于越冬期小葉榕的陰生葉光抑制程度較輕，本研究中陰生葉Fv/Fm熒光值主要分布在0.627～0.784（96.3%）。為此，我們定義Fv/Fm=0為壞死區(qū)，0

3.2.4 其他熒光參數(shù)異質(zhì)性的定量分析

根據(jù)上述Fv/Fm異質(zhì)性定量分析方法，我們對Y（Ⅱ）、Y（NPQ）、Y（NO）作了簡單分析。結(jié)果表明，陽生葉Y（Ⅱ）的CV（1.128）雖然低于陰生葉的CV（3.015），但兩者間并沒有顯著差異（P>0.05）；陽生葉Y（NPQ）和Y（NO）的CV分別為0.362和0.413，均顯著高于陰生葉的0.149和0.276（P<0.05）（見表3）。

表3 越冬期小葉榕陽生葉和陰生葉PSⅡ的實際光合效率（Y（Ⅱ））、調(diào)節(jié)性能量耗散的量子產(chǎn)額（Y（NPQ））和非調(diào)節(jié)性能量耗散的量子產(chǎn)額（Y（NO））α=0.04的變異系數(shù)（CV）和分布特性（n=3）Table 3 Coefficient of variation（CV）and distribution characteristics of effective PSⅡquantum yield（Y（Ⅱ）），quantum yield of regulated energy dissipation（Y（NPQ））and quantum yield of non-regulated energy dissipation（Y（NO））at α=0.04 for sun-leaf and shade-leaf in F.microcarpa during overwintering（n=3）

由圖5 和表3 可知，越冬期小葉榕陽生葉和陰生葉的Y（Ⅱ）均較低，分別為0.141 和0.010，兩者間具有顯著差異（P<0.05）。雖然陽生葉Y（Ⅱ）的CV僅為陰生葉CV的37.4%，但兩者間沒有顯著差異，究其原因與低溫脅迫下陽生葉和陰生葉的Y（Ⅱ）均很低有關(guān)，因此，低溫脅迫下Y（Ⅱ）的異質(zhì)性并不是一個能夠恰當(dāng)評價葉片光合異質(zhì)性的參數(shù)。進(jìn)一步分析，陽生葉Y（Ⅱ）=0 的面積低于陰生葉，而PΔStmax熒光值、PΔSt>1和10的連續(xù)區(qū)間范圍及其面積比例均明顯高于陰生葉。這意味著雖然冬季低溫顯著抑制了小葉榕葉片的光化學(xué)能力，但處于強(qiáng)光環(huán)境下的陽生葉仍保持有一定的光化學(xué)能力，而弱光環(huán)境下的陰生葉光化學(xué)能力基本上被低溫所抑制。

圖5 越冬期小葉榕陽生葉和陰生葉的熒光參數(shù)熒光值，相對面積對熒光參數(shù)的曲線（RST-Parameter）和熒光參數(shù)的分布比例（PΔSt）對PSⅡ的實際光合效率（Y（Ⅱ））、調(diào)節(jié)性能量耗散的量子產(chǎn)額（Y（NPQ））和非調(diào)節(jié)性能量耗散的量子產(chǎn)額（Y（NO））的曲線Fig.5 Values of fluorescence parameters，curves of relative size and the fluorescence parameter（RST-Parameter），and distribution proportion of leaf size in the fluorescence parameter（PΔSt-Parameter）of sun-leaf and shade-leaf in F.microcarpa during overwintering.Fluorescence parameters include effective PSII quantum yield（Y（Ⅱ）），quantum yield of regulated energy dissipation（Y（NPQ））and quantum yield of non-regulated energy dissipation（Y（NO））

相對陽生葉而言，陰生葉具有相對較高的Y（NPQ），PΔStmax熒光值、PΔSt>1 和10 的連續(xù)區(qū)間范圍及其面積比例也顯著高于陽生葉，且葉片中Y（NPQ）=0 的面積明顯低于陽生葉。由此可見，相對陽生葉而言，小葉榕陰生葉具有較強(qiáng)的熱耗散能力，這是陰生環(huán)境下小葉榕葉片僅發(fā)生可逆光抑制而非造成葉片光合機(jī)構(gòu)破壞的重要機(jī)制。

由Y（NO）熒光值的分布特征可知，陽生葉有7.5% 的 葉 片 組 織Y（NO）=1，減 去 葉 片 壞 死 率4.3%，還有3.2%的葉片遭受強(qiáng)光脅迫并存在潛在的壞死風(fēng)險。陽生葉Y（NO）的PΔStmax熒光值和PΔSt>10的連續(xù)區(qū)間范圍均高于陰生葉；但是，兩種葉片PΔSt>1 的連續(xù)區(qū)間范圍均由0.235 起始，在低值區(qū)域重疊，這表明陽生葉也具有一定比例的葉片處于低激發(fā)壓區(qū)域。由于越冬期陰生葉并未遭受強(qiáng)光傷害，因此，如陰生葉PΔSt>10 的上限值（0.314）為低風(fēng)險區(qū)上限值，那么有24.6%的陽生葉Y（NO）處于低風(fēng)險區(qū)（0～0.314），陰生葉則高達(dá)83.8%（數(shù)據(jù)未列出）。這表明越冬期強(qiáng)光雖然會導(dǎo)致小葉榕陽生葉嚴(yán)重的激發(fā)壓積累存在嚴(yán)重傷害的潛在風(fēng)險，但葉片中存在一定面積低激發(fā)壓的低風(fēng)險區(qū)；而處于低溫弱光下的陰生葉則主要以低風(fēng)險區(qū)為主，低溫并未引起陰生葉光合機(jī)構(gòu)嚴(yán)重傷害的風(fēng)險。由此可見，種植于陰生環(huán)境下更有利于亞熱帶地區(qū)的小葉榕順利越冬。

4 結(jié)論

通過上述對小葉榕陽生葉和陰生葉熒光成像結(jié)果及相關(guān)熒光參數(shù)熒光值的異質(zhì)性和分布特征分析，我們可以得出：

①熒光參數(shù)的變異系數(shù)（CV）可作為葉片光合異質(zhì)性的定量指標(biāo)，冬季低溫強(qiáng)光導(dǎo)致小葉榕陽生葉的光合異質(zhì)性高于陰生葉，表現(xiàn)為除Y（Ⅱ）外的其他熒光參數(shù)Fv/Fm、Y（NPQ）和Y（NO）的異質(zhì)性均顯著高于陰生葉。

②熒光參數(shù)熒光值的分布比例曲線（PΔSt-Para）及其計算得出的相關(guān)分布特征值可定量分析熒光參數(shù)在葉片上的分布特征，并可進(jìn)行不同葉片間的相互比較，從而有助于量化分析比較植物光合特性對環(huán)境的適應(yīng)性。

③冬季低溫強(qiáng)光造成陽生葉部分組織壞死和處于重度光抑制脅迫，這意味著小葉榕作為冷敏感植物極易受到低溫傷害，并不適宜亞熱帶地區(qū)栽培；但陽生葉仍有較大面積的葉組織處于輕度光抑制和低激發(fā)壓狀態(tài)，這可能是小葉榕能夠在亞熱帶地區(qū)暖冬時順利越冬的主要原因。冬季低溫雖然造成弱光環(huán)境下的陰生葉較大面積的輕度光抑制，但陰生葉具有相對較高的熱耗散能力，葉片基本未遭受壞死性傷害和重度光抑制，這表明亞熱帶地區(qū)的小葉榕種植在陰生環(huán)境下有利于越冬。

綜上所述，基于葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)從全葉水平上定量分析葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)熒光值的分布特征，可以定量分析葉片的熒光參數(shù)異質(zhì)性，并實現(xiàn)不同葉片之間光合異質(zhì)性的定量比較，在逆境脅迫下植物葉片光合異質(zhì)性的研究中具有廣泛的應(yīng)用前景。