白 潔 周 濤 馬 江 劉 文 姜治國 陳發(fā)菊*

（1. 三峽大學(xué)生物技術(shù)研究中心，宜昌 443002；2. 神農(nóng)架國家公園管理局神農(nóng)架金絲猴保育生物學(xué)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，神家架林區(qū)

442421）

三葉木通（Akebia trifoliata）隸屬于木通科（Lardizabalaceae）木通屬（Akebia），是一種木質(zhì)藤本植物，同時也是藥食兩用植物。三葉木通原產(chǎn)于中國和日本，在我國主要分布于秦嶺或長江以南各省區(qū)［1-2］。三葉木通全株均可入藥，療效獨(dú)特，應(yīng)用廣泛，具有利尿、鎮(zhèn)痛、祛風(fēng)濕、抑制炎癥、抗衰老、抗疲勞、提高免疫力、抑制腫瘤和降血脂等療效［3］，常用作地方入藥，其歷史悠久，記載于民間傳統(tǒng)中草藥［4］，干燥的藤莖和果實(shí)作為藥用正品收錄于《中國藥典》2020 版（https：//www.chp.org.cn/）。三葉木通果實(shí)又稱八月瓜、八月札、八月炸、九月炸、北方土香蕉、預(yù)知子等［5］，其果肉白色滑嫩，富含糖、維生素C和12種氨基酸，屬于第三代保健型水果，具備優(yōu)良的應(yīng)用價值和開發(fā)前景［6］。

植物生殖生物學(xué)研究對象是整個有性生殖過程，由植物胚胎學(xué)演化而來，與之相關(guān)的過程包括花芽分化、雌雄性器官的發(fā)育、傳粉受精以及胚胎發(fā)育等方面［7］。木通科生殖生物學(xué)的研究，最早始于對木通科演化進(jìn)化軌跡進(jìn)行分類系統(tǒng)學(xué)的研究［8］，有關(guān)木通科大血藤屬（Sargentodoxa）［9-10］、貓兒屎屬（Decaisnea）［11］和串果藤屬（Sinofranchetia）［12］植物的大小孢子發(fā)生及雌雄配子體發(fā)育研究已經(jīng)積累了比較詳細(xì)的胚胎學(xué)資料。植物生殖發(fā)育過程任一環(huán)節(jié)出現(xiàn)異常都顯著影響其植物生殖的有效性，進(jìn)而引發(fā)其自我更新過程受阻等問題［13］。生殖發(fā)育過程中的異?，F(xiàn)象主要表現(xiàn)在受精前生殖細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的發(fā)育異常，從而導(dǎo)致花粉和胚囊的敗育，進(jìn)而可能影響其傳粉受精，這是植物結(jié)實(shí)率低的重要致因之一［14-15］。

三葉木通花多果少，結(jié)實(shí)率低，其果皮普遍較厚，種子多，可食率低，果實(shí)成熟開裂不耐儲藏等特點(diǎn)，嚴(yán)重限制其藥用和食用產(chǎn)業(yè)化的發(fā)展［16-17］。

因此，提高三葉木通產(chǎn)量，培育出結(jié)實(shí)率高、品質(zhì)好、可食率高的優(yōu)良品種是亟待解決的問題。目前，國內(nèi)外對三葉木通的研究主要集中在化學(xué)成分與藥理作用［18］、組織培養(yǎng)［19］、分子標(biāo)記技術(shù)［20］以及花和果實(shí)發(fā)育相關(guān)基因［21-22］等方面。然而，植物結(jié)實(shí)率與大、小孢子發(fā)生和雌、雄配子體的發(fā)育密切相關(guān)。三葉木通大小孢子發(fā)生及雌雄配子體發(fā)育鮮見報道，鑒于此，本文利用石蠟切片方法，觀察三葉木通的大、小孢子發(fā)生及雌、雄配子體發(fā)育過程中胚胎學(xué)特征，明確雌花中雄蕊和雄花中心皮發(fā)生退化的關(guān)鍵時期，以期了解三葉木通有性生殖過程，分析該物種自然條件下結(jié)實(shí)率低的生殖原因，并為后續(xù)進(jìn)行雜交育種和新品種培育提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

野生三葉木通采自湖北省神農(nóng)架國家公園木魚鎮(zhèn)官門山，地理坐標(biāo)為31°26'56″N，110°23'59″E。于2020 年1 月花芽分化初期至5 月初開花期間不同時期取樣，將不同發(fā)育時期的三葉木通早期花芽和雌雄花材料于FAA 固定液（70%乙醇90 mL、冰醋酸5 mL、38%甲醛溶液5 mL）中固定，帶回實(shí)驗(yàn)室置于冰箱中4 ℃保存?zhèn)溆茫捎檬炃衅椒?，將固定好的材料放在解剖鏡下用解剖針小心分離出雌雄蕊，依次通過（80%、85%、90%、95%、100%、100%）乙醇梯度脫水，每級2 h；依次經(jīng)過1/2 二甲苯+1/2 乙醇、純二甲苯、純二甲苯透明，每級2 h，60 ℃下用液體純蠟浸蠟12 h，每4 h 換1 次新蠟后，進(jìn)行包埋，用Leica RM2125RT 切片機(jī)對包埋塊進(jìn)行連續(xù)切片，切片厚度8 μm；依次經(jīng)展片、脫蠟、復(fù)水后，采用番紅-固綠（Safranin-Fast Green）對染法進(jìn)行染色，通過（95%、95%、100%、100%）乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片；用Leica DMR 多功能顯微鏡及測量系統(tǒng)觀察拍照。

取散粉期花粉，經(jīng)乙醇復(fù)水處理，用10%無水亞硫酸鈉在沸水中軟化1 h、水洗、苯胺藍(lán)染色制片，用舜宇RX50 熒光顯微鏡下觀察花粉的形態(tài)特征。

2 結(jié)果與分析

三葉木通為雌雄同株，單性花，總狀花序，長10～12 cm，基部為1～2 朵雌花，上部為30～50 朵雄花（圖版Ⅰ：A）。雄花具苞片4 枚，雄蕊6 枚，花托上呈單輪排列，成熟花藥具2條縱溝，縱向開裂，雄花中退化心皮3～5 枚，位于花托中央，小而細(xì)長（圖版Ⅰ：B）。雌花2 朵，位于花序軸基部，苞片4枚，每朵雌花中有離生雌蕊4～6 枚，柱頭、花柱和子房發(fā)育正常，花柱極短，雌花中退化的雄蕊位于子房基部，極?。▓D版Ⅰ：C）。

圖版Ⅰ 三葉木通的花序、雄花和雌花特征A.總狀花序，示基部為2朵雌花（黑箭頭所示），上部雄花（紅箭頭所示）；B.雄花的形態(tài)，示雄蕊（st）與敗育的心皮（ca）；C.雌花的形態(tài)，示雌蕊（pi）與退化的雄蕊（se）PlateⅠ Floral morphology of A.trifoliata A.Raceme，showing 2 female flowers at the base and male flowers at the upper part；B.Male flower morphology，showing stamens and aborted carpel；C.Female flower morphology，showing pistils and staminode

2.1 小孢子發(fā)生和雄配子體發(fā)育

2.1.1 花藥壁發(fā)育

三葉木通雄花具有雄蕊6 枚，每枚雄蕊具4 個小孢子囊，兩側(cè)小孢子囊由藥隔相連，藥隔由薄壁細(xì)胞和維管束組成（圖版Ⅱ：A）。花藥原基最外層有一層表皮細(xì)胞，表皮以內(nèi)4個角隅處形成孢原細(xì)胞（圖版Ⅱ：B）。表皮下的一個孢原細(xì)胞經(jīng)過1 次平周分裂，形成內(nèi)外2層子細(xì)胞，向外為周緣細(xì)胞，即初生壁細(xì)胞，向內(nèi)生成體積較大的初生造孢細(xì)胞，初生壁細(xì)胞再進(jìn)行平周和垂周分裂，由外向內(nèi)產(chǎn)生4～5層細(xì)胞，逐漸形成1層藥室內(nèi)壁、2～3層中層和1層絨氈層，此時花藥壁各層細(xì)胞區(qū)別并不明顯（圖版Ⅱ：C）?；ㄋ幈诩?xì)胞繼續(xù)生長，早期的絨氈層細(xì)胞多為單核，細(xì)胞質(zhì)濃厚。初生造孢細(xì)胞經(jīng)過數(shù)次有絲分裂，產(chǎn)生多邊體形排列的次生造孢細(xì)胞（圖版Ⅱ：D）。隨著花藥壁的發(fā)育，當(dāng)次生造孢細(xì)胞進(jìn)一步發(fā)育成小孢子母細(xì)胞時，花藥壁分化完全，即表皮下的4～5層細(xì)胞逐漸分化為1層藥室內(nèi)壁，2～3 層扁平狀的中層細(xì)胞，最內(nèi)層為多面體型的絨氈層細(xì)胞，細(xì)胞體積大，原生質(zhì)濃厚，往往是雙核，甚至多核。發(fā)育完全的花藥壁內(nèi)是小孢子母細(xì)胞（圖版Ⅱ：E），由此可以看出，三葉木通花藥壁的發(fā)育為基本型。小孢子四分體時期，藥室內(nèi)壁沿徑向壁和切向壁增厚，并產(chǎn)生不均的條狀或略微木質(zhì)化結(jié)構(gòu)，中層細(xì)胞體積開始解體，絨氈層細(xì)胞發(fā)達(dá)，開始出現(xiàn)解體的跡象（圖版Ⅱ：F）；隨著小孢子進(jìn)一步發(fā)育，藥室內(nèi)壁細(xì)胞進(jìn)一步徑向延長，最內(nèi)一層中層細(xì)胞首先被吸收，絨氈層不斷為小孢子提供充足的營養(yǎng)，細(xì)胞壁變得模糊不清，細(xì)胞核消失，逐漸原位解體被吸收，屬于分泌型絨氈層（圖版Ⅱ：G）；隨著花藥發(fā)育成熟，花藥壁僅剩下纖維狀加厚的藥室內(nèi)壁及殘留的表皮細(xì)胞，絨氈層和中層細(xì)胞逐漸完全退化（圖版Ⅱ：H～I(xiàn)）。

圖版Ⅱ 三葉木通花藥壁發(fā)育A.花藥橫切面，箭頭所示4個小孢子囊；B.孢原細(xì)胞平周分裂；C.未分化的4～5層花藥壁細(xì)胞和次生造孢細(xì)胞形成；D.發(fā)育中的花藥壁和早期小孢子母細(xì)胞；E.雙核或多核絨氈層細(xì)胞；F.花藥壁和小孢子四分體；G.絨氈層細(xì)胞開始退化；H～I(xiàn).纖維狀加厚的藥室內(nèi)壁和成熟花粉粒；an.花藥；ac.孢原細(xì)胞；sc.次生造孢細(xì)胞；aw.花藥壁；ep.表皮；en.藥室內(nèi)壁；ml.中層；ta.絨氈層；fw.纖維狀加厚的藥室內(nèi)壁；pg.花粉粒PlateⅡ Anther wall development of A.trifoliata A.Anther transverse section，arrow showing four sporangiate；B.Archesporial cell periclinal division；C.Undifferentiated 4-5 layers of anther parietal cells and secondary sporogenous cells；D.Developing anther wall and early microspore mother cells；E.Binucleated or multinucleated tapetum cells；F.Anther wall and microspore tetrad；G.Tapetum cells begin to degeneration；H-I.Fibrous endothecium and mature pollen；an.Anther；ac.Archespo?rial cell；sc.secondary sporogenous cells；aw.Anther wall；ep.Epidermis；en.Endothecium；ml.Middle layer；ta.Tapetum；fw.Fibrous endothecium；pg.The pollen grains

2.1.2 小孢子發(fā)生及雄配子體發(fā)育

三葉木通小孢子發(fā)生是由小孢子母細(xì)胞經(jīng)過減數(shù)分裂產(chǎn)生，小孢子母細(xì)胞體積大，細(xì)胞核大，核仁明顯，細(xì)胞質(zhì)濃厚（圖版Ⅲ：A）。隨著周圍胼胝質(zhì)的形成，小孢子母細(xì)胞經(jīng)過第1次減數(shù)分裂后形成雙核細(xì)胞，不形成二分體時期，完成第2次減數(shù)分裂后形成四分體，四分體大多為四面體型排列，三葉木通小孢子母細(xì)胞胞質(zhì)分裂為同時型（圖版Ⅲ：B～C）。

圖版Ⅲ 三葉木通小孢子發(fā)生及雄配子體發(fā)育A.小孢子母細(xì)胞；B.小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂Ⅱ后期；C.四分體；D.胼胝質(zhì)溶解；E.單核靠邊花粉；F.成熟花粉粒；G.熒光顯微鏡下的花粉形態(tài)；H.3 個花粉囊，示中間一個有花粉敗育現(xiàn)象；I.3 個花粉囊，示左上方2 個有花粉敗育現(xiàn)象；mc.小孢子母細(xì)胞；t.四分體；ms.小孢子；v.液泡；pg.花粉粒Plate Ⅲ Microsporogenesis and male gametophyte development of A.trifoliata A.Microspore mother cells；B.Anaphase of meiosis Ⅱof the microspore mother cells；C.The tetrad；D.Callose dissolution；E.Uninucleate pollen；F.Mature pollen grains；G.Pollen morphology in the fluorescence microscope；H.Three pollen sasc，showing the middle one has pollen abortion；I.Three pollen sacs，showing two on the upper left have pollen abortion；mc.Microspore mother cells；t.The tetrads；ms.Microspores；v.Vacuole；pg.The pollen grains

三葉木通形成的小孢子四分體外部包裹著1 層厚厚的胼胝質(zhì)壁，隨著胼胝質(zhì)壁溶解消失，小孢子釋放到藥室中，形成4 個單核的小孢子（圖版Ⅲ：D）。接著小孢子體積逐漸增大，細(xì)胞質(zhì)發(fā)生液泡化，并形成一個大液泡，將小孢子中的細(xì)胞核擠向一邊，形成單核靠邊期（圖版Ⅲ：E）。單核小孢子細(xì)胞壁加厚，較厚的內(nèi)外壁結(jié)構(gòu)依稀可見，核仁增大而顯著，經(jīng)過有絲分裂形成一個大的營養(yǎng)核和一個小的生殖核，最后發(fā)育形成2-核成熟花粉粒即雄配子體（圖版Ⅲ：F）。熒光顯微觀察下，成熟花粉壁顯綠色熒光，赤面觀呈橢圓、圓形，極面觀呈6個明暗相間的三角形（圖版Ⅲ：G）。

同時可以觀察到三葉木通花藥發(fā)育過程中有少量敗育現(xiàn)象，自小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂后，花粉囊各層花藥壁細(xì)胞排列層次不清、紊亂，絨氈層細(xì)胞發(fā)育不正常，并延時降解，小孢子四分體因得不到營養(yǎng)而收縮降解（圖版Ⅲ：H～I(xiàn)），成熟花粉圓球形染色較深的為可育花粉，花粉皺縮空殼為敗育花粉。

2.2 大孢子發(fā)生和雌配子體發(fā)育

從子房縱切面來看，三葉木通具1 室子房，為側(cè)膜胎座，胚珠多枚（圖版Ⅳ：A）。子房發(fā)育早期，位于腹縫線處出現(xiàn)分裂能力極強(qiáng)、呈團(tuán)狀整體突起的一群細(xì)胞，稱為胚珠原基。其頂端為珠心組織，基部發(fā)育成株柄，并連接著胎座。在胚心組織表皮下分化出一個細(xì)胞體積增大，細(xì)胞核大，細(xì)胞質(zhì)濃厚的特殊細(xì)胞，稱為雌性孢原細(xì)胞（圖版Ⅳ：B），孢原細(xì)胞繼續(xù)生長并分裂形成一個周緣細(xì)胞和一個造孢細(xì)胞（圖版Ⅳ：C）。周緣細(xì)胞經(jīng)過平周和垂周分裂形成珠心組織細(xì)胞，造孢細(xì)胞進(jìn)一步發(fā)育為大孢子母細(xì)胞，其細(xì)胞體積大，細(xì)胞核顯著，明顯區(qū)別于其他薄壁細(xì)胞，大孢子母細(xì)胞發(fā)育過程中，靠珠心基部發(fā)生突起，形成內(nèi)外2層珠被，內(nèi)珠被發(fā)生先于外珠被，在胚珠頂端不愈合留下一個開口，稱為珠孔（圖版Ⅳ：D）。在此過程中，胚珠由最初的直立生長慢慢向一側(cè)發(fā)生彎曲生長，大孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂后形成線型排列的大孢子四分體，與小孢子發(fā)育不同的是，大孢子四分體中，靠近珠孔端的3 個大孢子逐漸變小退化，靠近合點(diǎn)端的1 個大孢子最先發(fā)育，體積變大，慢慢移向珠孔端，成為功能大孢子（圖版Ⅳ：E）。功能大孢子被包圍在數(shù)層珠心組織細(xì)胞之中，所以三葉木通胚珠發(fā)育為厚珠心類型。

圖版Ⅳ 三葉木通大孢子發(fā)生及雌配子體發(fā)育A.子房縱切；B.雌性孢原細(xì)胞；C.周緣細(xì)胞產(chǎn)生1層珠心細(xì)胞時，示造孢細(xì)胞及內(nèi)珠被原基；D.大孢子母細(xì)胞時期，示厚珠心胚珠；E.珠孔端的3 個大孢子相繼退化，合點(diǎn)端功能大孢子的形成；F.二核胚囊；G.八核胚囊；H-I.卵器，示1 個卵細(xì)胞及2 個助細(xì)胞；J.上下極核；K.合并中的上下極核；L.受精極核；縮寫：asc.孢原細(xì)胞；mmc.大孢子母細(xì)胞；ii.內(nèi)珠被；oi.外珠被；dm.退化大孢子；fm.功能大孢子；bes.二核胚囊；ac.反足細(xì)胞；cc.中央細(xì)胞；ec.卵細(xì)胞；sy.助細(xì)胞；pn.極核；fn.受精極核Plate Ⅳ Megasporogenesis and female gametogenesis of A.trifoliata A.Ovary longitudinal section；B.The archesporial cell differentiated immediately below the nucellarepidermis；C.The Peripheral cells produce a layer of nucellus cells，showing sporogenous cells and inner integument primordia；D.Megaspore mother cell stage，showing thick nucellus ovule；E.The 3 megaspores at the end of the nucleus degenerate one after another，and the formation of functional megaspores at the chalazal end；F.Binucle?ate embryo sac；G.Eight nuclear embryo sac；H-I.Egg apparatus，showing an egg cell and two synergia；J.The polar nuclei which is in the process of fusion；K.The second nucleus of central cell；L.Fertilization of polar nuclei；asc.Archesporial cell；mmc.The mother megaspore cell；ii.The inner in?tegument；oi.The outer integument；dm.The degenrated megaspores；fm.The functional megaspore；bes.Binucleate embryonary sac；ac.Antipodal cell；cc.Central cells；ec.Egg cell；sy.Synergids；pn.Polar nucleus；fn.Fertilization of polar nuclei

三葉木通功能大孢子發(fā)育形成單核胚囊，隨即經(jīng)過第1 次有絲分裂，形成2 個游離核，即進(jìn)入二核胚囊期（圖版Ⅳ：F），繼續(xù)經(jīng)過2 次有絲分裂，最終形成七細(xì)胞八核胚囊期（圖版Ⅳ：G）。珠孔端分化出1 個卵細(xì)胞和2 個助細(xì)胞，構(gòu)成卵器，呈“品”字型排列（圖版Ⅳ：H～I(xiàn)），2 個上下極核互相融合生成次生核的中央細(xì)胞（圖版Ⅳ：J～K），靠近合點(diǎn)端的為3 個反足細(xì)胞充當(dāng)吸收，轉(zhuǎn)運(yùn)和分泌營養(yǎng)物質(zhì)到胚囊的作用。受精后，三葉木通成熟胚囊中2 個助細(xì)胞逐漸退化，合點(diǎn)端的3 個反足細(xì)胞解體，中央細(xì)胞受精形成受精極核（圖版Ⅳ：L）。因此，三葉木通經(jīng)3 次連續(xù)的有絲分裂并進(jìn)一步發(fā)育為七細(xì)胞八核的蓼型胚囊，在雌配子體發(fā)育過程中，胚珠生長繼續(xù)彎曲，珠心和珠被的縱軸與珠柄近成直角，最后成熟胚珠為橫生胚珠（圖版Ⅳ：G）。

2.3 雌花中的雄蕊和雄花中的心皮發(fā)育

三葉木通雌花中雄蕊的早期發(fā)育與正常雄花中的相似，小孢子母細(xì)胞能進(jìn)行減數(shù)分裂，但小孢子進(jìn)一步發(fā)育過程中出現(xiàn)異常現(xiàn)象，具體表現(xiàn)為大部分小孢子發(fā)育停留在單核靠邊期（圖版Ⅴ：A），大部分小孢子發(fā)生敗育，藥室內(nèi)壁也發(fā)生纖維狀加厚，但不如正常雄花中的顯著，中層細(xì)胞始終不退化，絨氈層細(xì)胞退化不完全，可見殘余痕跡。即使有少部分花粉發(fā)育成熟，但花藥壁不開裂（圖版Ⅴ：B）。其外形與雄花中的雄蕊相比，顏色為嫩綠色，發(fā)育不良，被雌蕊擠壓在基部，形成功能性雌花（圖版Ⅰ：C）。

圖版Ⅴ 三葉木通雌花中雄蕊和雄花中心皮的發(fā)育A.單核小孢子；B.雌花中的雄蕊花藥壁不開裂，示中層不退化，絨氈層退化不完全；C.雄花中4枚退化心皮；ms.小孢子；ca.心皮PlateⅤ Development of stamens in female flowers and carpel in male flowers of A.trifolia A.Uninucleate microspore；B.Stamens in female flowers anther wall does not crack，showing the middle layer is not degraded，the tapetum layer is not completely degraded；C.4 degenerated carpels in the male flowe；ms.Microspores；ca.Carpel

三葉木通雄花在雄蕊從花藥造孢細(xì)胞、小孢子四分體以及此后花粉成熟的過程中，雄花中的心皮愈合不完全，心皮不產(chǎn)生胚珠，體積雖有增大，心皮早期未充分發(fā)育而造成退化（圖版Ⅴ：C）。其外形與雌花中雌蕊相比，花柱顏色為嫩綠色，柱頭未膨大，形成功能性雄花（圖版Ⅰ：B）。

3 討論

三葉木通雄蕊每枚花藥具4個小孢子囊，小孢子母細(xì)胞胞質(zhì)分裂屬于同時型，小孢子四分體呈“品”字四面體型排列，四分體解體后，形成單核花粉。中層和絨氈層在小孢子的發(fā)育過程中最后解體，成熟花粉為2 核細(xì)胞。三葉木通子房1 室，側(cè)膜胎座，胚珠橫生，多枚，雙珠被，厚珠心，胚囊為單孢子發(fā)生七細(xì)胞八核蓼型胚囊。這些發(fā)育特征與木通科其他屬植物發(fā)育方式既有同一性又存在差異性［9-12］，胚珠發(fā)生方式與之前報道的彎生和倒生類型不同［23］，本次試驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)，三葉木屬于典型的橫生胚珠類型。三葉木通具有一些較為原始的胚胎學(xué)特征，2-核成熟花粉、單孢子發(fā)生的蓼形胚囊等，同時，三葉木通也具有較為進(jìn)化的胚胎學(xué)特征，橫生胚珠，絨氈層為較進(jìn)化的分泌絨氈層，表明三葉木通的胚胎學(xué)特征可能處于由原始到進(jìn)化的過渡地位。

木通科植物花性復(fù)雜，雌花的花藥退化和雄花的心皮退化是常見的現(xiàn)象［24］，其退化的時期及功能性有所不同，八月瓜（Holboellia latifolia）退化雄蕊發(fā)育到單核花粉階段，導(dǎo)致花粉敗育［25］。在單葉血藤（Sargentodoxa simplicifolia）兩性花中的退化雄蕊，大部分小孢子發(fā)育到單核花粉期，少數(shù)能產(chǎn)生2 或3 細(xì)胞花粉，花藥壁并不開裂［10］。串果藤（Sinofranchetia chinensis）退化雄蕊小孢子發(fā)育到四分體時期退化，少數(shù)能產(chǎn)生2 或3 細(xì)胞花粉，退化雄蕊在花部結(jié)構(gòu)、開裂方式及花粉形態(tài)上與正常雄蕊無明顯差別［12］。通過本次顯微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)，三葉木通雌花中雄蕊退化，大部分小孢子發(fā)育停留在單核靠邊期，即使有少部分發(fā)育成2-核成熟花粉，但花藥壁不開裂，雄花中心皮退化是由于早期未發(fā)育所致。因此，三葉木通為一種功能上的單性花，并且認(rèn)為此花比貓兒屎屬、串果藤屬和大血藤屬植物中的進(jìn)化，三葉木通胚胎學(xué)支持木通屬和木通科各屬具有相似的系統(tǒng)發(fā)育過程，其進(jìn)化方向和水平具有各自不同的特點(diǎn)［8］。這些細(xì)胞學(xué)研究結(jié)果不僅反映了三葉木通的祖先繁育狀態(tài)，而且為研究三葉木通單性花形成的分子機(jī)制提供理論證據(jù)，也為三葉木通種群進(jìn)化趨勢提供了線索。

三葉木通大、小孢子發(fā)生和雌、雄配子體發(fā)育大多基本正常，小孢子發(fā)育有少量敗育現(xiàn)象，但發(fā)生的概率極低，大多能夠正常發(fā)育成熟。前期授粉試驗(yàn)證明，三葉木通不僅可作為授粉樹種，也可作為雜交母本的優(yōu)良選擇。木通科其他屬植物的大、小孢子發(fā)生和雌、雄配子體發(fā)育過程中未見胚珠、卵器和小孢子發(fā)育異常的報道，可見三葉木通結(jié)實(shí)率低的胚胎學(xué)原因并非大、小孢子發(fā)生和雌、雄配子體發(fā)育異常。在花藥間及不同藥室內(nèi)小孢子和同一子房中的胚珠的發(fā)育進(jìn)程出現(xiàn)不同步的現(xiàn)象，大約相差1～2 個時期，這種發(fā)育不同步現(xiàn)象對增加花粉活性、延長授粉時間及促進(jìn)異交有一定的幫助，但對于野生三葉木通分布零散且不集中情況下，可能會導(dǎo)致結(jié)實(shí)率降低。傳統(tǒng)觀念認(rèn)為植物雌雄性功能在時間上或空間上的分離是廣泛阻止花內(nèi)自花授粉的有效機(jī)制，退化雄蕊是避免自交的適應(yīng)機(jī)制［26］，日本木通的傳粉生物學(xué)研究表明木通具有自交不親和性，即自花傳粉或相同基因型的異花傳粉而導(dǎo)致不育或結(jié)實(shí)率較低［27-28］。此外，影響結(jié)實(shí)率包括自然和人為等外部因素，野生三葉木通多生長在海拔1 200～1 800 m的公路旁、河邊、山坡或山溝林中，常以單株或幾株攀爬于喬木和灌木混雜的植物群落里，花期3～5月，神農(nóng)架地區(qū)晝夜溫差大且多雨，這些自然因素對于三葉木通傳粉，結(jié)實(shí)也有影響，此時也正值旅游旺季，人為影響同樣也不可避免。因此，三葉木通雌雄同株異花，是一種較為嚴(yán)格的異花授粉植物，在自然條件下難以完成傳粉，其結(jié)實(shí)率低可能與影響傳粉的外部因素有關(guān)，對三葉木通自交不親合性的類型和特點(diǎn)有待進(jìn)一步研究，將有助于深入解答其“花多果少”的原因，從而為三葉木通開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。