王思嘉 楊杭 馬嵋 何修遠(yuǎn) 木扎拜爾·卡日 薄雅坤 馬會杰 張玲

阻塞性睡眠呼吸暫停(obstructive sleep apnea,OSA)是一種最常見的睡眠呼吸障礙,美國大約25% 的成年人患有OSA[1],在50 ～70 歲的女性中發(fā)病率為9% ,在男性中為17%[2]。中國的流行病學(xué)顯示,大約有13% 的中年男性和6% 的中年女性患有中度到重度OSA[3]。已有的研究顯示OSA 可導(dǎo)致心血管疾病的發(fā)病率增加及影響患者的預(yù)后[4]。以往的研究發(fā)現(xiàn)交感神經(jīng)的激活在OSA 患者相關(guān)心血管疾病發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用[5]。以往的交感神經(jīng)活性主要是通過心率變異性及皮膚交感活性記錄的[6],腎神經(jīng)放電記錄是最直接反映交感神經(jīng)活性的方法,已有的研究尚缺乏通過腎神經(jīng)直接記錄反映OSA 大鼠交感神經(jīng)活性的證據(jù)。筆者旨在提供一種穩(wěn)定的可重復(fù)性高的腎神經(jīng)記錄方法學(xué),并記錄急性O(shè)SA 情況下監(jiān)測腎交感神經(jīng)活性(RSNA)的變化,為探討交感神經(jīng)變化提供實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物的選擇 成年SPF 級Sprague-Dawley(SD)大鼠10 只,雄性,體重(250±23)g,購自新疆醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心,動物飼養(yǎng)在新疆醫(yī)科大學(xué)動物飼養(yǎng)基地,實(shí)驗(yàn)于新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究院進(jìn)行,動物可自由飲水、進(jìn)食,環(huán)境室溫20～23℃,空氣濕度40% ～60%,采用大鼠普通顆粒飼料和普通飲用水喂養(yǎng),控制明暗光照各12 h/d。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 戊巴比妥鈉(北京索萊寶科技有限公司,生產(chǎn)批號CAS:57-33-0),異氟烷(深圳市瑞沃德生命科技有限公司,生產(chǎn)批號21082101),肝素鈉注射液(上海上藥第一生化藥業(yè)有限公司,生產(chǎn)批號2104102),輕質(zhì)液狀石蠟(南昌白云藥業(yè)有限公司,生產(chǎn)批號20131106)。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 數(shù)碼顯微鏡(深圳市瑞沃德生命科技有限公司),小動物麻醉機(jī)-基礎(chǔ)型(深圳市瑞沃德生命科技有限公司),Powerlab 16/35 電生理記錄儀(AD Instruments,Australia),氣管插管(江蘇華夏醫(yī)療器械有限公司)。

1.4 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備 寵物剃毛器、玻璃分針、一次性使用靜脈留置針、精細(xì)鑷(兩個)、彈簧剪、注射器(1 ml、5 ml)、自制拉鉤(兩個)、棉球、血管夾,無菌手術(shù)器械包:組織剪,線剪,眼科剪,止血鉗,持針器,手術(shù)刀柄,一次性手術(shù)刀片,Allis′s鉗,彎盤。氣管插管、碘伏、紗布、口罩、帽子等。

1.5 實(shí)驗(yàn)過程 SD 大鼠用3% 戊巴比妥鈉腹腔麻醉,經(jīng)口氣管插管后連接小動物麻醉機(jī),經(jīng)頸總動脈穿刺置管后連接壓力換能器,監(jiān)測動脈血壓,連接肢導(dǎo)心電圖監(jiān)測心電圖。經(jīng)腹膜后路找到左側(cè)腎神經(jīng),記錄閉氣前20 s、閉氣期間、閉氣后20 s的RSNA 變化,記錄RSNA 的過程重復(fù)3次以上(圖1)。

圖1 記錄大鼠左側(cè)腎神經(jīng)放電的步驟

1.6 氣管插管及頸總動脈穿刺置管 誘導(dǎo)麻醉使用2%戊巴比妥鈉,麻醉方式采用腹腔注射,用量為45 mg/kg。大鼠仰臥位固定,用膠帶綁住四肢,針頭固定膠布,在頸部剃毛。將大鼠的頭墊高,使頭與桌面呈45°,用血管鉗將舌頭向外向上提起,用棉簽清理口腔分泌物,在光源下,見聲門后置管,置管深度為從門齒至喉部的距離。連接小動物麻醉機(jī),予持續(xù)低流量氧氣吸入(1～2 L/min)。開氣麻,1.5%異氟烷,切皮,用鑷子提起皮膚,用組織剪在頸部正中剪縱切口,再用血管鉗鈍性分離皮下組織和胸骨舌骨肌,暴露出氣管,在氣管的后外側(cè)找到頸總動脈和神經(jīng)。用玻璃分針和鑷子分離頸總動脈和神經(jīng),分離出頸總動脈后穿雙股線,結(jié)扎遠(yuǎn)心端,近心端系松結(jié),再用血管夾夾住近心端。在一次性使用靜脈留置針里注入含肝素的生理鹽水,穿刺置管,將松結(jié)系緊,連接動脈壓力換能器,連接血壓放大器(Bridge Amp,AD Instruments,Australia)記錄血流動力學(xué)變化,監(jiān)測血壓。同時連接肢導(dǎo)心電圖,連接生物電放大器(Bio Amp,AD Instruments,Australia)記錄心電圖。每個動物每小時腹腔注射戊巴比妥鈉17 mg/kg維持麻醉及1% 異氟烷維持麻醉。

1.7 記錄RSNA 的方法 用小夾子將頸部皮膚夾閉,將大鼠的雙上肢一起綁,雙下肢一起綁,改成右側(cè)臥位,用針頭固定,大鼠背部剃毛,范圍為:下至髂前上棘,上至肋緣上1～2 cm,后至后正中線,用濕紗布將毛沾走,保持操作臺潔凈。

在脊柱左側(cè)1 cm 左右,以肋緣的最低點(diǎn)為中點(diǎn),用組織剪剪開4 ～5 cm ,用血管鉗鈍性分離皮下筋膜,直至可見淺層白色的腰最長肌。

在腰最長肌外側(cè)用血管鉗或小組織剪鈍性分離肌肉,往腹部分離,直至可見左側(cè)腎臟。

先找到腎門,可見粉紅色的腎動脈和暗紅色的腎靜脈被脂肪組織包裹,沿著腎動脈往正中可見腹主動脈,由于腹主動脈位于肌肉深層,且腹主動脈與其背部的肌肉粘連緊密,此時可在肌肉與腹主動脈相連接處滴加1 ～2 滴液體石蠟油,再用玻璃分針鈍性分離腹主動脈與肌肉,可見腹主動脈和腎動靜脈構(gòu)成“T”形(圖2),腹主動脈和腎動脈呈粉紅色,腎靜脈呈暗紅色,用兩個自制鐵片彎鉤固定周圍的組織,讓“T”形區(qū)更好地暴露。

圖2 腹主動脈及腎動靜脈構(gòu)成T 形

大鼠的腎神經(jīng)沿腹主動脈走行,并在“T 型”區(qū)域發(fā)出分支,一支沿腹主動脈走行,另一只沿腎動脈附近走行。順著其解剖位置,先找到左側(cè)神經(jīng),用鑷子和玻璃分針在顯微鏡下分離神經(jīng),注意不要弄破神經(jīng)周圍的血管,用Powerlab 雙極銀電極勾住神經(jīng),再滴加液體石蠟,防止神經(jīng)干燥,保護(hù)神經(jīng)。連接神經(jīng)放大器(Neuro Amp EX,AD Instruments,Australia)進(jìn)行監(jiān)測。當(dāng)雙極銀電極勾上腎神經(jīng)后,夾閉氣管導(dǎo)管,若記錄的神經(jīng)放電立即隨閉氣出現(xiàn)變化,則說明監(jiān)測的確定為腎神經(jīng),若無變化,則有可能是白色的筋膜。當(dāng)確定為腎神經(jīng)時,多次閉氣驗(yàn)證其重復(fù)性。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,給大鼠注射過量戊巴比妥鈉實(shí)行安樂死。

實(shí)驗(yàn)過程中記錄到的腎交感神經(jīng)信號經(jīng)神經(jīng)放大器放大,在LabChart軟件(AD Instruments,Australia)中以50 Hz為中心頻率的陷波濾波,使用以100 ms的時間常數(shù)對原始RSNA信號進(jìn)行積分。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理 計量資料以均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差表示,在實(shí)驗(yàn)中僅有一組大鼠,但數(shù)據(jù)有閉氣前20 s、閉氣20 s和閉氣后20 s三組,分別選取其中兩組進(jìn)行兩兩比較,采用配對t檢驗(yàn),用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析,以P＜0.05 為差異具有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 RSNA 的 變 化 用Powerlab 電 生 理 記 錄 儀直接記錄大鼠的原始RSNA、積分RSNA、心率、血壓、RR 間期。發(fā)現(xiàn),在閉氣期間RSNA 的表現(xiàn)主要有兩種,一種以電壓增加為主(圖3),另一種以頻率增加為主(圖4)。與閉氣前20 s相比,在閉氣期間,RSNA 的電壓明顯增高(P＜0.01),而與閉氣期間相比,閉氣后20 s的RSNA 的電壓明顯下降(P＜0.01),閉氣期間血壓降低,心率減慢,見表1。以RSNA 頻率增快為主的記錄中(圖4),與閉氣前20 s相比,在閉氣期間,RSNA 的頻率增加(P＜0.05),閉氣期間血壓降低,心率減慢,見表1。以信噪比(信號:噪聲)大于3∶1來計算腎神經(jīng)放電,如圖5所示。

圖3 Powerlab 電生理記錄儀記錄到的RSNA、血壓和RR 間期的變化

圖4 另一種模式的神經(jīng)放電

圖5 腎神經(jīng)放電示意圖

2.2 心率和血壓的變化 與閉氣前20 s相比,閉氣20 s期間,RR 間期增加(P＝0.04),如表1,與閉氣前20 s相比,閉氣20 s期間,血壓明顯下降(P＜0.01),如表1。

表1 神經(jīng)放電的頻率、振幅、血壓和心率在閉氣前20 s、閉氣時和閉氣后20 s的變化

3 討論

目前反映交感神經(jīng)活動的方法如:常規(guī)靜息心率和心輸出量;ELISA 法檢測心肌組織中去甲腎上腺素和腎上腺素濃度;高效液相色譜法檢測血清中去甲腎上腺素濃度,上述方法是評價交感神經(jīng)活性的間接指標(biāo)。

在生理狀態(tài),腎臟由腎傳入交感神經(jīng)和傳出交感神經(jīng)共同支配,并通過感覺傳入神經(jīng)與中樞神經(jīng)系統(tǒng)聯(lián)系[7]。高位中樞對延髓頭端腹外側(cè)區(qū)發(fā)出神經(jīng)沖動,調(diào)控交感神經(jīng)的活動[7]。延髓頭端腹外側(cè)區(qū)通過其下行纖維直達(dá)脊髓中間外側(cè)柱的交感神經(jīng)節(jié),組成腎傳出神經(jīng)[8]。腎內(nèi)感受器可以感受腎內(nèi)的一些變化,經(jīng)過傳入神經(jīng)到達(dá)脊髓后腳,再到達(dá)相應(yīng)中樞[9],RSNA 能直接反映交感神經(jīng)的活性。

雖然RSNA 在反映交感活性方面有意義,但國內(nèi)外關(guān)于RSNA 記錄的相關(guān)動物研究中,對記錄方法的描述不詳細(xì),難以根據(jù)描述直接記錄腎神經(jīng)放電。筆者結(jié)合文獻(xiàn)描述的方法,經(jīng)過反復(fù)摸索和改進(jìn),建立了穩(wěn)定性高、重復(fù)性好的方法,穩(wěn)定的RSNA 再結(jié)合血壓的記錄,可以反映交感神經(jīng)的活動狀況。成功記錄RSNA 的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有:①大鼠的腎神經(jīng)沿腹主動脈走行,并在“T 型”區(qū)域發(fā)出分支,分支沿腎動脈附近走行,被包裹在脂肪組織中,僅在腎動脈上尋找神經(jīng)的難度較大,即使在顯微鏡下,也難以與筋膜區(qū)分。尋找腎神經(jīng)時,需首先暴露“T 型”區(qū)域,并將腹主動脈前的肌肉分離干凈,從腹主動脈前,順著腎神經(jīng)的解剖位置尋找,這樣更容易找到腎神經(jīng)。②在尋找腎神經(jīng)時,保持視野干凈非常重要,雖然大鼠的凝血快,但若有毛細(xì)血管滲血,找腎神經(jīng)則有較大的難度,可用0.9% 的生理鹽水沖洗至視野干凈。③在尋找腎神經(jīng)時,用血管鉗鈍性分離肌肉,可減少出血,保持視野干凈,更有助于實(shí)驗(yàn)的順暢進(jìn)行。④監(jiān)測神經(jīng)放電時,需要特別關(guān)注大鼠的麻醉深度。若麻醉過深,神經(jīng)放電會受抑制,甚至無法監(jiān)測到神經(jīng)放電;若麻醉深度太淺,刺激大鼠時,大鼠會出現(xiàn)抵抗和躁動,則會導(dǎo)致神經(jīng)放電監(jiān)測失敗。⑤在監(jiān)測神經(jīng)放電時,需要注意不要讓周圍組織碰到電極,必要時可以剪一小片塑料將電極與周圍組織隔離開,否則將影響神經(jīng)放電的監(jiān)測結(jié)果。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):閉氣期間RSNA 升高,同時血壓下降,結(jié)果與Lataro等[10]研究一致,在他們大鼠心力衰竭模型的研究中,RSNA 升高時血壓下降。在楊勝昌等[11]的研究中,給對照組大鼠注射硝普鈉會導(dǎo)致RSNA 升高,血壓下降。注射苯腎上腺素會導(dǎo)致RSNA 下降,血壓升高。在Huang等[12]的研究中,無論是正常飲食組大鼠還是高脂飲食組大鼠,在注射苯腎上腺素后,RSNA 下降,平均動脈壓升高,心率減慢,在注射硝普鈉后,RSNA 升高,平均動脈壓下降,心率增快。Fink等[13]在大鼠的腦橋被蓋注射DL-同型半胱氨酸,出現(xiàn)RSNA 和血壓均升高的現(xiàn)象。

本文所述腎神經(jīng)記錄方法學(xué),借鑒了河北醫(yī)科大學(xué)Li等[14]的方法,但不同之處在于液體石蠟油的滴加次數(shù)及順序,Li等的方法是在找到腎神經(jīng)之后滴加液體石蠟油,筆者在尋找腹主動脈時,第一次使用石蠟油,目的是為了將腹主動脈與其背部的肌肉分離,由于腹主動脈與其背部的肌肉粘連緊密,用鑷子去除肌肉時,容易扎破腹主動脈造成大出血,筆者在腹主動脈周圍滴加少量液體石蠟油,再用玻璃分針分離腹主動脈及其背部的肌肉,這樣能提高速度,且不會出血,更有利于新手實(shí)驗(yàn)操作。第二個優(yōu)點(diǎn)在于,本方法的重復(fù)性好。第三點(diǎn),RSNA 可以直接監(jiān)測交感神經(jīng)活性,比監(jiān)測去甲腎上腺素濃度更加直觀、快速,實(shí)驗(yàn)當(dāng)時即可觀察RSNA 變化。

本方法也存在一定的局限性,即根據(jù)解剖位置定位無法確定是真的腎神經(jīng),需要通過干預(yù)后神經(jīng)放電變化來確定,若給予閉氣后,同步記錄的Labchart圖像中RSNA 無變化,則說明并非腎神經(jīng),此時需要重新在“T”形區(qū)域附近的脂肪組織中重新尋找,神經(jīng)操作要求動作輕柔和足夠的耐心,反復(fù)練習(xí)一定能找到腎神經(jīng)并記錄RSNA。