劉 暢，李 靜，江思婧，牟雁東Δ

(1.川北醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)系，四川南充637600 ;2.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院.四川省人民醫(yī)院口腔科，四川成都 610031)

臨床常用自體移植修復(fù)大面積骨缺損，然而術(shù)后存在一些嚴(yán)重并發(fā)癥。因而急需尋找具有良好生物安全性及成骨效能的生物替代材料。但生物材料植入后引起的宿主免疫反應(yīng)決定著生物材料的命運(yùn)。Arron和Choi兩位學(xué)者在2000年提出了“骨免疫”這一概念[1]，人們發(fā)現(xiàn)骨骼系統(tǒng)與免疫系統(tǒng)緊密相連，并互相作用，免疫細(xì)胞也是骨穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因素。因而研究者們將目光轉(zhuǎn)向研究能調(diào)節(jié)骨免疫微環(huán)境的生物材料。研究者們通過改進(jìn)生物材料的化學(xué)性能、表面物理性能及在材料上加載生物因子[2]，賦予生物材料調(diào)節(jié)骨免疫微環(huán)境的能力。microRNAs是一類由21～25個(gè)核酸組成的單鏈非編碼小RNA，microRNAs占人類基因組的15%,調(diào)控至少30%的蛋白基因編碼。已有多種microRNAs作為生物因子被加載到骨組織工程的生物材料中，并在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中均獲得了較好的成骨效果。卻鮮有報(bào)道m(xù)icroRNAs在骨組織工程中調(diào)節(jié)骨免疫微環(huán)境。

本綜述將討論生物材料植入后的宿主反應(yīng)、巨噬細(xì)胞在骨愈合中的作用、靶向調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞及巨噬細(xì)胞的microRNAs。試圖探尋將具備骨免疫微環(huán)境調(diào)節(jié)能力的microRNA作為生物活性因子加載到生物材料上，未來應(yīng)用這一策略使生物材料植入體內(nèi)后靶向調(diào)節(jié)骨免疫微環(huán)境，獲得更好的成骨效果。

1 生物材料植入后的宿主反應(yīng)

生物材料植入體內(nèi)后會(huì)發(fā)生一系列的反應(yīng)，其中包括血液-材料相互作用、臨時(shí)基質(zhì)形成、急性和慢性炎癥、肉芽組織發(fā)育、異物反應(yīng)和纖維囊形成[2]。多種免疫細(xì)胞參與了生物材料植入后的免疫反應(yīng)。生物材料植入后的納秒內(nèi)，血液和間質(zhì)液蛋白質(zhì)自發(fā)吸附在生物材料表面，引起凝血級聯(lián)反應(yīng)。同時(shí)觸發(fā)補(bǔ)體級聯(lián)反應(yīng)，產(chǎn)生高濃度的C3a和C5a以募集粒細(xì)胞及單核細(xì)胞。凝血級聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)生的纖維蛋白網(wǎng)、激活的血小板，以及補(bǔ)體激活過程中釋放的炎癥介質(zhì)，在生物材料表面形成臨時(shí)基質(zhì)。隨后發(fā)生以植入部位存在多形核粒細(xì)胞為標(biāo)志的急性炎癥。在植入2天內(nèi)，多形核粒細(xì)胞迅速發(fā)生耗竭。肥大細(xì)胞通過釋放組胺及增強(qiáng)炎性的細(xì)胞因子也參與了急性炎癥。急性炎癥期釋放的大量細(xì)胞因子會(huì)募集單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞。隨后進(jìn)入慢性炎癥期，單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞是參與炎癥演變的主要細(xì)胞。血液循環(huán)中的單核細(xì)胞被募集到植入物部位，并分化成巨噬細(xì)胞。在傷口愈合的過程中，巨噬細(xì)胞吞噬有害物質(zhì)，并募集其它細(xì)胞到損傷部位，同時(shí)分泌各種生物因子促進(jìn)傷口愈合。巨噬細(xì)胞具有高度可塑性，可響應(yīng)局部微環(huán)境，分化為M1型促炎表型及M2型抗炎表型。巨噬細(xì)胞可以吞噬直徑5 μm的顆粒，但M1表型向M2表型轉(zhuǎn)化失敗加上吞噬顆粒較大時(shí)[2]，在白介素4、白介素13的刺激下巨噬細(xì)胞將形成異物巨細(xì)胞，異物巨細(xì)胞可以吞噬直徑高達(dá)100 μm的顆粒。并在急慢性炎癥消失后，通過識別具有巨噬細(xì)胞、血管、成纖維細(xì)胞及肌成纖維細(xì)胞的“肉芽樣組織”，形成肉芽組織。普遍認(rèn)為肉芽組織是纖維囊形成的前體。免疫細(xì)胞導(dǎo)致各種促纖維因子的釋放，募集成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致纖維組織的形成。免疫細(xì)胞的調(diào)節(jié)功能對于植入物最終向骨再生發(fā)展，還是形成纖維囊具有重要作用。研究發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞M1型向M2型的轉(zhuǎn)化可減少纖維組織的生成[3]。進(jìn)一步說明了調(diào)節(jié)免疫環(huán)境對于植入生物材料骨再生的重要性。

2 巨噬細(xì)胞對骨愈合的作用

骨髓為骨細(xì)胞和免疫細(xì)胞提供相同的微環(huán)境，以容納和共享相互關(guān)聯(lián)的細(xì)胞因子和信號通路，使兩類細(xì)胞骨代謝中緊密聯(lián)系和互相影響。盡管多種免疫細(xì)胞參與了骨組織中的免疫反應(yīng)，但巨噬細(xì)胞通過分泌各種細(xì)胞因子發(fā)揮著最重要的作用。在骨愈合中發(fā)揮作用的巨噬細(xì)胞根據(jù)細(xì)胞來源分為骨巨噬細(xì)胞和炎癥巨噬細(xì)胞(后者由單核細(xì)胞分化而來)。在體內(nèi)骨巨噬細(xì)胞緊鄰破骨細(xì)胞，并且骨巨噬細(xì)胞耗盡后影響了骨損傷的愈合，這說明骨巨噬細(xì)胞對于骨穩(wěn)態(tài)具有重要作用。而炎癥巨噬細(xì)胞被認(rèn)為是組織愈合期間主要的巨噬細(xì)胞來源。這些炎癥巨噬細(xì)胞具有高度的可塑性，可以通過M1、M2表型轉(zhuǎn)化，并分泌各類細(xì)胞因子影響骨愈合的過程?，F(xiàn)有研究中，microRNAs主要通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞M1、M2表型轉(zhuǎn)化，從而影響成骨細(xì)胞，影響骨愈合過程。了解巨噬細(xì)胞在骨愈合中所發(fā)揮的作用，有利于探究microRNAs介導(dǎo)巨噬細(xì)胞影響骨愈合的具體機(jī)制。

2.1 M1型巨噬細(xì)胞干擾素、脂多糖以及巨噬細(xì)胞集落刺激因子可刺激巨噬細(xì)胞分化為M1表型。M1型巨噬細(xì)胞分泌腫瘤壞死因子(TNF-α)、白介素6等細(xì)胞因子影響成骨過程。TNF-α可以介導(dǎo)MSC的定向遷移，通過核因子κB通路增強(qiáng)了骨形成蛋白2、核心結(jié)合因子α1等成骨相關(guān)基因的表達(dá)，提高了堿性磷酸酶活性促進(jìn)基質(zhì)礦化。而白介素6敲減的小鼠，骨組織損傷愈合延遲，組織礦化成熟能力減弱[4]。但TNF-α、白介素6也可以促進(jìn)破骨細(xì)胞形成?？偠灾?，早期的促炎因子可能對成骨有利，但長期的炎癥反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致異物反應(yīng)及纖維包裹，引起生物材料植入失敗及周圍骨組織吸收。

2.2 M2型巨噬細(xì)胞與M1型巨噬細(xì)胞相反，M2型巨噬細(xì)胞在成骨的中晚期起作用，誘導(dǎo)新骨及纖維組的形成。M2型巨噬細(xì)胞可分為M2a、M2b、M2c、M2d型，每一種亞型都有特有的表面標(biāo)志和功能。M2a由白介素4、白介素13刺激產(chǎn)生，分泌大量精氨酸酶1、轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)促進(jìn)膠原纖維和成纖維細(xì)胞因子產(chǎn)生。M2b由IC/TLR聯(lián)合激動(dòng)劑及IL-1R激動(dòng)劑刺激產(chǎn)生，分泌大量白介素10,同時(shí)也分泌白介素1β、TNF-α、IL-6，起平衡炎癥環(huán)境的作用。M2c由白介素10刺激分化而來，產(chǎn)生大量白介素10及TGF-β，起控制炎癥、促進(jìn)組織重建的作用。M2d巨噬細(xì)胞被認(rèn)為是腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞。M2型巨噬細(xì)胞通過釋放抗炎細(xì)胞因子促進(jìn)了成骨反應(yīng)。白介素10可以促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，在白介素10敲減的小鼠中觀察到骨形成減少，羥基磷灰石在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中依賴白介素10促進(jìn)骨形成[5,6]。TGFβ可以通過BMP信號通路刺激間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化，以促進(jìn)成骨。然而，TNF-α、TGF-β1和TGF-β3等因子的長期釋放導(dǎo)致會(huì)瘢痕組織的形成和傷口愈合過程延遲。

3 調(diào)節(jié)骨免疫微環(huán)境的潛在microRNAs

鮮有文獻(xiàn)報(bào)道將同時(shí)作用于成骨細(xì)胞及免疫細(xì)胞的microRNAs應(yīng)用到成骨生物材料上。Marycz等將miR-21、miR-124加載到加入了氧化鐵的納米羥基磷灰石中，在磁場條件下觀察到，復(fù)合材料降低了脂多糖刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的炎性因子，提高了小鼠成骨細(xì)胞MC3T3-E1的成骨能力[7]。另一項(xiàng)研究利用靜電紡聚納米纖維支架加載兩種microRNAs:Let-7c和miR-124，在小鼠體內(nèi)降低了M1/M2型巨噬細(xì)胞比例，促進(jìn)了植入物與周圍組織的骨整合[8]。但這些研究都缺少microRNAs具體影響骨免疫微環(huán)境的機(jī)制研究。了解同時(shí)靶向成骨細(xì)胞及免疫細(xì)胞的microRNAs,以及具體的作用機(jī)制,有利于將這些microRNAs進(jìn)一步應(yīng)用于生物材料上，達(dá)到理想的成骨效果。

3.1 miR-21miR-21對于巨噬細(xì)胞的表型的調(diào)節(jié)具有組織異質(zhì)性，對不同的炎性環(huán)境其作用也不一致，研究者認(rèn)為miR-21在調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)時(shí)起著動(dòng)態(tài)作用。Nurrahmah等用脂多糖刺激RAW264.7后發(fā)現(xiàn)通過NF-κB通路升高了miR-21表達(dá)，并促進(jìn)了白介素1β、TNF-α、白介素6等炎性因子的表達(dá)[9]。而另一些研究則展示了相反的效果。脂肪干細(xì)胞分泌的外泌體中含有miR-21,促進(jìn)了巨噬細(xì)胞向M2型分化，并促進(jìn)了小鼠血管再生[10],血管再生對于成骨也具有重要意義。有趣的是，IL-1β刺激骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞后，產(chǎn)生的外泌體中富含miR-21同樣促進(jìn)了M2型巨噬細(xì)胞分化[11],這說明miR-21可能是調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞、免疫細(xì)胞互相作用的重要介質(zhì)。

miR-21作用于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞時(shí)展現(xiàn)出了積極的促成骨作用。在骨質(zhì)疏松的小鼠中miR-21表達(dá)水平降低，而成骨誘導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中miR-21表達(dá)上升，并且在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中過表達(dá)miR-21可以通過抑制基因功能磷脂酶和張力蛋白同源物促進(jìn)干細(xì)胞成骨分化,抑制其成脂分化[12]。同時(shí)，MiR-21被證明可以通過Smad同源物7-Smad同源物1/同源物5/同源物8-Runx2信號軸促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化[13]。

3.2 miR-26a研究發(fā)現(xiàn)miR-26a靶向Kruppel樣因子4,抑制了巨噬細(xì)胞從M1型向M2型轉(zhuǎn)化[14]。也有研究報(bào)道m(xù)iR-26a可以靶向大鼠巨噬細(xì)胞toll 樣受體3從而減輕炎癥[15]。

miR-26a的促成骨作用在眾多文獻(xiàn)中均已得到了驗(yàn)證。在小鼠體內(nèi)，慢病毒轉(zhuǎn)染的miR-26a促進(jìn)了顱骨缺損的愈合[16]。通過靶向成紅細(xì)胞白血病病毒癌基因同源物2轉(zhuǎn)導(dǎo)因子調(diào)節(jié)BMP/Smad信號通路，miR-26a對于骨質(zhì)疏松的小鼠也有積極的治療作用[16]。miR-26a可以靶向糖原合成酶激酶3β,調(diào)節(jié)wnt信號通路從而促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨[17]。在骨組織工程中，miR-26a被搭載到不同的生物材料上，在體內(nèi)外均得到了較好的成骨效果。

3.3 miR-29miR-29a可以靶向骨髓巨噬細(xì)胞細(xì)胞的破骨細(xì)胞分化因子，從而抑制破骨細(xì)胞生成；同時(shí)，miR-29a敲減的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨能力減弱，這在小鼠體內(nèi)也得到了驗(yàn)證[18]。miR-29a也被認(rèn)為通過核因子κB通路提高了白介素1β、白介素6等促炎因子的釋放[19]。

3.4 miR-34a在小鼠的骨髓巨噬細(xì)胞中，miR-34a通過細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子3/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活子-1/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活子-6信號軸促進(jìn)巨噬細(xì)胞M2極化[20]。脂多糖刺激巨噬細(xì)胞系RAW264.7后，miR-34a表達(dá)降低，過表達(dá)miR-34a后，通過把現(xiàn)象Notch同源物1降低了TNF-α等炎性因子的表達(dá)[21]。但在不同的組織(如心臟、肺巨噬細(xì)胞等)上，miR-34a對于免疫細(xì)胞的作用并不同。在人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中miR-34a可以通過靶向Dickkopf同源物，從而調(diào)節(jié)Wnt信號通路促進(jìn)Runx2、骨鈣素等成骨相關(guān)因子表達(dá)[22]。用水凝膠傳遞miR-34a在體內(nèi)外均證明了miR-34a的促成骨作用[23]。

3.5 miR-124在不同的體內(nèi)外模型中，miR-124均抑制巨噬細(xì)胞向M1型分化，促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2型分化，并釋放抗炎因子。MiR-124靶向了TNF 受體關(guān)聯(lián)因子、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子和轉(zhuǎn)錄激活因子3等多個(gè)靶標(biāo)發(fā)揮上述功能[24，25]。同時(shí)miR-124對于骨愈合也有積極的作用。在韌帶成纖維細(xì)胞中，miR-124通過用靶向GSK-3β，調(diào)節(jié)Wnt信號通路促進(jìn)細(xì)胞成骨分化[26]。羥基磷灰石顆粒搭載miR-124后也展現(xiàn)出良好的成骨能力[7]。納米纖維支架傳遞miR-124可以增加植入物周圍M2型巨噬細(xì)胞表達(dá)，降低植入后纖維囊的產(chǎn)生[8]。MiR-124還可以抑制白介素6、TNF-α誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞生成[27]。

3.6 miR-125aBanerjee等發(fā)現(xiàn)miR-125a在M2型巨噬細(xì)胞中高度表達(dá)，敲減miR-125a后促進(jìn)了M1型巨噬細(xì)胞的分化，miR-125a通過直接靶向Kruppel樣因子3參與了巨噬細(xì)胞表型大的調(diào)節(jié)[28]。牙髓干細(xì)胞的外泌體富含miR-125a, 過表達(dá)的miR-125a直接靶向B 細(xì)胞κ 輕肽基因增強(qiáng)子抑制因子抑制NF-κB和Toll樣受體信號通路，促進(jìn)巨噬細(xì)胞M2向分化，并釋放促成骨因子骨形成蛋白2[29]。這說明miR-125a可能在骨免疫微環(huán)境中起著重要作用。miR-125a還被發(fā)現(xiàn)可以通過Wnt信號通路促進(jìn)脂多糖刺激后的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨[30]。

4 總結(jié)與展望

microRNA可以作為調(diào)節(jié)骨免疫微環(huán)境的生物活性因子加載到生物材料上，通過這一策略研發(fā)靶向調(diào)節(jié)骨免疫微環(huán)境的生物材料，得到更理想的成骨效果。在microRNAs的選擇上，我們認(rèn)為miR-21、miR-26a、miR-29、miR-34、miR-124、miR-125a可以作用調(diào)節(jié)骨免疫微環(huán)境的生物活性因子。盡管有的microRNAs在免疫和成骨調(diào)節(jié)上具有爭議，但植入體內(nèi)的微環(huán)境比已知的機(jī)制更為復(fù)雜，仍需進(jìn)一步驗(yàn)證骨免疫的效果與發(fā)揮作用的機(jī)制。

盡管microRNAs在共同調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞和成骨細(xì)胞方面具有較大潛力，但要將其實(shí)際應(yīng)用到生物材料上仍然有很多限制，比如靶向性差、循環(huán)時(shí)間短和裸miRNA藥物可能產(chǎn)生脫靶效應(yīng)。在組織工程中，已有多種含有細(xì)胞和無細(xì)胞的支架得到了應(yīng)用，但仍需要探索更理想的支架材料搭載microRNAs，使其時(shí)序釋放、靶向局部骨缺損部位，最終達(dá)到理想成骨效果。