高文雅，李 濤, 2#，周嚴(yán)嚴(yán)，李明利，王琳娜，趙海譽(yù)，邊寶林，王宏潔，馮 雪，楊偉鵬*，司 南*

黃芩水煎液中化學(xué)成分的定性及定量研究

高文雅1，李 濤1, 2#，周嚴(yán)嚴(yán)1，李明利1，王琳娜1，趙海譽(yù)1，邊寶林1，王宏潔1，馮 雪1，楊偉鵬1*，司 南1*

1. 中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京 100700 2. 中國中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗中心，北京 100700

分析黃芩水煎液中的化學(xué)成分，并對其中的主要成分進(jìn)行定量研究，為黃芩質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立和進(jìn)一步研究提供參考依據(jù)。定性分析采用UHPLC LTQ-Orbitrap MS技術(shù)，0.1%甲酸水-乙腈為流動相，梯度洗脫，分析化合物的精確相對分子質(zhì)量及碎片離子信息。通過對照品對比、分析化合物質(zhì)譜裂解碎片推測未知物。定量分析采用HPLC-UV技術(shù)，1%乙酸水溶液-乙腈為流動相，梯度洗脫，測定10批黃芩中主要成分含量。從黃芩水煎液中分析鑒定了86種化合物，含65個黃酮、11個有機(jī)酸、7個氨基酸、2個苯乙醇苷、1個其他類化合物。對黃芩中黃芩苷、漢黃芩苷、千層紙素A-7--β--葡萄糖醛酸苷、黃芩素、漢黃芩素及千層紙素A進(jìn)行了含量測定，結(jié)果表明黃芩不同批次之間的黃酮類成分含量有一定差異，但6個黃酮的總量相對穩(wěn)定（18.09%～25.33%，RSD為9.95%）。全面分析了黃芩水煎液的化學(xué)成分，并建立了6個黃酮成分的定量分析方法，可為黃芩的質(zhì)量控制和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立提供數(shù)據(jù)參考。

黃芩水煎液；UHPLC LTQ-Orbitrap MS；黃酮；多成分定量分析；黃芩苷；漢黃芩苷；千層紙素A-7--β--葡萄糖醛酸苷；黃芩素；漢黃芩素；千層紙素A

黃芩為唇形科植物黃芩Georgi的干燥根。出自東漢《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血、安胎等功效[1]。黃芩在中醫(yī)臨床治療中的應(yīng)用十分廣泛，涵蓋了153種中醫(yī)疾病，主要涉及肺熱咳嗽、痞滿、瀉痢、胎動不安等[2]。目前已從黃芩中分離鑒定出百余種化合物，主要包括黃酮及其苷類、萜類及揮發(fā)油等，這些化合物有解熱、抗炎、抗微生物、抗腫瘤、抗氧化等藥理作用，對消化系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等疾病具有一定的治療作用[3]。黃芩醇提液中的化學(xué)成分的研究較多[4]，研究表明不同極性溶劑提取時所含的化學(xué)成分不盡相同。黃芩在臨床上主要以水煎液入藥，目前針對黃芩水煎液的研究較少，其化學(xué)組成仍不明晰。另一方面，在2018年公布的《古代經(jīng)典名方目錄（第一批）》中，其中有15首經(jīng)典名方含有黃芩，均為水煎劑形式入藥。因此，對黃芩水煎液含有的化學(xué)成分進(jìn)行定性和定量研究十分必要。

本研究采用超高效液相色譜串聯(lián)靜電場軌道阱質(zhì)譜（UHPLC LTQ-Orbitrap-MS）對黃芩水煎液的化學(xué)成分進(jìn)行全面分析和表征，采用高效液相色譜技術(shù)對10批黃芩樣品中主要黃酮類成分進(jìn)行含量測定，以上研究將為黃芩的質(zhì)量控制和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立提供數(shù)據(jù)參考，也將為含黃芩經(jīng)典名方的開發(fā)提供技術(shù)支撐。

1 材料

1.1 儀器

在線Dionex Ultimate 3000超高效液相色譜系統(tǒng)：含自動進(jìn)樣器、柱溫箱、在線真空脫氣機(jī)、低壓四元梯度泵、光電二極管陣列（PDA）檢測器以及LTQ Orbitrap velos pro質(zhì)譜儀（ESI源）；Xcalibur 2.1工作站（美國Thermo-Fisher公司）；KQ-250B型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；CP423C型電子天平（奧斯豪儀器上海有限公司）；Thermo Scientific Heraeus Multifuge X1R型高速離心機(jī)（美國Thermo公司）；Synthesis A7 TM型超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛朗儀器有限公司）。島津LC-20A型液相分析儀，LC-20AT泵、SIL-20A型樣品室、CTO-20A型柱溫箱、SPD-20A型檢測器（日本島津公司）；電熱恒溫水浴箱（北京市長風(fēng)儀器儀表公司）；三和松石粉碎機(jī)（SHIWUJIGONGJI公司，日本）。

1.2 藥物與試劑

10批黃芩飲片購自北京市各大藥房，均為主產(chǎn)地藥材，詳細(xì)信息見表1，經(jīng)中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所李先端研究員鑒定為唇形科植物黃芩Georgi的干燥根，樣品標(biāo)本保存于中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所。

表1 黃芩樣品信息

對照品黃芩苷（批號ZL20100805）、黃芩素（批號ZL20111009）、漢黃芩苷（批號ZL20101228）、漢黃芩素（批號ZL20110205）、千層紙素A-7--β--葡萄糖醛酸苷（批號ZL20110820）、千層紙素A（批號ZL20110125）購自南京澤朗醫(yī)藥有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于98%。毛蕊花糖苷（批號111845- 201604）、綠原酸（批號110753-201817）購自中國食品藥品檢定研究院。野黃芩苷（批號SH19112702）、夏佛塔苷（批號SH20092506）、咖啡酸（批號SH17122804）、原兒茶酸（批號SH20052804）、購自北京賽百草科技有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于98%；精氨酸購自北京百靈威科技有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為97%。

色譜級甲醇、乙腈及質(zhì)譜級甲酸購自賽默飛世爾生物化學(xué)制品（北京）有限公司；屈臣氏蒸餾水；其他化學(xué)品和溶劑均為分析純。

2 方法

2.1 鑒定條件

2.1.1 色譜條件 采用Waters ACQUITY UPLC HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）色譜柱。流動相為乙腈（A）和0.1%甲酸水（B），梯度洗脫0～5 min，5%～20% A；5～30 min，20%～30% A；30～40 min，30%～95% A。體積流量0.30 mL/min；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量2 μL。

2.1.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源（ESI），正、負(fù)離子模式下分別掃描。分別用超高純氦氣（He）和高純氮氣N2作為碰撞氣體和霧化氣體。正離子模式下的參數(shù)條件設(shè)置為：毛細(xì)管溫度350 ℃；鞘氣N2體積流量413.7 kPa；輔助氣N2體積流量68.95 kPa；負(fù)離子的參數(shù)條件設(shè)置為：毛細(xì)管溫度：350 ℃；鞘氣N2體積流量275.8 kPa；輔助氣N2體積流量68.95 kPa；質(zhì)譜質(zhì)量軸校準(zhǔn)采用外標(biāo)法（質(zhì)量誤差小于1×10?5）。一級質(zhì)譜在FT模式下進(jìn)行全掃描（分辨率R為30 000，掃描范圍/50～1500），二級及三級質(zhì)譜采用數(shù)據(jù)依賴性掃描，采用動態(tài)離子排除模式獲得更多化合物信息（優(yōu)化的參數(shù)條件設(shè)置為：repeat duration，30 s；exclusion list size，50；exclusion duration，180 s）。數(shù)據(jù)采集和分析采用Xcalibur 3.0，Metworks 1.3，Mass Frontier 7.0軟件。

2.2 定量條件

采用Dikma Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5mm）色譜柱，流動相為乙腈（A）-1%乙酸水（B）溶液，梯度洗脫：0～13 min，17% A；13～15 min，17%～20% A；15～50 min，20%～30% A；50～62 min，30%～40%A；62～70 min，40%～44% A；70～80 min，44%～100% A。檢測波長276 nm；體積流量1.0 mL/min；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量10mL。

2.3 對照品溶液的制備

2.3.1 質(zhì)譜鑒定對照品溶液制備 稱取各對照品適量置于10 mL量瓶中，加入50%甲醇，充分溶解后定容。搖勻后經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.3.2 含量測定對照品溶液制備 稱取對照品適量，加甲醇溶解后定容，制成含黃芩苷、漢黃芩苷、千層紙素A-7--β--葡萄糖醛酸苷、黃芩素、漢黃芩素和千層紙素A混合對照品溶液，質(zhì)量濃度分別為2.074、1.200、0.750、0.270、0.072 0、0.027 2 g/L，冷藏備用。

2.4 黃芩水煎液的制備

2.4.1 質(zhì)譜鑒定樣品溶液制備 黃芩藥材經(jīng)適當(dāng)粉碎后，過篩（40目），加10倍水，浸泡30 min，武火加熱至沸騰后，文火煎煮60 min，濾過，取上清液，濃縮，75 ℃減壓干燥至干，粉碎，得黃芩水煎液減壓干燥粉。稱取0.50 g減壓干燥粉末于50 mL錐形瓶中，加入50%甲醇10 mL，搖勻后超聲10 min，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，得質(zhì)譜鑒定樣品溶液。

2.4.2 含量測定樣品溶液制備 稱取0.50 g黃芩飲片樣品粉末，置錐形瓶中，加入75%乙醇50 mL，震搖，稱定質(zhì)量，80 ℃水浴中熱浸30 min，15 min震搖1次，取出后置水浴中放至室溫，再稱定質(zhì)量，補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，上清液用0.22mm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，得含量測定樣品溶液。

3 結(jié)果與分析

根據(jù)測得的精確相對分子質(zhì)量，應(yīng)用質(zhì)譜處理軟件在規(guī)定的誤差范圍內(nèi)（?5×10?6～5×10?6）計算可能的元素組成，根據(jù)各成分峰的二級質(zhì)譜碎片信息與對照品或文獻(xiàn)進(jìn)行比對，對色譜峰進(jìn)行定性分析。共鑒定推斷出86種化合物，含65個黃酮、11個有機(jī)酸、7個氨基酸、2個苯乙醇苷、1個其他類化合物。其中，14個成分通過與對照品比較保留時間、一級質(zhì)譜和多級質(zhì)譜信息得到確證。正離子模式下鑒定7個氨基酸化合物，負(fù)離子鑒定79個化合物，見圖1和表2。

3.1 黃酮類成分鑒定

3.1.1 黃酮碳苷類 黃酮碳苷是糖基與黃酮母核直接以C-C鍵相連的黃酮苷，結(jié)合位點主要在黃酮的C6、C8，黃酮碳苷在負(fù)離子模式下會連續(xù)丟失糖基片段。如六碳糖0-2開裂丟失C4H8O4（120）、0-3開裂丟失C3H6O3（90）、1-5開裂丟失C5H10O4（134）；五碳糖0-2開裂丟失C3H6O3（90）、0-3開裂丟失C2H4O2（60）、1-5開裂丟失C4H8O3（104）。糖基0-2開裂后的碎片離子常形成基峰。化合物19在正負(fù)離子模式下均有很好的響應(yīng)，在對照品指認(rèn)下準(zhǔn)確無誤的確定為夏佛塔苷（圖2）。負(fù)離子模式下保留時間為6.66 min的一級質(zhì)譜中出現(xiàn)相對分子質(zhì)量為/563.137 1（C26H27O14，誤差?4.35×10?6）的準(zhǔn)分子離子峰。二級質(zhì)譜中出現(xiàn)由于六碳糖的0-2開裂丟失的C4H8O4（120）中性片段而產(chǎn)生質(zhì)量數(shù)為/443.101 1（C22H19O10）的基峰離子，同時可見六碳糖0-3開裂丟失C3H6O3（90）片段生成的碎片離子/473.111 7（C23H21O11），五碳糖0-3開裂丟失C2H4O2（60）片段后產(chǎn)生的碎片離子/503.1228（C24H23O12）。碎片離子/413.090 4（C21H17O9，[M－H－C2H4O2－C3H6O3]?）、/383.079 6（C20H15O8，[M－H－C4H8O4－C2H4O2]?）、/353.068 9（C19H13O7，[M－H－C4H8O4－C3H6O3]?）均是由于中性丟失糖基片段而生成。碎片離子/353丟失羰基CO生成碎片峰/325.073 4（C18H13O6）、碎片離子/325進(jìn)一步丟失羰基CO生成碎片峰/297.078 4（C17H13O5）。[M－H]?峰脫去1分子H2O后生成碎片峰/545.133（C26H25O13）[5]。

化合物21（R＝7.65 min）、27（R＝8.31 min）一級質(zhì)譜中產(chǎn)生相同的準(zhǔn)分子離子峰/547.143 4（C26H27O13，[M－H]?，誤差?2.17×10?6）和/547.143 1（C26H27O13，[M－H]?，誤差?2.83×10?6），二級質(zhì)譜中可見以丟失C2H4O2（60）、C3H6O3（90）、C4H8O4（120）、H2O（18）、CO（28）為特征的碎片離子，據(jù)此判斷二者均為含有1分子六碳糖和1分子五碳糖的黃酮碳苷類成分?；衔?1產(chǎn)生的碎片離子/457.117 1（C23H21O10，[M－H－C3H6O3]?）相對豐度最大，而化合物27產(chǎn)生的碎片離子/427.106 8（C22H19O9，[M－H－C4H8O4]?）相對豐度最大，除此以外二者其余碎片離子均相同。據(jù)報道C6位的糖基更容易發(fā)生CID裂解，糖基片段的0/2裂解更容易產(chǎn)生，MS/MS質(zhì)譜圖見圖3。因此推測化合物21的C6位連有1分子五碳糖，化合物27的C6位連有1分子六碳糖。與文獻(xiàn)報道一致[4-7]，因此推測化合物21和27分別為6--阿拉伯糖基-8--葡萄糖基白楊素和6--葡萄糖基-8--阿拉伯糖基白楊素。

圖1 黃芩水煎液在正和負(fù)離子模式下UHPLC-LTQ-Orbitrap-MS的BPC圖

表2 黃芩水煎液中化學(xué)成分的鑒定

續(xù)表2

續(xù)表2

*經(jīng)對照品比對的化合物，加粗峰表示基峰

*confirmed by control substance, the black bold/values in MS/MS represented the base peaks

圖2 化合物19 (夏佛塔苷)的可能裂解途徑

化合物30（R＝8.79 min）、34（R＝9.7 min）一級質(zhì)譜中出現(xiàn)相同的準(zhǔn)分子離子峰/415.101 0（C21H19O9，誤差?3.18×10?6）和/415.101 3（C21H19O9，誤差?2.57×10?6），二級質(zhì)譜中出現(xiàn)顯著的由于中性丟失C4H8O4（120）片段產(chǎn)生的二級碎片離子/295.062 7（C17H11O5），同時可見丟失C3H6O3（90）而生成的碎片離子/325.073 3（C18H13O6），由上述裂解情況可推知化合物30和34均為連接1分子六碳糖的黃酮碳苷類化合物。碎片離子/295失去1分子CO生成/267.067 5（C16H11O4）?；衔?0和34互為同分異構(gòu)體，與文獻(xiàn)報道[4,8]一致，推測2個分子分別為8--葡萄糖基白楊素、6--葡萄糖基白楊素。

圖3 化合物21和27的MS/MS質(zhì)譜圖

3.1.2 二氫黃酮類 化合物20（R＝6.87 min）、36（R＝10.11 min）的準(zhǔn)分子離子峰為/303.049 4（C15H11O7，誤差?1.81×10?6/?1.91×10?6），二級質(zhì)譜中可見因C環(huán)開裂形成的基峰離子/125.024 6（C6H5O3），推測是由于在C環(huán)發(fā)生1/4裂解，1,4A-部分生成的碎片離子，同時推斷A環(huán)部分有兩個羥基取代，根據(jù)分子式判斷其為五羥基二氫黃酮。二級質(zhì)譜中可見CO、H2O、CO2中性小分子的丟失，二者產(chǎn)生相同的碎片離子/285.042 1（C15H9O6）、/275.057 6（C14H11O6）、/259.062 7（C14H11O5）。碎片離子/177.020 3（C9H5O4）可能由于C2-1′鍵斷裂失去B環(huán)部分形成，再失去1分子CO生成碎片離子/149.025 1（C8H5O3）。查閱相關(guān)文獻(xiàn)[4,9]，根據(jù)出峰前后順序，化合物20、36分別推測為3,5,7,2′,6′-pentahydroxyflavanone和3,6,7,2′,6′- pentahydroxyflavanone。

化合物22（R＝7.83 min）和28（R＝8.55 min）在一級質(zhì)譜中可見豐度很高的[M－H]?峰/463.086 6（C21H19O12，誤差?1.06×10?6）和/463.086 5（C21H19O12，誤差?1.32×10?6）。二者裂解行為相同。二級質(zhì)譜中明顯可見中性丟失C6H8O6（176）而生成的碎片離子/287.057 8（C15H11O6），推測結(jié)構(gòu)中連有1分子葡萄糖醛酸。碎片離子/269.046 4（C15H9O5）是由/287失去1分子H2O生成，推測存在鄰二羥基結(jié)構(gòu)；并可見碎片離子/153.019 8（C7H5O4），推測是由于C環(huán)裂解后生成。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報道[4]，化合物22、28為carthamidin- 7--glucuronide或其同分異構(gòu)體。

負(fù)離子模式下，化合物43（R＝14.36 min）、44（R＝14.81 min）的裂解行為與黃芩苷相似，準(zhǔn)分子離子峰分別為/447.090 2（C21H19O11，誤差?4.36×10?6）、/447.090 7（C21H19O11，誤差?3.4×10?6）和碎片離子均比黃芩苷的碎片多2個H原子。生成的苷元/271.062 2（C15H11O5）推斷為三羥基二氫黃酮。結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)報道，將化合物43、44推導(dǎo)為二氫黃芩苷或其異構(gòu)體?；衔?2（R＝14.36 min），準(zhǔn)分子離子峰為/287.054 3（C15H12O6，誤差?2.63×10?6），經(jīng)對比分子式不飽和度判斷為四羥基二氫黃酮。二級質(zhì)譜中可見C環(huán)裂解后的碎片離子/161.025 5（C9H5O3）和/125.025 3（C6H5O3）推測分別是由1,4A-部分和1,4B-部分生成A環(huán)和B環(huán)分別有2分子羥基取代。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報道[4]，推測化合物42為5,7,2′,6′- tetrahydroxyflavanone。

3.1.3 黃酮類 在負(fù)離子模式下，化合物70（R＝25.11 min）在對照品指認(rèn)下準(zhǔn)確無誤的確定為黃芩素，黃芩素是5,6,7-三羥基黃酮，正負(fù)離子模式下均有響應(yīng)，負(fù)離子模式下響應(yīng)更好。一級質(zhì)譜中出現(xiàn)相對分子質(zhì)量為/269.043 7（C15H9O5，[M－H]?，誤差?2.79×10?6）的準(zhǔn)分子離子峰。二級質(zhì)譜中出現(xiàn)顯著的二級碎片離子/251.036 3（C15H7O4），這是由于存在的鄰二羥基結(jié)構(gòu)脫去1分子H2O（18）而生成。碎片離子/241.051 9（C14H9O4）、/225.056 5（C14H9O3）分別是[M－H]?失去CO、CO2而生成。質(zhì)量數(shù)為/251的離子失去CO、CO2分別生成碎片離子/223.041 1（C14H7O3）、/207.045 9（C14H7O2）。離子/241失去1分子CO2生成碎片離子/197.061 7（C13H9O2），進(jìn)一步失去1分子CO生成碎片離子/169.066 7（C12H9O）。準(zhǔn)分子離子在C環(huán)發(fā)生裂解，1,3A-部分生成碎片離子/166.999 4（C7H3O5），0,4A-部分生成碎片離子/123.009 4（C6H3O3），1,4A-部分生成碎片離子/139.004 3（C6H3O4）。在負(fù)離子模式下可能的裂解途徑見圖4。

化合物79（R＝34.22 min）在對照品指認(rèn)下準(zhǔn)確無誤的確定為漢黃芩素，漢黃芩素是5,7-二羥基- 8-甲氧基黃酮，一級質(zhì)譜中可見準(zhǔn)分子離子峰/283.059 9（C16H11O5，[M－H]?，誤差?0.67×10?6）。二級質(zhì)譜中出現(xiàn)明顯的基峰離子/268.038 9（C15H8O5），這是因甲氧鍵斷裂失去1分子CH3（15）而產(chǎn)生的，該離子失去CHO、CO、CO2等小分子后生成碎片離子/239.036 6（C14H7O4）、/224.049 1（C14H8O3）、/212.049 1（C13H8O3）、/196.054 5（C13H8O2）、/184.054 4（C12H8O2）。質(zhì)量數(shù)為/268的離子經(jīng)裂解0,2A-部分生成碎片離子/163.005 0（C8H3O4）?；衔?3與漢黃芩素的準(zhǔn)分子離子峰、碎片離子均相同，根據(jù)出峰先后順序及對照品比對確認(rèn)化合物83為千層紙素A。

圖4 化合物70 (黃芩素)在負(fù)離子模式下可能的裂解途徑

化合物25（R＝8.09 min）一級質(zhì)譜中可見準(zhǔn)分子離子峰/301.033 8（C15H9O7，誤差?1.46×10?6），二級質(zhì)譜中可見發(fā)生環(huán)開裂反應(yīng)而生成的碎片離子。在C環(huán)發(fā)生1/4裂解1,4A-部分生成的碎片離子/125.025 5（C6H5O3），發(fā)生1/3裂解1,3A-部分生成的碎片離子/151.005 0（C7H3O4），C2-1′鍵斷裂生成的碎片離子/193.015 2（C9H5O5）。碎片離子/283.026 9（C15H7O6）、/273.042 1（C14H9O6）、/257.047 2（C14H9O5）、/229.052 1（C13H9O4）、/215.036 2（C12H7O4）是由于丟失CO、H2O、CO2、C3O2中性小分子而生成。根據(jù)分子式判斷是五羥基黃酮，根據(jù)裂解情況推測A環(huán)有2個羥基取代，C3連有羥基，B環(huán)有2個羥基取代，查閱相關(guān)文獻(xiàn)報道[10]，推斷其為3,5,7,2′,6′- pentahydroxyflavone。

化合物78、86，在正負(fù)離子模式下均有響應(yīng)。在負(fù)離子模式下，二者保留時間分別在34.11、35.59 min，準(zhǔn)分子離子峰為/343.080 4（C18H15O7，誤差?2.3×10?6）和343.080 1（C18H15O7，誤差?3.18×10?6。根據(jù)分子式和不飽和度判斷，二者均為二羥基三甲氧基黃酮類化合物。失去CH3、CO2、H2O等小分子生成碎片離子/328、313、295、285、269。區(qū)別在于化合物78經(jīng)裂解后，1,3A-部分生成碎片離子/195.030 8（C9H7O5，[M－H－C9H8O2]?）再失去1分子CH3后生成碎片離子/180.007 3（C8H4O5）；化合物86經(jīng)裂解1,3A-部分生成碎片離子/209.010 1（C9H5O6，[M－H－CH3－C8H7O]?），由此推知化合物78的A環(huán)上有1個羥基、2個甲氧基取代，C環(huán)上有1個羥基、1個甲氧基取代；化合物86的A環(huán)上有1個羥基、3個甲氧基取代，C環(huán)上有1個羥基取代。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報道[11]，推測化合物78、86分別是skullcapflavone、5,2′-dihydroxy- 6,7,8-trimethoxyflavone（tenaxin I）。

化合物26（R＝8.2 min）的準(zhǔn)分子離子峰為/507.111 0（C23H23O13，誤差?4.53×10?6）。糖苷鍵斷裂失去C6H10O5（162）生成苷元離子/345.063 3（C17H13O8），Y0-失去1分子CH3生成碎片離子/330.040 4（C16H10O8），失去2分子CH3生成碎片離子/315.016 4（C15H7O8），苷元對比分子式判斷為四羥基二甲氧基黃酮，據(jù)文獻(xiàn)報道[8]，推斷化合物26為viscidulin III-2′--β--glucoside。

化合物46（R＝14.93 min），一級質(zhì)譜中可見準(zhǔn)分子離子峰/445.111 7（C22H21O10，[M－H]?，誤差?2.77×10?6）。二級質(zhì)譜中可見顯著的丟失1分子CH3生成的基峰離子/430.093 2（C21H18O10），糖苷鍵斷裂失去C6H10O5（162）生成的苷元離子峰/283.062 8（C16H11O5）也較為明顯，同時可見Y0-失去1分子CH3生成的碎片離子/268.039 2（C15H8O5），對比苷元分子式判斷為二羥基一甲氧基黃酮，化合物46苷元裂解碎片與千層紙素A一致推測其為千層紙素A葡萄糖苷。

化合物53（R＝33.89 min）、56（R＝35.26 min）在對照品指認(rèn)下準(zhǔn)確無誤的確定為千層紙素A-7--葡萄糖醛酸苷和漢黃芩苷。一級質(zhì)譜中出現(xiàn)相同的準(zhǔn)分子離子峰/459.091 0（C22H19O11，[M－H]?，誤差?2.52×10?6），/459.090 8（C22H19O11，[M－H]?，誤差?3.11×10?6）。二者裂解行為相同，糖苷鍵斷裂脫去葡萄糖醛酸基（176）生成苷元離子/283.062 9（C16H11O5），苷元失去CH3生成碎片離子/268.039 7（C15H8O5）?；衔?7（R＝11 min）的準(zhǔn)分子離子為/475.085 8（C22H19O12，[M－H]?，誤差?2.78×10?6），糖苷鍵斷裂脫去葡萄糖醛酸基（176）生成苷元離子/299.057 6（C16H11O6），而后失去1分子CH3生成碎片離子/284.034 5（C15H8O6），應(yīng)為三羥基一甲氧基黃酮醛酸苷。化合物37的苷元離子經(jīng)裂解，0,4B-部分生成碎片離子/161.024 6（C9H5O3），由此推知B環(huán)上連有1分子羥基，推測化合物37為5,7,2′-三羥基- 6-甲氧基黃酮-7--葡萄糖醛酸苷[4,12]。

化合物52（R＝16.5 min）的準(zhǔn)分子離子峰為/429.079 7（C21H17O10，[M－H]?，誤差?4.46×10?6），失去葡萄糖醛酸基（176）生成苷元離子/253.051 8（C15H9O4）。苷元離子產(chǎn)生的碎片離子/225.057 7（C14H9O3）、/209.061 9（C14H9O2）、/181.066 7（C13H9O）、/165.071 6（C13H9）與白楊素碎片相同，據(jù)此可推測化合物52是白楊素的葡萄糖醛酸苷，且與葡萄糖醛酸基的結(jié)合位點只有5、7位，由于5位羥基會與4位羰基形成氫鍵不利于成苷，故7位成苷的可能性大?；衔?2推導(dǎo)為白楊素-7--葡萄糖醛酸苷[9]。

化合物64（R＝21.63 min）一級質(zhì)譜中的準(zhǔn)分子離子峰相同為/285.038 7（C15H9O6，[M－H]?）。二級質(zhì)譜中的碎片離子/257.047 1（C14H9O5）、/241.051 8（C14H9O4）、/229.051 5（C13H9O4）、/213.056 9（C13H9O3）、/199.041 0（C12H7O3）、/185.061 6（C12H9O2）、/171.046 2（C11H7O2）是失去CO、CO2和H2O小分子生成，同時可見經(jīng)RDA裂解后1, 3A-部分生成的碎片離子/151.003 9（C7H3O4）。1, 4A-部分生成的碎片離子/125.025 3（C6H5O3）推測化合物64為山柰酚（3,5,7,4′-四羥基黃酮）。

3.1.4 雙黃酮類化合物 雙黃酮化合物C環(huán)會發(fā)生開裂并且會發(fā)生各種小分子中性丟失，裂解途徑和黃酮的裂解相似?；衔?2（R＝34.72 min）的準(zhǔn)分子離子峰為/537.080 9（C30H17O10，[M－H]?，誤差?1.29×10?6）。C環(huán)發(fā)生0/4裂解，失去1分子C9H6O2（146）生成碎片離子/391.048 6（C21H11O8），再失去1分子C9H6O2（146）生成碎片離子/245.011 1（C12H5O6）?？赡艿牧呀馔緩揭妶D5，查閱相關(guān)文獻(xiàn)報道[9]，推斷化合物82為8,8″-bibaicalein。

圖5 化合物82 (8,8″-bibaicalein) 在負(fù)離子模式下可能的裂解途徑

3.2 有機(jī)酸類成分鑒定

3.2.1 脂肪酸類 負(fù)離子模式下，化合物6（R＝1.12 min）、7（R＝1.41 min）的準(zhǔn)分子離子峰分別為/133.013 7（C7H11O6，誤差3.84×10?6）、/191.018 7（C6H7O7，誤差0.42×10?6）。在二級質(zhì)譜中可見化合物6明顯失去H2O形成的基峰離子/115.004 5（C4H3O4），并且也檢測到由/115再丟失1分子CO2而生成的碎片離子/71.014 3（C3H3O2）；化合物7丟失1分子H2O生成碎片離子/173.010 1（C6H5O6）；丟失2分子H2O和1分子CO2后產(chǎn)生基峰碎片/111.009 5（C5H3O3）。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報道[11]推測化合物6、7分別為蘋果酸、檸檬酸。

3.2.2 酚酸類 負(fù)離子掃描模式下，化合物17（R＝5.85 min）在一級質(zhì)譜中的準(zhǔn)分子離子峰[M－H]?為/179.034 1（C9H7O4，誤差1.37×10?6），二級質(zhì)譜中出現(xiàn)顯著的由于失去1分子CO2生成的/135.045 7（C8H7O2）的基峰離子，并可見碎片離子/135失去1分子CO而生成的碎片離子/107.050 5（C7H7O）。經(jīng)對照品對比保留時間和碎片，確定化合物17為咖啡酸（3,4-二羥基肉桂酸）?；衔?4（R＝4.9 min）準(zhǔn)分子離子峰為/137.023 8（C7H6O3，[M－H]?），二級質(zhì)譜中出現(xiàn)丟失1分子CO2生成的質(zhì)量數(shù)為/93.034 9（C6H5O）的基峰離子?；衔?5（R＝10.06 min）準(zhǔn)分子離子及碎片離子與化合物14相同，但在色譜行為上保留較強(qiáng)，結(jié)合分子式和不飽和度，推測化合物14為羥基苯甲酸、35為水楊酸。化合物15（R＝4.9 min）的準(zhǔn)分子離子峰為/209.044 1（C10H9O5，[M－H]?，誤差1.91×10?6），二級質(zhì)譜中明顯可見失去CO2的碎片離子/165.055 8（C9H9O3），/165再失去1分子CO2生成碎片離子/121.066 1（C8H9O）并可見失去C2H4的碎片離子/93.034 7（C6H5O），推測其為hydroxyl-carboxyl phenylpropionic acid。

3.3 其他類成分鑒定

化合物24（R＝8.05 min）、31（R＝8.95 min）經(jīng)對照品比對確定為毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷，二者為一對同分異構(gòu)體，裂解模式一致。負(fù)離子模式下保留時間分別在8.05、8.95 min出現(xiàn)質(zhì)量數(shù)為/623.195 6（C29H35O15，[M－H]?，誤差?2.39×10?6）和/623.195 4（C29H35O15，[M－H]?，誤差?2.69×10?6）的準(zhǔn)分子離子峰。二級質(zhì)譜中出現(xiàn)豐度最高的碎片離子/461.169 4（C20H29O12）是由于酯鍵斷裂失去1分子咖啡酰基（C9H6O3，162）生成，同時可見糖苷鍵斷裂失去1分子鼠李糖（C6H10O4，146）的碎片離子/477.141 7（C23H25O11），失去1分子3,4二羥基苯乙基（C8H8O2，136）而生成的碎片離子/487.147 9（C21H27O13）以及糖苷鍵斷裂后的咖啡酰氧基部分的碎片離子/179.036 1（C9H7O4）。/461失去1分子H2O（18）生成碎片離子/443.158 7（C20H27O11），失去1分子鼠李糖生成碎片離子/315.110 7（C14H19O8），/315失去1分子H2O生成碎片離子/297.099 6（C14H17O7）。咖啡酰氧基部分/179失去CO2生成碎片離子/135.046 3（C8H7O2）[13]。推測化合物24可能的裂解途徑見圖6。

3.4 定量測定

3.4.1 線性范圍及定量限 將混合對照品溶液用甲醇倍比稀釋，精密吸取上述稀釋液及母液各10mL進(jìn)樣，按“2.1”項下方法測定。分別以峰面積為縱坐標(biāo)（），以進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)（）繪制工作曲線，各成分色譜保留時間，回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍及定量限（LOQ）、檢出限（LOD）等信息見表3。色譜圖見圖7。

3.4.2 精密度試驗 精密吸取混合對照品溶液，按“2.2”項下方法進(jìn)行含量測定，連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果6個成分峰面積的RSD在0.48%～4.93%，表明儀器的精密度良好。

3.4.3 重復(fù)性試驗 取同一批次樣品（JX20120523），平行稱取6份，按“2.2”和“2.4.2”項下方法進(jìn)行含量測定，結(jié)果6個成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD在1.81%～5%，表明方法的重復(fù)性良好。

圖6 化合物24 (毛蕊花糖苷) 在負(fù)離子模式下可能的裂解途徑

表3 6種被測成分的色譜保留時間、線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍和LOD、LOQ

1-黃芩苷 2-千層紙素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷 3-漢黃芩苷 4-黃芩素 5-漢黃芩素 6-千層紙素A

3.4.4 穩(wěn)定性試驗 取同一批次樣品（JX20120523），按“2.4.2”項下方法制備，分別在制備后0、3、6、9、 12 h進(jìn)行測定，結(jié)果6個成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD在0.21%～2.91%，表明各成分穩(wěn)定性良好。

3.4.5 加樣回收率試驗 取同一批次已測定的供試品，平行稱取6份，加入質(zhì)量濃度相近的混合對照品，按“2.2”和“2.4.2”項下方法進(jìn)行含量測定，結(jié)果6個成分的加樣回收率在90%～101%，RSD在2.55%～5.00%。表明提取方法的準(zhǔn)確性良好。

3.4.6 樣品測定 取10批次黃芩飲片，按“2.4.2”項下方法制備黃芩供試品溶液，每批次樣品平行制備3份，按“2.2”項下方法測定6個成分的含量，計算各成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)及RSD，結(jié)果見表4。

黃芩樣品中的6個成分在含量上差異性較大，黃芩苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高為17.85%（HQS-8），千層紙素A的質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低為0.17%（HQS-7）；同一個成分的含量在樣品中也有很大的差異性，如黃芩素的含量最低的為0.91%（HQS-4），最高為3.54%（HQS-3），含量差異近4倍，RSD為49.04%。所測黃芩樣品中的6個成分在化學(xué)類別上可分為黃酮苷和黃酮苷元，其中3種黃酮苷成分的總量（均值為19.64%）明顯大于3種黃酮苷元成分的總量（均值為2.96%）；10批黃芩樣品在含量上的差異性，3種黃酮苷元（RSD為47.46%）較3種黃酮苷（RSD為17.62%）更為明顯，但6個黃酮成分總量的變異性比黃酮苷和苷元都要小得多（均值為22.60%，RSD為9.95%）。

4 討論

UHPLC技術(shù)具有超高效、超高分離度的特點，在中藥復(fù)雜體系的分離上顯示出巨大的優(yōu)勢。MS技術(shù)可提供豐富的化合物結(jié)構(gòu)信息，具有高特異性和高靈敏性。伴隨技術(shù)日益發(fā)展，多種分離方法和質(zhì)譜儀器的聯(lián)用使化學(xué)成分結(jié)構(gòu)解析及微量成分的體內(nèi)體外定量分析成為可能。LC-MS技術(shù)同時具有強(qiáng)大的分離能力和結(jié)構(gòu)鑒定的優(yōu)勢，可通過對已知同類化合物的質(zhì)譜裂解規(guī)律的總結(jié)，再參考未知成分的保留時間（極性）及多級碎片等信息，實現(xiàn)對未知化合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行合理推測。本實驗中使用UHPLC LTQ-Orbitrap-MS，線性離子阱可以實現(xiàn)多級質(zhì)譜功能，靜電場軌道阱可提供高分辨的質(zhì)譜信息[14]。液質(zhì)聯(lián)用的正負(fù)離子互補(bǔ)技術(shù)是鑒定中藥復(fù)雜體系的可靠手段。使用數(shù)據(jù)依賴性掃描得到高質(zhì)量的碎片離子信息，采用質(zhì)譜動態(tài)離子排除模式獲得共流出低含量化合物的質(zhì)譜信息，在高分離度、高靈敏度的條件下得到復(fù)方中所含化合物的精確分子量及碎片離子信息[15]。

表4 10批黃芩中6個成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分析(n= 3)

黃芩是重要的清熱中藥，在2018年國家中醫(yī)藥管理局會同國家藥品監(jiān)督管理局制定并公布的《古代經(jīng)典名方目錄（第一批）》中，包含黃芩的經(jīng)典名方有15首。其中，漢代名方2首（半夏瀉心湯、甘草瀉心湯），唐代名方1首（小續(xù)命湯），宋代名方2首（清心蓮子飲、甘露飲），金代名方2首（當(dāng)歸六黃湯、大秦艽湯），明代名方5首（清金化痰湯、桑白皮湯、保陰煎、清肺湯、達(dá)原飲），清代名方3首（二冬湯、宣郁通經(jīng)湯、涼血地黃湯）。含黃芩的經(jīng)典名方均為水煎劑形式入藥，因此本研究主要分析黃芩水煎液含有的化學(xué)成分。宋偉峰等[16]采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析鑒定了21個黃芩水煎液成分，但黃芩水煎液的化學(xué)組成仍不明晰。本研究采用UHPLC LTQ-Orbitrap-MS，使用數(shù)據(jù)依賴性掃描及質(zhì)譜動態(tài)離子排除模式，快速鑒定了黃芩水煎液中的65個黃酮類化合物、11個有機(jī)酸、7個氨基酸、2個苯乙醇苷、1個其他類化合物。黃芩含有的黃酮類成分具有較強(qiáng)的生物活性，有明顯的抗菌抗炎抗病毒抗感染作用，并對氧化應(yīng)激、炎癥通路等均有影響[17-18]。因此進(jìn)一步采用HPLC-UV技術(shù)對10批黃芩樣品的6個主要的黃酮類成分進(jìn)行了含量測定。

含量測定實驗中比較了Aglient Zorbax SB-C18和Dikma Diamonsil C18色譜柱，甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%乙酸溶液、乙腈-0.5%乙酸溶液、乙腈-1%乙酸溶液及乙腈-2%乙酸溶液等不同流動相的洗脫效果，結(jié)果使用Dikma Diamonsil C18色譜柱，流動相為乙腈-1%乙酸溶液的梯度洗脫方法時，色譜峰均能達(dá)到基線分離，主要成分如黃芩苷、黃芩素等色譜峰的分離度均大于1.5。千層紙素A色譜峰的分離度為1.0，由于千層紙素A含量和其他成分相比較低（質(zhì)量分?jǐn)?shù)平均為0.37%），對黃酮總量的結(jié)果影響較小，因此未做進(jìn)一步優(yōu)化?？疾炝思状?、75%甲醇、50%甲醇、乙醇、75%乙醇、50%乙醇和純水對黃芩的提取效果，結(jié)果表明75%乙醇提取時，各成分的峰面積最大，所以本研究中定量實驗部分的提取溶劑為75%乙醇。比較了室溫冷浸60、120、180、240 min，80 ℃水浴熱浸30、60、90、120 min，以及室溫水浴超聲20、40、60、80、100、120 min對黃芩的提取效果，結(jié)果冷浸法180 min，熱浸法30 min和超聲法60 min后各時間點峰面積基本不再變化，說明樣品各方法在此時間點已提取徹底，3個方法相比，熱浸法效果最優(yōu)，效率也高，所以本實驗定量選擇在80 ℃水浴中熱浸30 min，提取溶劑為75%乙醇的提取方法。

含量測定結(jié)果表明黃芩不同批次之間黃酮類成分的含量有一定差異，但6個黃酮的總量相對穩(wěn)定（質(zhì)量分?jǐn)?shù)18.09%～25.33%，RSD為9.95%）。已證實黃芩中的黃酮類成分具有類似的生物活性[17-18]；這些黃酮類成分的苷和苷元在植物和動物體內(nèi)、外可以相互轉(zhuǎn)化[27]；并且也有文獻(xiàn)表明不同產(chǎn)地黃芩中黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素和千層紙素A等成分的含量有一定差異性[28]，因此相比現(xiàn)行藥典中黃芩質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中單個指標(biāo)含量測定的要求（含黃芩苷不得少于8.0%），如果對黃芩中黃芩苷、漢黃芩苷、千層紙素A-7--β--葡萄糖醛酸苷，3種黃酮苷的總量（12.86%～23.73%）或者黃芩苷、漢黃芩苷、千層紙素A-7--β--葡萄糖醛酸苷、黃芩素、漢黃芩素和千層紙素A6個黃酮的總量（18.09%～25.33%）加以控制或許對黃芩的質(zhì)量評價和控制更有意義，這仍需要進(jìn)一步證實。

總之，本研究建立的方法可以簡便、快速地對黃芩水煎液的化學(xué)成分進(jìn)行定性及定量研究，結(jié)果將為黃芩的質(zhì)量控制和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立提供數(shù)據(jù)參考，并且對黃芩的標(biāo)準(zhǔn)湯劑、配方顆粒及含黃芩的經(jīng)典名方的開發(fā)具有一定的指引作用。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Qualitative and quantitative study on chemical constituents indecoction

GAO Wen-ya1, LI Tao1, 2, ZHOU Yan-yan1, LI Ming-li1, WANG Lin-na1, ZHAO Hai-yu1, BIAN Bao-lin1, WANG Hong-jie1, FENG Xue1, YANG Wei-peng1, SI Nan1

1. Institute of Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100700, China 2. Experimental Research Center, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100700, China

The chemical components were qualitatively analyzed and the main components were quantitatively studied indecoction, which provided the basis for the establishment of quality standard and further study.UHPLC LTQ-Orbitrap MS was used to analyze the chemical composition with 0.1% formic acid-acetonitrile as mobile phase. The precise molecular weight and fragment ion information of the compounds were analyzed. The unknown components were identified unambiguously by comparing with the retention time and mass spectrometric data of reference standards or tentatively deduced by their CID pathways referring to previous literatures. HPLC-UV was used to build multicomponent quantitative analysis with 1% acetic acid-acetonitrile as mobile phase. The ten batches of samples were evaluated by the similarity analysis.A total of 86 compounds were identified or tentatively characterized, containing 65 flavonoids, 11 organic acids, seven amino acids, two phenylethanol glycosides and one other compound fromdecoction. The content of six flavonoids (Baicalin, wogonoside, oroxylin A-7--β--glycoside, baicalein, wogonin and oroxylin A) was determined. The results showed that there were some differences in the content of flavonoids between different batches of, but the total amount of six flavonoids was relatively stable (18.09%—25.33%, RSD of 9.95%).This study provides a comprehensive analysis of the chemical composition and builds multicomponent quantitative analysis method ofdecoction, which provides a scientific basis for the quality control and further refinement of quality control standards for.

decoction; UHPLC-LTQ-Orbitrap MS; flavonoids; multiple-component quantitative analysis; baicalin; wogonoside; oroxylin A-7--β--glycoside; baicalein; wogonin; oroxylin A

R284.1

A

0253 - 2670(2022)23 - 0 - 14

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.23.

2022-04-12

中國中醫(yī)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程項目（CI2021A04405，Cl2021A04502）；中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費專項（JJPY2022003，ZZ2019008，ZZ14-YQ-041）；國家中醫(yī)藥管理局青年岐黃學(xué)者項目；杭州市錢江特聘專家項目（2020）

高文雅，滿族，博士生，主要從事中藥活性物質(zhì)基礎(chǔ)及生物學(xué)表征研究工作。E-mail: gaowenya0215@163.com

通信作者：楊偉鵬，研究員，主要從事中藥藥理及新藥研究。Tel/Fax: (010) 64029529 E-mail: yangweipeng@icmm.ac.cn

司 南，副研究員，從事中藥化學(xué)與分析研究工作，Tel: (010)84041249 E-mail: nsi@icmm.ac.cn

并列第一作者李 濤，副研究員，主要從事中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及藥代動力學(xué)研究。E-mail: hndxlitao@163.com

[責(zé)任編輯 王文倩]