程靜，盧立，關(guān)鑫磊，吳濤，劉立，任朝陽，宋紅萍

(1.武漢市第四醫(yī)院藥學(xué)部，武漢 430033； 2.武漢市東西湖區(qū)醫(yī)保局，武漢 430041)

慢性難愈性創(chuàng)面，如糖尿病足、壓瘡、放射性潰瘍、靜脈淤滯性潰瘍等是臨床常見的疾病，病程長(zhǎng)，病情遷延難愈，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，成為臨床上急需解決的難點(diǎn)。武漢市第四醫(yī)院制劑室研發(fā)的復(fù)方硝酸甘油凝膠劑，前期實(shí)驗(yàn)顯示其具有調(diào)節(jié)潰瘍創(chuàng)面新生毛細(xì)血管數(shù)量、促進(jìn)創(chuàng)面愈合的作用[1]。本實(shí)驗(yàn)探索復(fù)方硝酸甘油凝膠劑對(duì)激素誘導(dǎo)的慢性難愈性創(chuàng)面的作用?，F(xiàn)階段慢性難愈性創(chuàng)面尤其是高糖環(huán)境所致的慢性難愈性創(chuàng)面的患者不斷增多，本實(shí)驗(yàn)考察復(fù)方硝酸甘油凝膠劑對(duì)高糖誘導(dǎo)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs) 損傷的作用，為后續(xù)研究其對(duì)糖尿病性慢性難愈性創(chuàng)面的作用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞 HUVECs細(xì)胞株由武漢普諾賽生命科技有限公司提供。取含10%胎牛血清(FBS)、1%雙抗的F12K培養(yǎng)基置于37 ℃、5%二氧化碳(CO2)細(xì)胞培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。每隔1 d換液，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 無特定病原體(SPF)級(jí)，SD雄性大鼠30只，體質(zhì)量220～250 g，購自華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(鄂)2021-0009。動(dòng)物自由進(jìn)食飲水，12 h明暗交替光照，環(huán)境溫度23～27 ℃，相對(duì)濕度45%～75%。所有實(shí)驗(yàn)操作遵循國(guó)際衛(wèi)生研究機(jī)構(gòu)關(guān)于動(dòng)物使用倫理學(xué)方面的原則。

1.1.3主要試劑和儀器 復(fù)方硝酸甘油凝膠劑(制劑室在研，處方由硝酸甘油5%，醋酸氯己定0.3%等組成，批號(hào)：20200429)。京萬紅(批號(hào)：211509)，購于天津達(dá)仁堂達(dá)二藥業(yè)有限公司；0.1 g注射用氫化可的松琥珀酸鈉(批號(hào)：202107041)，購于煙臺(tái)東誠(chéng)北方制藥有限公司；白細(xì)胞介素(IL)-1、IL-10試劑盒(批號(hào)：20211104，20211027)，購于南京建成生物工程研究所；DMEM/F12培養(yǎng)液(貨號(hào)：SH30023)，購于武漢普諾賽生命科技有限公司；Transwell小室，購于美國(guó)Corning公司；胎牛血清(貨號(hào)：141215)，購于杭州天杭生物科技有限公司；胰酶-EDTA(貨號(hào)：GNM25200)、磷酸鹽緩沖液(PBS，貨號(hào)：GNM20012)，購于吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司；CCK-8檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)：C0038)，購于碧云天生物技術(shù)有限公司；結(jié)晶紫染液(貨號(hào)：AS1086)，購于武漢阿斯本生物技術(shù)有限公司；CO2恒溫培養(yǎng)箱(SCO6WE)由SHEL LAB提供；潔凈工作臺(tái)(SW-CJ-1FD)由蘇凈安泰提供；酶標(biāo)檢測(cè)儀(DR-200Bs)由Diatek提供。病理組織包埋冷凍臺(tái)(BMJ-A型)由中國(guó)常州市中威電子儀器有限公司提供；自動(dòng)組織脫水機(jī)，VP1～JC，由日本櫻花公司提供；石蠟切片機(jī)(LEICA RM2235)由德國(guó)提供；倒置顯微鏡(IX51)由日本OLYMPUS公司提供。Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件，美國(guó)Media Cybernetics公司提供。

1.2方法

1.2.1對(duì)高糖誘導(dǎo)HUVECs細(xì)胞損傷模型細(xì)胞活力的影響 前期已通過CCK-8法檢測(cè)復(fù)方硝酸甘油對(duì)HUVECs細(xì)胞存活率的試驗(yàn)，選取細(xì)胞存活率在80%以上且對(duì)細(xì)胞活力無顯著性影響的濃度作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的給藥濃度[2]。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用胰蛋白酶消化，配制成濃度為每毫升懸液1×105個(gè)細(xì)胞，按每孔1×104個(gè)細(xì)胞接種于96孔板，每孔加100 μL，置于CO2(5%)培養(yǎng)箱中37 ℃下培養(yǎng)24 h。細(xì)胞分組，分為正常對(duì)照組(葡萄糖濃度為5.5 mmol·L-1)，模型對(duì)照組(葡萄糖濃度為33 mmol·L-1)，實(shí)驗(yàn)組(分別加入終濃度為0.01，0.1，1 mmol·L-1的復(fù)方硝酸甘油凝膠劑，葡萄糖濃度為33 mmol·L-1)，每組6個(gè)復(fù)孔。給藥后72 h，每孔加入CCK-8溶液10 μL，培養(yǎng)箱中孵育2 h，使用酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)450 nm處吸光度(A值)。以溶劑處理的細(xì)胞為對(duì)照組，按公式計(jì)算復(fù)方硝酸甘油凝膠劑對(duì)細(xì)胞的相對(duì)存活率，細(xì)胞存活率(%)=(實(shí)驗(yàn)組A值/模型對(duì)照組A值)×100%。

1.2.2對(duì)高糖誘導(dǎo)HUVECs細(xì)胞損傷模型Transwell遷移能力的影響[3]取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的HUVECs細(xì)胞，將細(xì)胞制成每毫升懸液1×105個(gè)細(xì)胞，取細(xì)胞懸液1 mL于1500 r·min-1離心5 min，棄上清液。加入無血清培養(yǎng)基1 mL，吹打均勻后取細(xì)胞懸液200 μL放入transwell小室中，上室各接種上正常對(duì)照組的HUVECs細(xì)胞及經(jīng)高糖誘導(dǎo)細(xì)胞損傷的HUVECs細(xì)胞，下室加入含不同濃度復(fù)方硝酸甘油凝膠劑的條件培養(yǎng)基(同“1.2.1”)。24孔板中加入含10% FBS的完全培養(yǎng)基500 μL，將小室放入板中，在37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h。將小室取出，用PBS洗去培養(yǎng)基，用棉簽將上室中的膠和細(xì)胞擦除干凈，多聚甲醛固定20 min，PBS洗2次，結(jié)晶紫染色10 min，洗去表面的結(jié)晶紫，于倒置顯微鏡下對(duì)非細(xì)胞接種側(cè)攝相同時(shí)對(duì)附著在小室膜下室側(cè)經(jīng)結(jié)晶紫染色后攝相(顯微鏡放大倍數(shù)×100)，Image J軟件分析各組細(xì)胞的遷移細(xì)胞計(jì)數(shù)，隨機(jī)計(jì)數(shù)6個(gè)視野，取平均值，每組重復(fù)3次。

1.2.3對(duì)高糖誘導(dǎo)HUVECs細(xì)胞損傷模型劃痕實(shí)驗(yàn)的影響[4]先用Marker筆在6孔板背后均勻畫平行的直線，0.5～1 cm一道，橫穿過孔，每孔5條。取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的HUVECs細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度使鋪板細(xì)胞密度為5×105個(gè)·mL-1，將細(xì)胞接種到6孔板中，每孔加入細(xì)胞懸液2 mL，培養(yǎng)孵育72 h。待細(xì)胞單層在6孔板底部鋪滿時(shí)，用200 μL無菌槍頭垂直于Marker筆的橫線劃痕，PBS清洗3次，按照上面分組加入不同藥物和培養(yǎng)基(同“1.2.2”)，置于5%CO2培養(yǎng)箱中37 ℃下培養(yǎng)24 h。倒置光學(xué)顯微鏡下觀察并攝相，使用IPP軟件測(cè)量0 h以及24 h的細(xì)胞劃痕面積(間隙寬度)的平均長(zhǎng)度來確定遷移程度，計(jì)算公式：劃痕愈合百分比(%)=(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%。

1.2.4對(duì)激素誘導(dǎo)的慢性難愈性創(chuàng)面修復(fù)作用實(shí)驗(yàn)研究[5-6]雄性SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后用于潰瘍模型的建立，用10%水合氯醛0.4 g·kg-1腹腔內(nèi)麻醉后背部剃毛，用直徑為2 cm的打孔器在背部正中打孔，深度達(dá)到筋膜層，2 h后創(chuàng)面局部多處肌內(nèi)注射0.8%氫化可的松(給藥劑量80 mg·kg-1)，制成難愈性創(chuàng)面模型。然后按體質(zhì)量采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為3組，每組10只，動(dòng)物皮膚給藥按照每平方厘米計(jì)算，分別為復(fù)方硝酸甘油凝膠劑組(0.98 g·kg-1)、陽性組(京萬紅)(0.79 g·kg-1)、模型對(duì)照組(等量空白凝膠基質(zhì))。各組于造模次日開始涂藥。各組分別在造模后第14天取創(chuàng)面中心肉芽組織馬松(Masson)染色，用Image-Pro plus(IPP)6圖像分析軟件測(cè)定創(chuàng)面膠原蛋白面積與視野內(nèi)創(chuàng)面的總面積，兩者比值的百分比即為膠原蛋白含量，記錄并計(jì)算平均值。采用ELISA法測(cè)定血清IL-1、IL-6水平。

2 結(jié)果

2.1對(duì)高糖誘導(dǎo)HUVECs細(xì)胞損傷模型細(xì)胞活力的影響 預(yù)實(shí)驗(yàn)確定使用含33 mmol·L-1葡萄糖的高糖培養(yǎng)基誘導(dǎo)細(xì)胞損傷72 h作為細(xì)胞損傷模型。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，高糖環(huán)境對(duì)HUVECs細(xì)胞增殖能力明顯減弱，細(xì)胞相對(duì)存活率降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型對(duì)照組比較，隨著藥物濃度的增加，0.1，1 mmol·L-1復(fù)方硝酸甘油凝膠劑對(duì)HUVECs細(xì)胞增殖能力明顯增加，細(xì)胞相對(duì)存活率提高，呈現(xiàn)濃度依賴性(均P<0.01)，說明復(fù)方硝酸甘油凝膠劑能在一定程度上提高高糖誘導(dǎo)的HUVECs細(xì)胞損傷模型的細(xì)胞活力，對(duì)高糖誘導(dǎo)的HUVECs細(xì)胞損傷模型具有保護(hù)作用。見圖1。

A.正常對(duì)照組；B.模型對(duì)照組；C.小劑量組；D.中劑量組；E.大劑量組。①與正常對(duì)照組比較，t=15.699，P<0.01；②與模型對(duì)照組比較，t=6.343，11.255，P<0.01。圖1 高糖誘導(dǎo)HUVECs細(xì)胞損傷模型細(xì)胞活力 A.normal control group；B.model control group；C.low dose group；D.middle dose group；E.high dose group.①Compared with normal control group，t=15.699， P<0.01；② Compared with model control group，t=6.343，11.255， P<0.01.Fig.1 Effect of compound nitroglycerin gels on cell viability of high glucose-induced HUVECs injury model

2.2對(duì)高糖誘導(dǎo)HUVECs細(xì)胞損傷模型Transwell遷移能力的影響 正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、小劑量組、中劑量組、大劑量組每視野穿過Transwell小室的細(xì)胞數(shù)分別為132.80±5.22，40.20±5.93，49.60±5.03，69.40±5.41，102.00±5.70。與正常對(duì)照組相比，模型對(duì)照組遷移細(xì)胞數(shù)明顯減少(P<0.05)；與模型對(duì)照組相比，復(fù)方硝酸甘油凝膠劑處理后各組均能夠增加高糖誘導(dǎo)的HUVECs細(xì)胞損傷模型向Transwell下室遷移的能力，其中0.01，0.1，1 mmol·L-1復(fù)方硝酸甘油凝膠劑遷移數(shù)目明顯增加，呈現(xiàn)濃度依賴性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。見圖2。

A.正常對(duì)照組；B. 模型對(duì)照組；C.小劑量組；D.中劑量組；E.大劑量組。①與正常對(duì)照組比較，t=28.714，P<0.01；②與模型對(duì)照組比較，t=2.960，P<0.05；③與模型對(duì)照組比較，t=8.906，18.398，P<0.01。圖2 高糖誘導(dǎo)HUVECs細(xì)胞損傷模型Transwell遷移能力(×100) A.normal control group；B.model control group；C.low dose group；D.middle dose group；E.high dose group.①Compared with normal control group，t=28.714，P<0.01；②Compared with model control group，t=2.960，P<0.05；③Compared with model control group，t=8.906，18.398， P<0.01.Fig.2 Effect of Compound nitroglycerin gels on migration of glucose-induced HUVECs injury model(×100)

2.3對(duì)高糖誘導(dǎo)HUVECs細(xì)胞損傷模型劃痕實(shí)驗(yàn)的影響 正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、小劑量組、中劑量組、大劑量組24 h劃痕愈合比分別為(75.91±0.89)%，(20.23±2.60)%，(25.86±2.53)%，(45.83±1.62)%，(58.33±1.44)%。與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組細(xì)胞遷移能力明顯減弱，劃痕愈合百分比明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型對(duì)照組相比，復(fù)方硝酸甘油凝膠劑處理后各組無細(xì)胞寬度明顯縮小，其中0.01，0.1，1 mmol·L-1復(fù)方硝酸甘油凝膠劑能明顯促進(jìn)劃痕愈合，呈現(xiàn)濃度依賴性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示復(fù)方硝酸甘油凝膠劑能夠促進(jìn)高糖誘導(dǎo)的HUVECs細(xì)胞損傷模型的劃痕愈合。見圖3。

A.正常對(duì)照組；B.模型對(duì)照組；C.小劑量組；D.中劑量組；E.大劑量組。①與正常對(duì)照組比較，t= 49.630，P<0.01；②與模型對(duì)照組比較，t=3.801，20.470，31.400，P<0.01。圖3 高糖誘導(dǎo)HUVECs細(xì)胞損傷模型劃痕愈合能力(×40) A.normal control group；B.model control group；C.low dose group；D.middle dose group；E.high dose group.①Compared with normal control group，t=49.630，P<0.01；②Compared with model control group，t=3.801，20.470，31.400，P<0.01.Fig.3 Effect of Compound nitroglycerin gels on the ability of scratch wound-healing(×40)

2.4對(duì)激素誘導(dǎo)的慢性難愈性創(chuàng)面修復(fù)作用實(shí)驗(yàn)研究 與模型對(duì)照組比較，給藥后第14天復(fù)方硝酸甘油凝膠劑組膠原蛋白含量比明顯增加，IL-1、IL-6含量降低(P<0.05)。與京萬紅組比較，復(fù)方硝酸甘油凝膠劑組膠原蛋白含量比有增加趨勢(shì)，IL-1、IL-6含量有降低趨勢(shì)(P>0.05)，見表1。本研究中采用Masson染色觀察創(chuàng)面愈合早期膠原沉積，染色后膠原纖維呈藍(lán)色。模型對(duì)照組膠原纖維束稀疏，排列紊亂；京萬紅組膠原纖維較粗，排列較規(guī)則；復(fù)方硝酸甘油凝膠劑組成纖維排列較整齊致密，較粗大，排列有序。見圖4。

表1 復(fù)方硝酸甘油凝膠劑對(duì)膠原蛋白含量比的影響 Tab.1 Effects of compound nitroglycerin gels on the content of collagen in skin ulcer rats

A.模型對(duì)照組；B.京萬紅組；C.復(fù)方硝酸甘油凝膠劑組。圖4 復(fù)方硝酸甘油凝膠劑對(duì)創(chuàng)面膠原纖維生成的影響(Masson，×40) A.model control group；B.Jinwanhong group；C.Compound nitroglycerin gels group.Fig.4 Effect of compound nitroglycerin gels on the formation of collagen fiber in the wound(Masson，×40)

3 討論

血管新生受損、局部供血不足是導(dǎo)致慢性難愈性創(chuàng)面的主要原因之一[3]。新生血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移是促進(jìn)創(chuàng)面愈合的關(guān)鍵步驟。創(chuàng)面早期成纖維細(xì)胞可直接與炎癥細(xì)胞相互作用，參與控制創(chuàng)面炎癥反應(yīng)[7]。早期病原體入侵促使吞噬細(xì)胞與自然殺傷細(xì)胞活化，產(chǎn)生細(xì)胞因子，使更多的抗體、補(bǔ)體和免疫細(xì)胞集中于炎癥部位，誘導(dǎo)獲得性免疫，是機(jī)體抵御外來感染和創(chuàng)傷等的保護(hù)反應(yīng)[8]。其中IL-1、IL-6與創(chuàng)面的急性炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，對(duì)機(jī)體組織的影響更為重要[9]。炎癥期，創(chuàng)面組織中的巨噬細(xì)胞促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖和分化，成纖維細(xì)胞能夠分泌多種生長(zhǎng)因子，如一氧化氮(NO)，增強(qiáng)膠原合成并促進(jìn)愈合[10]。

硝酸甘油屬于硝酸酯類藥物，臨床上主要用于心絞痛、急性心肌梗死、充血性心力衰竭等。硝酸甘油進(jìn)入機(jī)體后轉(zhuǎn)化為NO發(fā)揮作用。SCHAFFER等[11]發(fā)現(xiàn)NO能促進(jìn)創(chuàng)面血管生成及內(nèi)皮細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞等遷移和增殖，參與創(chuàng)面愈合的過程。高糖環(huán)境所致的慢性難愈性創(chuàng)面的不斷增多，本研究探討復(fù)方硝酸甘油凝膠劑對(duì)慢性難愈性創(chuàng)面的作用。細(xì)胞活力結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，高糖環(huán)境能明顯抑制HUVECs細(xì)胞增殖，使細(xì)胞相對(duì)存活率降低，說明高糖誘導(dǎo)HUVECs細(xì)胞損傷。復(fù)方硝酸甘油凝膠劑能促進(jìn)高糖環(huán)境下HUVECs細(xì)胞的增殖，提高細(xì)胞活力，對(duì)高糖誘導(dǎo)的HUVECs細(xì)胞損傷模型具有保護(hù)作用；遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，高糖環(huán)境下HUVECs細(xì)胞向Transwell下室遷移細(xì)胞數(shù)明顯減少，遷移能力明顯減弱，劃痕愈合百分比明顯減少，但經(jīng)復(fù)方硝酸甘油凝膠劑干預(yù)后HUVECs細(xì)胞向Transwell下室遷移數(shù)增加，劃痕愈合百分比明顯增加，且隨著濃度的增加，其促遷移能力、愈合能力也增加，從而有利于血管新生，促進(jìn)創(chuàng)面愈合。本研究中體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示復(fù)方硝酸甘油凝膠劑能明顯降低激素誘導(dǎo)的慢性難愈性大鼠14天后創(chuàng)面IL-1、IL-6的含量，降低創(chuàng)面早期的炎癥反應(yīng)，本研究與劉麗平等[12]研究相互印證，這可能與硝酸甘油在體內(nèi)轉(zhuǎn)化成NO使血管平滑肌松弛，減少白細(xì)胞和血小板黏附，減輕組織水腫，改善微循環(huán)，從而減少炎癥因子釋放有關(guān)。復(fù)方硝酸甘油凝膠劑能增加給藥14天后膠原蛋白含量比，促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖和膠原纖維沉積，增加肉芽組織形成，促進(jìn)潰瘍創(chuàng)面的愈合。

綜上所述，在以高糖誘導(dǎo)的HUVEs細(xì)胞損傷模型及激素誘導(dǎo)的慢性難愈性創(chuàng)面大鼠模型為載體基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)復(fù)方硝酸甘油凝膠劑作為NO供體的硝酸甘油在一定范圍內(nèi)增加內(nèi)皮細(xì)胞增殖的作用，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移，具有較好的促血管生成和促創(chuàng)面愈合活性；調(diào)控創(chuàng)面的炎癥細(xì)胞和成纖維細(xì)胞相互作用，降低創(chuàng)面的炎癥反應(yīng)，炎癥細(xì)胞能夠促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖和分化，促進(jìn)膠原蛋白的合成，進(jìn)而促進(jìn)創(chuàng)面愈合。