呂嘉誠，林淵源，李愛軍，趙 崢

（1.昆明學院，昆明市河湖健康評估與修復院士工作站，云南省高校河湖健康評估與修復重點實驗室，云南 昆明 650214；2.云南省生態(tài)環(huán)境監(jiān)測中心，云南 昆明 650034）

0 引言

浮游藻類是水生態(tài)系統(tǒng)關鍵類群之一[1]。浮游藻類多樣性可反映水生態(tài)系統(tǒng)健康狀況，對指導受損水生態(tài)系統(tǒng)的修復有重要作用，廣泛應用于河湖生態(tài)健康評估和修復[2]。近年來滇池浮游藻類群落結(jié)構引起人們的廣泛關注，學者們探尋其群落結(jié)構的變化特征[3]，研究影響群落結(jié)構的環(huán)境因子[4]，為滇池的治理和修復提供了諸多基礎信息。柴河是滇池的主要入湖河流，由于河流周邊持續(xù)的農(nóng)業(yè)活動，成為滇池流域典型的農(nóng)業(yè)面源污染河道[4]。研究發(fā)現(xiàn)柴河從上游到下游浮游藻類檢出率、藻密度與河流位置無關，與采樣點具體環(huán)境有關，石門坎水庫未能檢出浮游藻類，且在甸頭人民壩發(fā)生柵藻（Scenedesmus）水華現(xiàn)象[5]。

環(huán)境DNA宏條形碼技術的應用，為分析浮游藻類多樣性提供了新途徑[6]。許多研究已經(jīng)證明了環(huán)境DNA宏條形碼技術在監(jiān)測浮游藻類方面的出色效果[7]。有研究表明環(huán)境DNA宏條形碼技術與傳統(tǒng)方法相比在顯示浮游藻類豐度方面有顯著提升，同時能監(jiān)測到更為豐富的浮游藻類多樣性[8]。在評估水生生物多樣性方面結(jié)果可靠，并在描述水生生態(tài)景觀差異時展現(xiàn)出很大潛力[9]。已有研究人員使用環(huán)境DNA高通量測序方法對太湖等典型湖泊藻類進行了監(jiān)測，證明環(huán)境DNA高通量測序是一種潛在代替?zhèn)鹘y(tǒng)監(jiān)測方法的優(yōu)秀工具[10-13]。

基于傳統(tǒng)形態(tài)學鑒定的浮游藻類研究，對專業(yè)要求較高且費時費力。為了高效快速地監(jiān)測柴河浮游藻類狀況，本研究于2021年7月，在柴河水庫及水庫上下游的三個采樣點，通過環(huán)境DNA宏條形碼技術及顯微鑒定計數(shù)法調(diào)查柴河浮游藻類的群落組成和分布，旨在探討環(huán)境DNA宏條形碼對柴河浮游藻類研究的適用性，并科學評價其水質(zhì)，為柴河水資源保護提供基礎資料。

1 實驗方法

1.1 采樣點布設和環(huán)境樣品采集

柴河位于昆明市晉寧區(qū)。作為滇池南岸主要入湖河流，柴河承擔著防洪、灌溉等任務。柴河流域以第一產(chǎn)業(yè)為主，農(nóng)藥化肥使用量較大，流域內(nèi)農(nóng)田污染物隨降雨進入河道，是滇池湖泊富營養(yǎng)化的驅(qū)動力之一[14]。在雨季（2021年7月）對柴河水進行環(huán)境DNA測序及顯微鏡鑒定計數(shù)進行浮游藻類多樣性分析。研究中，在柴河選擇了柴河水庫及其上下游三個采樣點位（24°31′～24°37′N，102°40′～102°41′E），點位海拔（1955～1916 m），這些地點包括了位于六街鎮(zhèn)的柴河源頭和承擔生活用水的柴河水庫以及段七村旁的柴河主河道（圖1）。

圖1 柴河采樣點位

eDNA方法和顯微鑒定計數(shù)法在相同點位采樣，兩種方法在水體表層分別采集水樣2 L。采樣時對現(xiàn)場進行觀察并做好采樣記錄。樣品采集好后帶回實驗室，放置在4℃冰箱中保存至過濾前。過濾前將水樣混勻，然后使用真空過濾泵經(jīng)0.45 mm濾膜得到三組重復樣品，三個重復的樣本來自同一采樣點。在每個采樣點使用過濾相同體積去離子水的方法，建立空白對照，過濾后濾膜儲存在-80℃冰箱內(nèi)至分子生物學實驗前。

1.2 浮游藻類多樣性分析的傳統(tǒng)方法

研究中鑒定浮游藻類使用的傳統(tǒng)方法是顯微鑒定計數(shù)法，每個采樣點用采水器采集2 L水樣，水樣放入棕色瓶并加入30 mL魯哥氏液固定，使用當天采集的水樣獲取采樣點浮游藻類數(shù)據(jù)。這種方法確保了兩種方法之間確定的浮游藻類數(shù)據(jù)差異不是由外在水質(zhì)變化等因素造成的。在采樣點采集樣品時，將同一點位采集的樣本混勻，最大限度提高了檢測浮游植物的準確性和概率。采樣后將采樣瓶放入冷凍保溫箱保存，并及時運回實驗室，具體操作根據(jù)《SC/T 9402-2010 淡水浮游生物調(diào)查技術規(guī)范》進行[15]，浮游藻類形態(tài)學鑒定由云南省生態(tài)環(huán)境監(jiān)測中心專家進行鑒定。

1.3 DNA宏條形碼技術監(jiān)測分析方法

1.3.1 DNA提取與PCR擴增

水環(huán)境DNA提取實驗在“昆明市河湖健康評估與修復院士工作站” “云南省高校河湖健康評估與修復重點實驗室”進行，實驗室具備完成本項目研究的儀器設備和工作條件。按照提取試劑盒的操作步驟，使用PowerWater水樣DNA提取試劑盒提取DNA，但根據(jù)實際情況需稍加修改使用。每個采樣點水樣搖勻后取500 mL經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，將濾膜放入到研磨管中，在SP buffer和Lysis S Buffer作用下，通過劇烈震蕩，基因組DNA被釋放出來。通過離心，去除大部分雜質(zhì)。加入沉淀腐殖酸、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)的DA buffer，然后加入有適當鹽分及pH值的Bingding Buffer，DNA被特異性吸附在Biospin離心柱膜上。通過洗滌，將金屬離子等殘留的雜質(zhì)去除。最后使用Elution Buffer將DNA從濾膜上洗脫下來，獲得基因組DNA。過濾的空白對照和陰性對照與樣品一起提取，并與樣品采用相同的方案。經(jīng)提取的環(huán)境DNA使用超微量紫外分光光度計測定DNA濃度，并同時在1%瓊脂糖凝膠中檢測。使用超微量紫外分光光度計測定過濾空白和陰性對照的環(huán)境DNA濃度，空白和陰性對照結(jié)果應顯示為空白及陰性。

使用引物序列為“TCCCTGCCHTTTGTACAC AC”的正向引物，序列為“CCTTCYGCAGGTTC ACCTAC”的反向引物擴增真核浮游藻類的18S rRNA的V9區(qū)。采用序列為“ACCTACGGGRSGC WGCAG”的正向引物，序列為 “TTACCGCGGC KGCTGG”的反向引物擴增原核浮游藻類的基因，以識別原核浮游藻類種類，該引物針對核糖體小亞基16S rRNA的V3區(qū)[16-17]。DNA擴增再在Applied Biosystems VeritiPro PCR平臺進行，對每個樣本做三次PCR重復。PCR反應體系為 30 μL，包括15 μL 2×Rapid Taq Master Mix， 12 μL ddH2O，1.5 μL正向引物，1.5 μL反向引物以及1 μL的DNA模板（環(huán)境樣品、過濾空白和陰性對照）。對于所有樣本反應程序如下：95℃預變性3 min，然后對反應進行33個循環(huán)（95℃保持 15 s，58℃保持15 s，72℃保持3 s）最后72℃保持5 min以達到徹底延伸。PCR擴增后，在2%的瓊脂糖凝膠中檢測PCR產(chǎn)物，并保證過濾空白和陰性對照都沒有擴增跡象。

1.3.2 文庫構建及高通量測序

使用膠回收試劑盒切膠回收PCR產(chǎn)物，并用TE緩沖液洗脫回收目標DNA片段。使用IIIumina公司TruSeq DNA PCR-Free Sample Prep Kit（FC-121-30001/3003）。

測序采用PE300測序方式，測序試劑盒使用IIIumina公司MiSeq Reagent Kit v3（600 Cycle）。

1.3.3 生物信息學分析

使用QIIME25軟件完成生物信息操作。為了獲得高質(zhì)量數(shù)據(jù)，對測序得到的原始數(shù)據(jù)進行序列拼接，并根據(jù)Barcode區(qū)分樣品，初步篩選過濾，消除低質(zhì)量數(shù)據(jù)，使用基于OTU的方法構建特征表，并去除低頻率OTU以降低假陽性結(jié)果[18]。將OTU序列通過國家生物技術信息中心（NCBI）GenBank數(shù)據(jù)庫下載的數(shù)據(jù)庫進行比對，如果序列存在，則認為屬于一個物種。

1.3.4 統(tǒng)計分析

計算eDNA的生物多樣性指數(shù)時，使用R語言的R studio操作界面加載vegan包后進行計算[19]。測序數(shù)據(jù)與顯微鏡直接計數(shù)的數(shù)據(jù)一起輸入EXCEL軟件。將物種序列數(shù)豐富度數(shù)據(jù)與顯微鏡直接計數(shù)法數(shù)據(jù)分別計算，后將數(shù)據(jù)進行比較，物種的相對豐度根據(jù)OTU豐度表和物種計數(shù)表計算。使用SPSS19軟件計算以確定樣本組之間存在的差異[20]。平行間交叉情況計算公式為[7]：

1.3.5 基于浮游植物多樣性指數(shù)的水質(zhì)生物學評估

Shannon-Wiener多樣性指數(shù)H'在0～1代表重污染，H'在1～2代表中污染，H'在2～3代表輕污染，H'＞3代表清潔。[21]

Pielou均勻度指數(shù)J在0～0.3代表重污染，J在0.3～0.5代表中污染，J＞0.5代表輕污染或無污染[21]。

2 結(jié)果分析

2.1 柴河浮游藻類多樣性監(jiān)測

2.1.1 柴河浮游藻類門水平群落組成

用顯微鑒定計數(shù)法對3個點位采集的水樣進行藻類鑒定分析，鑒定了6門16目18科24屬的浮游藻類（表1）。在顯微鑒定計數(shù)法觀察到的浮游植物中，以細胞數(shù)區(qū)分優(yōu)勢門類，優(yōu)勢門中，藍藻門（Cyanophyta）占95.35%、硅藻門（Bacillariophyta）占1.4%、隱藻門（Cryptophyta）占1.13%、綠藻門（Chlorophyta）占1.06%（圖2a）。在顯微鑒定計數(shù)法發(fā)現(xiàn)的24屬浮游藻類中，藍藻門假魚腥藻屬（Pseudanabaena）占76.84%、藍纖藻屬（Dactylococcopsis）占9.36%、尖頭藻屬（Raphidiopsis）占4.06%。

通過eDNA宏條形碼技術在3個點位鑒定出了來自9門25目33科43屬的浮游藻類（表1）。在eDNA高通量測序得到的有關浮游藻類的124個OTU中，最具代表性的門類，藍藻門（Cyanophyta）占31.39%、綠藻門（Chlorophyta）占23.81%、黃藻門（Xanthophyta）占21.06%、硅藻門（Bacillariophyta）占8.69%（圖2b）。環(huán)境DNA高通量測序平均每個點位發(fā)現(xiàn)浮游藻類32屬，監(jiān)測到豐度最高的藻類同樣是藍藻門假魚腥藻屬。從發(fā)生頻率來看，前三位中，藍藻門假魚腥藻屬（Pseudanabaena）占22.68%、黃藻門周泡藻屬（Vacuolaria）占21.06%、綠藻門腎形藻屬（Nephroselmis）占20.05%。

表1 eDNA宏條形碼技術和顯微鑒定計數(shù)法在柴河檢測到的浮游藻類類群數(shù)量

結(jié)合顯微鑒定計數(shù)法和eDNA高通量測序數(shù)據(jù)顯示優(yōu)勢門為：藍藻門（Cyanophyta）占63.37%、綠藻門（Chlorophyta）占12.44%、黃藻門（Xanthophyta）占10.53%、硅藻門（Bacillariophyta）占5.03%。通過這兩種方法共同發(fā)現(xiàn)了藍藻門（Cyanophyta）、綠藻門（Chlorophyta）、硅藻門（Bacillariophyta）、甲藻門（Dinophyta）、隱藻門（Cryptophyta）、裸藻門（Euglenophyta）（圖2a、2b、2c）。

圖2 兩種方法監(jiān)測到的柴河浮游植物門類組成

2.1.2 柴河浮游藻類屬水平分布

通過eDNA宏條形碼技術監(jiān)測結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，實驗選取的3個采樣點水平浮游藻類相對豐度差異很大。點位一位于人類活動相對較少的六街鎮(zhèn)楊樹種植區(qū)，樣品中衣藻屬（Chlamydomonas）相對豐度最高，其次是隱藻屬（Cryptomonas）、菱形藻屬（Nitzschia）、鐘罩藻屬（Dinobryon）。點位二地處柴河水庫，樣品中假魚腥藻屬相對豐度最高，其次是周泡藻屬（Vacuolaria）、微囊藻屬（Microcystis）。點位三位于段七村，樣品中菱形藻屬（Nitzschia）、剛毛藻屬、假魚腥藻屬是優(yōu)勢藻屬（圖4）。

圖4 eDNA宏條形碼各位點相對豐度

顯微鏡直接計數(shù)法監(jiān)測到點位一水樣中隱藻屬、小環(huán)藻藻屬（Cyclotella）、柵藻屬（Scenedesmus）為優(yōu)勢藻屬。點位二中假魚腥藻屬、尖頭藻屬（Raphidiopsis）是優(yōu)勢藻屬。點位三優(yōu)勢藻門為硅藻門，但相應藻屬未辨別出名稱（圖3）。

圖3 顯微鑒定計數(shù)法各位點相對豐度

2.2 環(huán)境DNA宏條形碼監(jiān)測的精準性

2.2.1 平行樣本間監(jiān)測情況

eDNA高通量測序從9個送檢樣本中共檢出真核浮游藻類13051條18srDNA序列，原核浮游藻類7689條16srDNA序列。最終有124個OUT被注釋到43屬浮游藻類上，涵蓋了藍藻門、綠藻門、硅藻門、甲藻門、隱藻門、裸藻門、金藻門、紅藻門、黃藻門等主要浮游藻類類群。在準確性方面，檢測到目標類群的平行樣本中，3個平行樣品的交叉率達到34.96%，至少出現(xiàn)在兩個平行樣品的屬所占比例為55.01%（表2）。

表2 eDNA宏條形碼監(jiān)測數(shù)據(jù)的精確性評價結(jié)果 （%）

2.2.2 環(huán)境DNA宏條形碼技術與傳統(tǒng)方法的交叉情況

檢測出的浮游藻類中有9個屬是由eDNA和顯微鏡直接觀察法共同檢測出來的，有34屬和15屬分別由eDNA和顯微鏡直接觀察法單獨檢測出。通過兩種方法共同檢測到的科有色球藻科（Chroococcaceae）、念珠藻科（Nostocaceae）、假魚腥藻科（Pseudanabaenaceae）、柵藻科（Sc-enedesmaceae）、水網(wǎng)藻科（Hydrodictyaceae）、小球藻科（Chlorellaceae）、雙星藻科（Zygnemataceae）、圓篩藻科（Cosscinodiscaceae）、舟形藻科（Naviculaceae）、異極藻科（Gomphonemaceae）、多甲藻科（Peridiniaceae）、隱鞭藻科（Cryptomonadaceae）、裸藻科，占顯微鑒定計數(shù)法的72.2%（圖5a）。共同檢測到的屬有假魚腥藻屬、微囊藻屬、席藻屬、柵藻屬，小環(huán)藻屬、異極藻屬、多甲藻屬、隱藻屬、裸藻屬，占顯微鑒定計數(shù)法的37.5%（圖5b）。

圖5 通過顯微鑒定計數(shù)法與eDNA宏條形碼技術監(jiān)測的浮游藻類科（a）、屬（b）交叉情況

2.3 柴河各位點浮游藻類多樣性分析

α多樣性指數(shù)（Alpha Diversity）常用于衡量樣品內(nèi)的生物群落多樣性。其中Pielou均勻度指數(shù)與物種累積數(shù)越大，表明樣本的生物種類越多，豐富度越高；Shannon指數(shù)綜合考慮物種數(shù)及物種頻度分布的均勻性，其值越高，說明群落多樣性越高，物種分布越均勻?；?8S V9及16S V3引物的宏條形碼測序數(shù)據(jù)所注釋的OTUs及其序列數(shù)，分析使用R語言的R studio操作界面加載vegan包后進行計算，得到各樣品中的生物群落多樣性指數(shù)見表2。C3點位樣品的Shannon指數(shù)、Pielou均勻度指數(shù)都顯著高于C1和C2點位樣品，C3點位生物多樣性顯著高于C1和C2。C2點位樣品物種累計數(shù)更高，說明點位三群落均勻度更高，物種相較于一、二點位更豐富（表3）。生物多樣性指數(shù)結(jié)果與起初設想的景觀差異有些許出入，但與采樣時所觀察的水質(zhì)理化因素密切相關。

表3 Alpha多樣性指數(shù)統(tǒng)計

2.4 基于浮游植物多樣性指數(shù)的水質(zhì)生物學評價

通過常用的浮游藻類評價水體水質(zhì)的方法[21]，根據(jù)分子生物學方法得到的浮游植物多樣性指數(shù)，柴河Shannon-Wiener多樣性指數(shù)（H'）對源頭評價為中污染，柴河水庫為中污染，柴河主河道為輕污染，Pielou均勻度指數(shù)（J）對源頭評價為中污染，柴河水庫為中污染，柴河主河道為輕污染（表4）。

表4 柴河水質(zhì)生物學評價結(jié)果

3 討論

3.1 環(huán)境DNA宏條形碼技術表征柴河浮游藻類多樣性

基于環(huán)境DNA宏條形碼技術在柴河共鑒定出9門25目33科43屬浮游藻類單元。水庫上游優(yōu)勢藻屬為衣藻屬，水庫段為假魚腥藻屬，水庫下游為菱形藻屬。這一監(jiān)測結(jié)果與顯微鑒定計數(shù)法接近，eDNA宏條形碼技術在科、屬水平鑒定的浮游植物種類分別占顯微鑒定計數(shù)法的72.2%，37.5%。資料顯示柴河歷史共出現(xiàn)67屬浮游藻類[22]，eDNA宏條形碼監(jiān)測技術方法與歷史記錄的浮游植物重合度高，極大程度地貼合了柴河浮游藻類的狀態(tài)。對水生生物群落結(jié)構沿城市化發(fā)展進程的響應做了傳統(tǒng)方法以及eDNA方法監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)eDNA方法比傳統(tǒng)方法更加準確，且eDNA方法與水質(zhì)關系更緊密[23]。運用分子生物學方法可以得到描述群落多樣性的物種豐富度和均勻度指數(shù)，并將其運用于水質(zhì)生物學評估[24]。

3.2 柴河不同點位浮游藻類生物多樣性差異

水庫上游浮游藻類Shannon-Wiener指數(shù)為1.426，Pielou均勻度指數(shù)為0.406，生物學水質(zhì)評價結(jié)果為中污染。結(jié)合現(xiàn)場采樣時對取樣點周邊環(huán)境記錄觀察發(fā)現(xiàn)，該采樣點為天然河段，采樣點周邊沒有明顯污染源，河水渾濁，水體流速快，河道中幾乎沒有沉水植物，對水質(zhì)凈化能力差。柴河水庫浮游藻類Shannon-Wiener指數(shù)為1.564，Pielou均勻度指數(shù)為0.452，水庫內(nèi)假魚腥藻屬占絕對優(yōu)勢，生物學水質(zhì)評價結(jié)果為中污染。水庫下游位于段七村旁主河道，浮游藻類Shannon-Wiener指數(shù)為2.358，Pielou均勻度指數(shù)為0.692，水質(zhì)生物學評價結(jié)果為輕污染。采樣時水庫分水閘沒有放水，水庫水對點位三水樣影響不大，且河道內(nèi)有大量沉水植物，起到了凈化水質(zhì)的作用，是水庫下游浮游藻類生物多樣性優(yōu)于前兩個點位的原因。

4 結(jié)論與展望

環(huán)境DNA宏條形碼技術在柴河浮游藻類監(jiān)測物種識別方面與顯微鑒定計數(shù)法具有一致性。兩種方法識別出的優(yōu)勢藻屬相同?；诃h(huán)境DNA宏條形碼技術的浮游藻類監(jiān)測可反映不同河段水質(zhì)差異。作為一種新方法，eDNA宏條形碼技術可監(jiān)測評估柴河浮游藻類多樣性，為柴河水生態(tài)健康評估和保護提供依據(jù)。

未來，還要進一步完善統(tǒng)一環(huán)境DNA的操作流程，并完善本土物種DNA條形碼數(shù)據(jù)庫，使測序數(shù)據(jù)的可重復性、準確性提升。環(huán)境DNA宏條形碼技術在監(jiān)測浮游藻類多樣性及其相關工作具有較高可靠性，有望提升流域內(nèi)水生藻類監(jiān)測工作的水平。