孟獻(xiàn)影 綜述；蔣敬庭 審閱（揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院 江蘇省腫瘤免疫治療工程技術(shù)研究中心，江蘇 常州 213003）

肺癌是世界上發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一[1]。非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）占所有肺癌的85%，其中包括肺腺癌、肺鱗癌和大細(xì)胞肺癌[2]。針對NSCLC的治療，根據(jù)病理類型、分期不同，常采取不同的治療方案，如手術(shù)切除、化學(xué)治療或放射治療。然而，肺癌患者的5 年生存（OS）率仍然不高。目前，以鉑類藥物為基礎(chǔ)的化學(xué)治療仍然是NSCLC 的一線治療方案，其中位OS 約為9～12 個月[3]。隨著靶向治療藥物的出現(xiàn)，如表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）酪氨酸激酶抑制劑和間變性淋巴瘤激酶抑制劑的引入，NSCLC患者的治療效果得到了顯著改善[4]，但是患者耐藥性的產(chǎn)生限制了靶向治療的療效[5-6]。近年來，嵌合抗原受體T（chimeric antigen receptor T，CAR-T）細(xì)胞在治療血液系統(tǒng)腫瘤方面取得了良好的療效。鑒于CAR-T 細(xì)胞治療血液系統(tǒng)腫瘤的優(yōu)勢，眾多研究者在CAR-T 細(xì)胞治療NSCLC 方面進(jìn)行了深入探索，并在基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和臨床前研究中取得了可喜的初步成果。若要充分利用這些新療法的效果，需要確定哪些患者將從這種治療中受益，必須深入了解CAR-T細(xì)胞治療NSCLC的靶標(biāo)及聯(lián)合放射治療、化學(xué)治療的機(jī)制和新進(jìn)展。

1 CAR-T細(xì)胞結(jié)構(gòu)的優(yōu)化設(shè)計

CAR是人工構(gòu)建的融合基因編碼的穿膜分子，由胞外區(qū)、胞內(nèi)區(qū)和穿膜區(qū)構(gòu)成。胞外區(qū)負(fù)責(zé)抗原的識別，胞內(nèi)區(qū)負(fù)責(zé)信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)，穿膜區(qū)連接胞外區(qū)和胞內(nèi)區(qū)[7]。第一代CAR-T細(xì)胞是由胞外抗體分子ScFv和胞內(nèi)含有免疫受體酪氨酸活化基序（immunoreceptor tyrosine-based activatiaon motif，ITAM）的CD3直接連接而成的。由于第一代CAR-T細(xì)胞增殖能力和細(xì)胞因子分泌水平低下，無法提供持續(xù)的體內(nèi)抗腫瘤效應(yīng)而逐漸被淘汰[8]。第二和第三代CAR-T細(xì)胞以ScFv-CMITAM為基礎(chǔ)，增加了一些刺激因子，使CAR-T細(xì)胞具有更強(qiáng)的活性、擴(kuò)增和抗腫瘤能力，以及促進(jìn)轉(zhuǎn)基因的表達(dá)[9]。第四代CAR-T細(xì)胞是用一種針對腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)的腫瘤相關(guān)抗原的特異性CAR和一種編碼轉(zhuǎn)基因IL-12的NFAT轉(zhuǎn)錄因子來設(shè)計的。第四代CAR-T細(xì)胞在CAR介入時被激活，裂解已識別的腫瘤細(xì)胞并釋放IL-12[10]。新開發(fā)的第五代CAR-T細(xì)胞中，IL-2Rβ鏈片段插入TR信號域（CD247）和共刺激域（CD28）之間，用于誘導(dǎo)細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)該區(qū)域刺激細(xì)胞增殖，阻止終末分化，并表現(xiàn)出更好的持久性[11]。為了更好地控制CAR-T細(xì)胞的毒性，可通過基因工程使用小分子（如ASN蛋白酶抑制劑）開關(guān)調(diào)節(jié)CAR-T細(xì)胞表面抗原，使其穩(wěn)定表達(dá)[12]。

2 CAR-T細(xì)胞在NSCLC治療中的應(yīng)用

CAR-T細(xì)胞治療實(shí)體瘤成功的關(guān)鍵在于能否找到在NSCLC中表達(dá)的腫瘤相關(guān)抗原或者腫瘤特異性抗原。近年來，CAR-T細(xì)胞在治療NSCLC方面發(fā)現(xiàn)了越來越多的潛在靶標(biāo)，這些靶標(biāo)通過免疫檢查點(diǎn)、不同的信號通路對NSCLC細(xì)胞的增殖、遷移起促進(jìn)作用。

2.1 以免疫檢查點(diǎn)為靶標(biāo)的CAR-T細(xì)胞的應(yīng)用

程序性死亡受體-配體1（programmed death-ligand 1，PD-L1）在多種實(shí)體瘤中表達(dá)上調(diào)，與其受體PD-1結(jié)合后導(dǎo)致T細(xì)胞耗竭，影響腫瘤微環(huán)境。有實(shí)驗(yàn)[13]將包含CD28胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的PD-1 開關(guān)受體修飾傳統(tǒng)的CAR-T細(xì)胞，將PD-L1抑制信號轉(zhuǎn)化為CD28共刺激信號，從而保護(hù)CAR-T細(xì)胞免受PD-L1介導(dǎo)的抑制，更好地發(fā)揮CAR-T細(xì)胞的抗腫瘤作用。但是，在臨床試驗(yàn)中這種治療方法對患者具有一定的肺毒性，出現(xiàn)無誘因的發(fā)熱和呼吸困難，甚至惡化為呼吸衰竭[14]。所以靶向PD-L1的CAR-T細(xì)胞治療雖然是一種潛在的治療NSCLC的藥物，但是其安全性有待提高。

B7-H3 是一種免疫檢查點(diǎn)分子，在NSCLC 細(xì)胞中高表達(dá)，是CAR-T細(xì)胞治療NSCLC的一個潛在靶點(diǎn)[15]。研究結(jié)果[16]證明，B7-H3 CAR-T細(xì)胞在體內(nèi)外均能有效地抑制NSCLC 細(xì)胞增殖，并且B7-H3 能夠促進(jìn)高特異性T細(xì)胞浸潤腫瘤組織，促進(jìn)T細(xì)胞的歸巢。YANG等[17]的實(shí)驗(yàn)設(shè)計了一種CD70和B7-H3二價串聯(lián)CAR（TanCAR）-T 細(xì)胞，TanCAR-T 細(xì)胞在遇到表達(dá)兩種靶抗原的腫瘤細(xì)胞時，可增強(qiáng)特異性CAR-T 細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷能力。此外，低劑量的TanCAR-T 細(xì)胞也可以有效地抑制肺癌移植瘤的生長，并提高小鼠OS 率。因此，B7-H3 是CAR-T 細(xì)胞治療NSCLC的有效靶點(diǎn)，并且這種雙靶點(diǎn)的CAR-T細(xì)胞能夠有效地避免腫瘤免疫逃逸。

2.2 以MAPK 信號通路相關(guān)分子為靶標(biāo)的CAR-T細(xì)胞的應(yīng)用

MAPK 信號通路由Ras/Raf/MAPK(MEK)/ERK級聯(lián)組成，在腫瘤細(xì)胞的生存和進(jìn)展中起著至關(guān)重要的作用[18]。有研究[19]發(fā)現(xiàn)，MAPK抑制導(dǎo)致細(xì)胞表面TNF 受體1（TNFR1）表達(dá)增加，這會使NSCLC 細(xì)胞對細(xì)胞因子誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡敏感。間皮素（mesothelin，MSLN）是一種固定在細(xì)胞膜的糖蛋白，主要通過MAPK/ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲能力[20]。MSLN在正常組織中表達(dá)極低，但在實(shí)體瘤（包括間皮瘤、卵巢癌、胰腺癌和肺癌）中大量表達(dá)。有研究者[21]構(gòu)建了針對MSLN 的第二代CAR-T細(xì)胞，在體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，MSLN CAR-T細(xì)胞均能殺傷腫瘤細(xì)胞。但是MSLN CAR-T 細(xì)胞殺傷NSCLC 細(xì)胞的持久性差。QIN 等[13]的實(shí)驗(yàn)表明，PD-L1 CAR-T細(xì)胞與MSLN CAR-T細(xì)胞聯(lián)合應(yīng)用對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用更強(qiáng)。在MSLN CAR-T細(xì)胞的CD28 細(xì)胞質(zhì)域中加入DNAX 激活蛋白10（DAP10）的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域，生成M28z10 CAR-T細(xì)胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，M28z10 CAR-T 細(xì)胞對MSLN 陽性NSCLC 細(xì)胞的抗腫瘤作用顯著增強(qiáng)，并分泌高水平的細(xì)胞因子，包括IL-2、IFN-γ 和顆粒酶B 等[22]。WANG 等[23]研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤抗原MSLN 的特異性CAR 與細(xì)胞趨化因子受體CCR2b 或CCR4 共表達(dá)，于是構(gòu)建了MSLNCCR2b-CAR-T 和MSLN-CCR4-CAR-T 細(xì)胞，在動物實(shí)驗(yàn)中對NSCLC產(chǎn)生了抗腫瘤作用。

EGFR是一種受體酪氨酸蛋白激酶，為最常見的突變驅(qū)動基因之一，通過調(diào)節(jié)MAPK通路參與NSCLC的發(fā)展[24]。與正常肺組織相比，NSCLC組織中EGFR的表達(dá)增多，因此，EGFR可作為CAR-T細(xì)胞治療NSCLC的靶標(biāo)[25]。在臨床治療中，給難治、復(fù)發(fā)性NSCLC患者輸注大量的EGFR CAR-T細(xì)胞，患者并未出現(xiàn)毒性反應(yīng)，而且患者對EGFR CAR-T細(xì)胞治療耐受良好[25]。LI等[26]設(shè)計了一種EGFR CAR-T細(xì)胞來表達(dá)趨化因子CXCL13受體CXCR5，以促進(jìn)CAR-T細(xì)胞遷移到表達(dá)CXCL13的NSCLC組織中，并最大限度地減少EGFR CAR-T細(xì)胞的脫靶可能。EGFR變異Ⅲ（EGFRvⅢ）是EGFR最常見的突變之一，是一種腫瘤特異性突變，在NSCLC中檢測到EGFRvⅢ突變率為16%～39%[27]。研究結(jié)果[28]表明，EGFRvⅢCAR-T細(xì)胞對表達(dá)EGFRvⅢ的NSCLC細(xì)胞有殺傷作用，可顯著延長荷瘤小鼠的OS，且無毒副作用。因此，EGFR CAR-T細(xì)胞對于難治、復(fù)發(fā)性NSCLC的治療彌補(bǔ)了傳統(tǒng)治療療法的不足，具有一定優(yōu)勢。

2.3 以Wnt信號通路相關(guān)分子為靶標(biāo)的CAR-T細(xì)胞的應(yīng)用

Wnt/β-catenin信號通路是經(jīng)典的Wnt信號通路，這一信號軸參與了腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、遷移、侵襲和組織穩(wěn)態(tài)等多種生理過程。Wnt信號在腫瘤中的作用之一是抑制Ras-MAPK信號，從而阻止癌基因誘導(dǎo)的衰老，最大限度地促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖[29]。受體酪氨酸激酶樣孤兒受體1（receptor tyrosine kinase-like orphan receptor 1，ROR1）是一種穿膜受體酪氨酸激酶蛋白，屬于Ⅰ型受體酪氨酸激酶家族[30]。ROR1是Wnt通路的重要成員，它可以結(jié)合Wnt配體并激活下游的β-catenin獨(dú)立信號通路[31]。有研究結(jié)果[32]表明，ROR1在惡性轉(zhuǎn)化和致癌信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，支持將ROR1作為腫瘤免疫治療的靶點(diǎn)。ROR1在NSCLC細(xì)胞中高表達(dá)，在三維腫瘤模型中，ROR1 CAR-T細(xì)胞能夠有效地清除NSCLC細(xì)胞[33]。然而，ROR1 CAR-T細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞只表現(xiàn)出了短暫的抗腫瘤活性，可能是由于T細(xì)胞無法招募足夠的趨化因子將ROR1 CAR-T細(xì)胞運(yùn)送到NSCLC組織中[34]。

2.4 以AKT 信號通路相關(guān)分子為靶標(biāo)的CAR-T 細(xì)胞的應(yīng)用

PI3K-AKT-mTOR信號通路可以控制細(xì)胞的基本功能，其調(diào)控的改變可能導(dǎo)致多種人類腫瘤[35]。在NSCLC中，PI3K/AKT/mTOR信號通路的異常表達(dá)、激活與癌細(xì)胞增殖和存活增加有關(guān)[36-37]。前列腺干細(xì)胞抗原（prostate stem cell antigen，PSCA）是一種糖基磷酸肌醇錨定的細(xì)胞表面抗原，在NSCLC組織中高表達(dá)[38]。PSCA通過PI3K/AKT 信號通路增加c-Myc表達(dá)，促進(jìn)腫瘤生長[39]。黏蛋白1（MUC1）是一種穿膜糖蛋白，在NSCLC中表達(dá)異常上調(diào)。NSCLC細(xì)胞依賴于MUC1激活PI3K/AKT通路生存，且MUC1異常上調(diào)可導(dǎo)致NSCLC 中的腫瘤血管生成[40]。因此，MUC1 可能是NSCLC中潛在的抗血管生成的靶標(biāo)。WEI等[41]在人源腫瘤異種移植瘤小鼠模型中證明，PSCA CAR-T細(xì)胞與MUC1 CAR-T細(xì)胞聯(lián)合使用可以有效抑制NSCLC生長。所以，PSCA和MUC1都是CAR-T細(xì)胞治療NSCLC的潛在靶點(diǎn)。遺憾的是這些腫瘤相關(guān)性抗原，不是只在NSCLC組織中表達(dá)，還在其他正常組織中表達(dá)。肺特異性X（LUNX，也稱為BPIFA1、PLUNC和SPLUNCL）是腭、肺和鼻上皮克隆蛋白家族的成員，在NSCLC細(xì)胞中高表達(dá)，但在人正常肺組織中不表達(dá)，可作為NSCLC的特異性靶抗原。動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果[42]顯示，LUNX CAR-T細(xì)胞可使轉(zhuǎn)移性NSCLC異種移植瘤消退并延長OS。

3 CAR-T細(xì)胞聯(lián)合化療或放療治療NSCLC的臨床前動物實(shí)驗(yàn)

3.1 CAR-T細(xì)胞聯(lián)合化學(xué)治療

有研究結(jié)果[43]表明，阿霉素、米托蒽醌和環(huán)磷酰胺等化療藥物可以通過免疫原性細(xì)胞死亡途徑殺死腫瘤細(xì)胞，從而激活抗腫瘤免疫反應(yīng)。節(jié)律性化療通過抑制血管生成，從而抑制腫瘤的生長，且節(jié)律性化療比標(biāo)準(zhǔn)化療（即一次性給最大耐受量）控制腫瘤生長的作用更強(qiáng)[44-46]。在ROR1陽性NSCLC小鼠模型[34]中，奧沙利鉑/環(huán)磷酰胺（Ox/Cy）的預(yù)處理能夠誘導(dǎo)趨化因子在腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞中的表達(dá)，從而促進(jìn)CAR-T細(xì)胞在腫瘤組織中的浸潤。在CAR-T細(xì)胞治療、Ox/Cy處理后，腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞表面PD-L1顯著增加。Ox/Cy化療預(yù)處理可以改善CAR-T細(xì)胞向腫瘤組織遷移，并且當(dāng)聯(lián)合抗PD-L1 檢查點(diǎn)阻斷時，該方案可以提高OS率。然而，只抑制靶向PD-1/PD-L1 通路不足以實(shí)現(xiàn)持久的腫瘤消退。

3.2 CAR-T細(xì)胞聯(lián)合放射治療

放射治療不僅可以直接殺死局部腫瘤細(xì)胞，還可以引起系統(tǒng)免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)[47]。放射治療有可能增加細(xì)胞表面受體和腫瘤相關(guān)抗原的表達(dá)，如放射治療結(jié)束后數(shù)天內(nèi)腫瘤細(xì)胞表面MHC-I分子表達(dá)增加[48]。在關(guān)于NSCLC的實(shí)驗(yàn)中，表達(dá)MSLN的裸鼠移植瘤經(jīng)5 Gy或15 Gy放射治療后，發(fā)現(xiàn)治療組細(xì)胞中MSLN表達(dá)顯著高于對照組[49]。與血液系統(tǒng)惡性腫瘤相比，CAR-T細(xì)胞治療實(shí)體瘤的障礙在于CAR-T 細(xì)胞不能完全遷移、浸潤到腫瘤組織中，一部分是由于激活的T細(xì)胞黏附、趨化性降低。但是放射治療可通過IFN-γ依賴的方式使腫瘤微環(huán)境中細(xì)胞間黏附分子1 和血管細(xì)胞黏附分子1增加，增強(qiáng)T細(xì)胞的黏附能力[50-51]。研究結(jié)果[52-54]表明，放射治療還可增加CXCL9、CXCL10和CXCL16的分泌，從而使活化的T細(xì)胞集中到腫瘤組織，因此，放射治療還可以增強(qiáng)活化的T細(xì)胞的趨化性。放射治療還可以使腫瘤內(nèi)異常的血管重構(gòu)，從而使細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞更有效地運(yùn)輸?shù)侥[瘤組織中[52]。此外，放射治療能夠提高PD-L1CAR-T細(xì)胞對低水平PD-L1表達(dá)的NSCLC異種移植瘤的殺傷能力，可能是因?yàn)榉派渲委熌軌蚴笴AR-T細(xì)胞在腫瘤中的浸潤增加[55]。

CAR-T 細(xì)胞治療實(shí)體瘤的研究尚在早期階段，尤其是CAR-T細(xì)胞治療與放射治療或化學(xué)治療聯(lián)合的研究還較少。目前，尚不能確定化學(xué)治療和放射治療與CAR-T細(xì)胞聯(lián)合治療的順序、劑量等問題，還需要更多的臨床試驗(yàn)來提供經(jīng)驗(yàn)。

4 結(jié)語

CAR-T細(xì)胞在治療實(shí)體瘤方面仍然存在很多困難，包括靶向腫瘤外毒性、細(xì)胞因子釋放綜合征、T細(xì)胞耗竭、腫瘤免疫逃逸、腫瘤組織浸潤程度低等。CAR-T細(xì)胞成功治療NSCLC的關(guān)鍵是發(fā)現(xiàn)了腫瘤特異性抗原，并且CAR-T細(xì)胞能夠成功的運(yùn)輸、浸潤到腫瘤組織中，使其持久地殺傷腫瘤細(xì)胞。CAR-T細(xì)胞治療NSCLC已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了越來越多的靶標(biāo)，但是缺乏相對特異性。此外，CAR-T細(xì)胞治療聯(lián)合化學(xué)治療或放射治療NSCLC的臨床試驗(yàn)也在進(jìn)行中。總之，CAR-T細(xì)胞治療NSCLC的臨床應(yīng)用研究仍需要進(jìn)一步探索。