黃柳萍 梁莊嚴(yán) 吳偉彪 魏楚洪 羅小芳 吳海燕 郭潤民 趙卓姝▲

1.廣東醫(yī)科大學(xué)順德婦女兒童醫(yī)院醫(yī)學(xué)遺傳實(shí)驗(yàn)室，廣東佛山 528300；2.廣東醫(yī)科大學(xué)順德婦女兒童醫(yī)院新生兒疾病篩查中心，廣東佛山 528300；3.廣東醫(yī)科大學(xué)順德婦女兒童醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心，廣東佛山 528300

在產(chǎn)前診斷工作中經(jīng)常遇到嵌合體的情形，如何準(zhǔn)確判斷所觀察到的嵌合現(xiàn)象屬于真性嵌合還是假性嵌合，是困擾每一個(gè)產(chǎn)前診斷醫(yī)生的難題。染色體核型是一種傳統(tǒng)方法，通過計(jì)算核型的數(shù)量算出異常核型的比例來分辨嵌合體，該方法受培養(yǎng)過程的影響，也無法發(fā)現(xiàn)<5 Mb 的染色體異常，具有局限性。拷貝數(shù)變異測(cè)序（copy number variations-sequencing，CNV-seq）檢測(cè)不需要進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，分辨率高，但是無法檢出純合區(qū)域、單親二倍體和染色體結(jié)構(gòu)異常[1]。因此，兩種方法的結(jié)合理論上可提高羊水嵌合體的診斷準(zhǔn)確率。本研究納入染色體核型聯(lián)合CNV-seq 診斷嵌合體的病例，分析其診斷結(jié)果，為產(chǎn)前診斷中羊水嵌合體的診斷提供數(shù)據(jù)和經(jīng)驗(yàn)支持。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2019年1月至2021年6月因各種高危因素于廣東醫(yī)科大學(xué)順德婦女兒童醫(yī)院（我院）產(chǎn)前診斷中心就診并進(jìn)行產(chǎn)前診斷的孕婦3163 例作為研究對(duì)象，收集所有的羊水染色體核型分析結(jié)果或CNV-seq 結(jié)果為嵌合體的病例進(jìn)行分析。所有入選孕婦均簽署知情同意書，該研究得到我院產(chǎn)前診斷中心醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①單胎妊娠且孕周16～24 周；②有明確產(chǎn)前診斷指征，包括高齡、超聲異常、唐氏篩查異常、不良孕產(chǎn)史等。排除標(biāo)準(zhǔn)：①多胎妊娠；②孕周<9 周；③近幾個(gè)月有先兆流產(chǎn)者；④其他侵入性產(chǎn)前診斷有禁忌證者。所有入選孕婦接受由具有遺傳咨詢資質(zhì)的臨床醫(yī)生提供詳細(xì)遺傳咨詢，建立遺傳咨詢病例，記錄孕婦的臨床相關(guān)信息。所有孕婦均在超聲定位后，在無菌條件下經(jīng)腹壁行羊水穿刺術(shù)，取羊水20～25 ml 進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。

1.2 染色體核型分析

羊水離心后去上清，細(xì)胞懸液置于37℃ 5%CO2培養(yǎng)，帶羊水細(xì)胞貼壁鏡下見多個(gè)克隆即可進(jìn)行收獲。常規(guī)制片，G 顯帶，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)[2]，計(jì)數(shù)不少于20 個(gè)分裂相，分析5 個(gè)核型。根據(jù)人類細(xì)胞遺傳學(xué)國際命名體制（ISCN）對(duì)所檢染色體進(jìn)行命名，依據(jù)判讀指南對(duì)染色體結(jié)果進(jìn)行分析和判讀[3]。

1.3 CNV-seq檢測(cè)

按照DNA 提取，DNA 文庫構(gòu)建與測(cè)序，生物信息學(xué)分析的流程進(jìn)行CNV-seq 檢測(cè)，分析并記錄相關(guān)數(shù)據(jù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行比較，P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 羊水嵌合體檢出率

3163 例羊水檢出嵌合體43 例，檢出率為1.36%，其中染色體核型檢出嵌合體40 例，檢出率為1.26%，CNV-seq 檢出嵌合體20 例，檢出率為0.63%，染色體核型對(duì)嵌合體的檢出率顯著高于CNV-seq 對(duì)嵌合體的檢出率（χ2=6.731，P=0.009）。

2.2 染色體核型聯(lián)合CNV-seq對(duì)嵌合體的診斷

如表1所示，染色體核型與CNV-seq 檢測(cè)結(jié)果相符率為39.53%（17/43），其中性染色體相符率為52.38%（11/21，21 為性染色體嵌合的病例數(shù)），大部分為45，X 嵌合體；常染色體相符率為27.27%（6/22，22 為常染色體嵌合的病例數(shù)），有8、12、13、16、21 號(hào)染色體嵌合。如表2所示，檢測(cè)結(jié)果不相符26 例，其中10 例性染色體嵌合，最多的是45，X嵌合體，其次是47，XXX 嵌合體；16 例常染色體嵌合，有5、9、10、14、18、20、21 號(hào)染色體嵌合，而最多的是18 和21 號(hào)染色體嵌合。

表1 染色體核型與CNV-seq檢測(cè)羊水嵌合體結(jié)果相符病例

表2 染色體核型與CNV-seq檢測(cè)羊水嵌合體結(jié)果不相符病例

3 討論

產(chǎn)前診斷過程中經(jīng)常遇到嵌合體的情形，胎兒整個(gè)機(jī)體存在兩種或以上的細(xì)胞系，稱之為真性嵌合體，除此之外還經(jīng)常因?yàn)槟秆廴?、培養(yǎng)過程中的細(xì)胞畸變等原因出現(xiàn)假性嵌合體的情況[4-5]，可能會(huì)錯(cuò)誤地引導(dǎo)孕婦引產(chǎn)，所以正確地分辨真假嵌合非常重要。目前，分辨真假嵌合主要有四種方法：①染色體核型分析。通過計(jì)數(shù)核型的數(shù)量算出異常核型的比例來分辨嵌合體。這種判斷真假嵌合體的方法有個(gè)巨大的缺陷，有可能是異常細(xì)胞產(chǎn)生了畸變后進(jìn)入羊水中，從而培養(yǎng)物中出現(xiàn)多種異常染色體核型，而誤診為真性嵌合體，也有可能是體外培養(yǎng)或制片過程中的染色體畸變的細(xì)胞較多，從而異常集落較多而誤診為真性嵌合體[6-7]。②通過孕晚期臍血細(xì)胞染色體核型分析來驗(yàn)證或者結(jié)合超聲結(jié)果綜合判斷。相關(guān)研究表明，羊水嵌合體發(fā)生率在0.29%左右，用胎兒組織或臍血來驗(yàn)證，真嵌合體的比率只有62.5%[8]，而對(duì)性染色體嵌合的研究表明[9]，用臍血來驗(yàn)證羊水性染色體嵌合，真性嵌合體只占47.8%（11/23）。張玲玲等[10]推薦在孕晚期采集臍血進(jìn)行復(fù)查，并結(jié)合超聲結(jié)果排除妊娠假性嵌合體，取得一定效果。該方法具有明顯的弊端，首先采集臍血具有一定的概率流產(chǎn)，增加了孕婦的風(fēng)險(xiǎn)，其次當(dāng)發(fā)生低比例嵌合或性染色體嵌合時(shí)，超聲影像不能及時(shí)診斷[11]。③用熒光原位雜交技術(shù)（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）驗(yàn)證。付玉榮等[12]將FISH 應(yīng)用于產(chǎn)前嵌合體的輔助診斷，8 例染色體核型嵌合體結(jié)果中有3 例與FISH 結(jié)果不一致。FISH 將熒光素標(biāo)記核酸探針與待測(cè)樣本中的核酸序列雜交，實(shí)驗(yàn)周期短，成功率高，但是特異性探針價(jià)格高，并不是所有醫(yī)療機(jī)構(gòu)都有條件開展該項(xiàng)目，探針的局限性也決定其不能對(duì)染色體結(jié)構(gòu)異常進(jìn)行檢測(cè)[13]，從而限制了該技術(shù)的應(yīng)用。④應(yīng)用CNV-seq 檢測(cè)嵌合體，理想條件下可檢測(cè)出低至5%的染色體非整倍體嵌合，臨床條件下可檢出超過10%的染色體非整倍體嵌合[14]，同時(shí)可以客觀地檢測(cè)出微缺失、微重復(fù)，不像核型分析那樣主觀觀察和判斷，可精確檢測(cè)低至10～50 ng 的DNA 樣本，具有很強(qiáng)的臨床適用性。

本研究納入染色體核型聯(lián)合CNV-seq 診斷嵌合體的病例，分析結(jié)果顯示，染色體核型和CNV-seq結(jié)果相符率只有39.5%（17/43），其中性染色體相符率為52.38%（11/21），崔科等[15]研究發(fā)現(xiàn)染色體核型聯(lián)合CNV-seq 檢測(cè)性染色體嵌合體的符合率為78.57%，雖高于本研究結(jié)果，但符合率仍有待提高。常染色體相符率僅為27.27%（6/22）。染色體核型檢出而CNV-seq 未檢出的原因很可能是因?yàn)榈捅壤逗铣鯟NV-seq 的檢測(cè)下限，特別是常染色體嵌合，染色體核型檢出的嵌合比例都在6%以下（19、23 號(hào)病例除外，可能是細(xì)胞培養(yǎng)過程中異常細(xì)胞優(yōu)勢(shì)生長，或是染色體制片過程中隨機(jī)收獲到了更多的異常細(xì)胞，導(dǎo)致嵌合比例假性增高），18號(hào)病例mos 45，X[25]/46，X，psu dic（X）（q25）[31]屬于X 單體嵌合結(jié)構(gòu)異常的psu dic（X），整體數(shù)量還是相當(dāng)于兩條X 染色體，因此CNV-seq 不能檢出。染色體核型未檢出而CNV-seq 檢出的嵌合體病例有3 例，均為常染色體嵌合，常染色體異常的細(xì)胞培養(yǎng)可能生長過程緩慢，所以導(dǎo)致染色體核型未檢出而CNV-seq 檢出?？梢?，染色體核型聯(lián)合CNV-seq 診斷嵌合體，可確認(rèn)一部分真性嵌合（檢測(cè)結(jié)果一致時(shí)），可檢出傳統(tǒng)染色體核型未檢出的嵌合體（病例28、29、30）。還有一部分檢測(cè)結(jié)果不相符的病例可懷疑假性嵌合，可通過FISH 驗(yàn)證或孕晚期采集臍血進(jìn)一步驗(yàn)證。從嵌合比例的分布上看，43 個(gè)病例中，染色體核型檢出嵌合比例≥10%的病例有15例，其中13例與CNV-seq檢測(cè)結(jié)果相符，2 例不相符；染色體核型檢出嵌合比例<10%的病例有28 例，其中只有4 例與CNV-seq 檢測(cè)結(jié)果相符，24 例不相符；可見低比例嵌合更容易造成檢測(cè)結(jié)果不相符，更需要不同的方法來相互驗(yàn)證。CNV-seq 檢出嵌合比例≥10%的病例有20 例，其中17 例與染色體核型檢測(cè)結(jié)果相符，3 例不相符；而CNV-seq 檢出嵌合比例<10%的病例為0，可能是臨床條件下CNV-seq很難檢出<10%的嵌合，與前人研究結(jié)果相符[14]。

本研究納入嵌合體病例數(shù)量有限，有待進(jìn)一步納入更多病例以豐富臨床數(shù)據(jù)。嵌合體的診斷一直是產(chǎn)前診斷中的難題，隨著新技術(shù)的發(fā)展，可將染色體核型、CNV-seq、FISH、基因芯片等更多的技術(shù)應(yīng)用于產(chǎn)前嵌合體的診斷中，將會(huì)獲得更準(zhǔn)確的結(jié)果。本研究通過染色體核型和CNV-seq 的聯(lián)合診斷，提前確認(rèn)真性嵌合，避免孕婦后期復(fù)查臍血，減少孕婦焦慮，為產(chǎn)前診斷與遺傳咨詢工作提供巨大幫助。