林爽

細(xì)菌性陰道炎作為一種育齡女性常見(jiàn)疾病,與女性陰道內(nèi)的加德納菌群情況存在密切關(guān)系［1］。研究顯示,在細(xì)菌性陰道炎患者的陰道內(nèi)微生物菌群中加德納菌處于顯著優(yōu)勢(shì)地位,且高于其他正常菌群［2］,因此,陰道內(nèi)加德納菌群的科學(xué)檢測(cè)對(duì)于提高臨床治療效果具有重要現(xiàn)實(shí)意義。當(dāng)前,臨床對(duì)于陰道內(nèi)加德納菌的檢查主要通過(guò)涂片革蘭染色發(fā)現(xiàn)線索細(xì)胞、免疫熒光檢測(cè)、細(xì)菌分離培養(yǎng)以及PCR 檢測(cè)等［3］。基于此,本次研究分別對(duì)比細(xì)菌性陰道炎女性和健康女性行熒光定量PCR 檢測(cè)加德納菌的臨床效果,分析PCR 檢測(cè)陰道內(nèi)加德納菌的診斷價(jià)值,詳情如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇本院2019 年1 月～2020 年12 月收治的30 例細(xì)菌性陰道炎患者作為實(shí)驗(yàn)組,另選擇30 例同期健康體檢的健康女性作為對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組年齡18～45 歲,平均年齡(33.84±5.49)歲。對(duì)照組年齡18～45 歲,平均年齡(33.92±5.45)歲。兩組年齡等一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),具有可比性。

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn) 實(shí)驗(yàn)組符合細(xì)菌性陰道炎診斷標(biāo)準(zhǔn)；對(duì)照組不存在任何陰道炎病變；兩組患者均知曉本次實(shí)驗(yàn),且自愿參與,經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)同意。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn) 研究對(duì)象存在傳染病變；凝血功能障礙；哺乳或孕期。

1.3 方法 兩組研究對(duì)象均接受熒光定量PCR 檢測(cè)法檢測(cè),采用無(wú)菌棉拭子在女性陰道壁下1/3 處部位采集分泌物,并將其放于無(wú)菌試管內(nèi)送檢。棉拭子需在PBS 緩沖液匯總進(jìn)行震蕩懸浮后對(duì)其進(jìn)行離心處理,隨后收集沉淀菌體。根據(jù)提及試劑盒說(shuō)明書提取細(xì)菌DNA,并放于-70℃環(huán)境中保存。加德納菌的引物合成參考文獻(xiàn)［3］。

定性PCR 反應(yīng)體系下,保證上下游引物分別各為0.5 μl,模板設(shè)置為3 μl,使用雙蒸水補(bǔ)足25 μl。PCR 循環(huán)參數(shù)需設(shè)置為94℃環(huán)境下預(yù)變形5 min,94℃下進(jìn)行45 s,55℃下進(jìn)行45 s。將加德納菌標(biāo)準(zhǔn)菌株放置于LB培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng),并選擇單個(gè)培養(yǎng)菌落,提取細(xì)菌基因組的DNA 對(duì)其進(jìn)行常規(guī)的PCR 擴(kuò)增處理,并使用2%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。陽(yáng)性產(chǎn)物切膠純化之后回收,并對(duì)其進(jìn)行連接反應(yīng),實(shí)際操作步驟根據(jù)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行詳細(xì)操作。調(diào)節(jié)基線至合適的位置,保證各個(gè)熒光曲線與基線的交叉點(diǎn)作為主要的數(shù)值,并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線上的濃度以及數(shù)值對(duì)應(yīng)關(guān)系獲取各個(gè)待檢測(cè)標(biāo)本的初始濃度。針對(duì)不同濃度的DNA 模板進(jìn)行連續(xù)熒光定量PCR 反應(yīng),根據(jù)濃度做平行管,合理計(jì)算變異系數(shù)。

1.4 觀察指標(biāo) 對(duì)比兩組定性PCR 檢測(cè)結(jié)果以及陽(yáng)性率。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS23.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)數(shù)資料以率(%)表示,采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 定性PCR 檢測(cè)結(jié)果 實(shí)驗(yàn)組標(biāo)本進(jìn)行實(shí)時(shí)定性PCR 檢測(cè)后PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過(guò)電泳檢測(cè)后可以發(fā)現(xiàn)111 bp 特異性條帶。對(duì)其進(jìn)行序列分析,實(shí)驗(yàn)結(jié)果與同源性對(duì)比發(fā)現(xiàn),擴(kuò)增DNA 片段與序列符合率100%。

2.2 陽(yáng)性率 依據(jù)Amsel 診斷標(biāo)準(zhǔn),實(shí)驗(yàn)組30 份樣本中加德納菌陽(yáng)性標(biāo)本數(shù)為28 份,陽(yáng)性率為93.33%；對(duì)照組30 份樣本中加德納菌陽(yáng)性標(biāo)本數(shù)為12 份,陽(yáng)性率為40.00%。實(shí)驗(yàn)組加德納菌陽(yáng)性率高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=19.2000,P=0.000＜0.05)。

3 討論

陰道炎中不同的病原菌可導(dǎo)致不同類型的陰道炎,如滴蟲性陰道炎、細(xì)菌性陰道炎和霉菌性陰道炎［4］。滴蟲性陰道炎患者會(huì)出現(xiàn)陰道不適、疼痛瘙癢的癥狀,呈黃綠色稀薄的泡沫樣白帶。細(xì)菌性陰道炎是由陰道內(nèi)加德納菌導(dǎo)致的一種陰道炎癥。細(xì)菌性陰道炎作為婦科常見(jiàn)的疾病,其主要以女性陰道內(nèi)菌群比例失衡作為主要病變的傳染性病變［5］。細(xì)菌性陰道炎病因尚不明確,但部分學(xué)者認(rèn)為是由于加德納菌與厭氧菌混合感染所致,其是該病的主要發(fā)生因素［6］。現(xiàn)階段,臨床微生物檢查中常規(guī)的分離檢查方法是基礎(chǔ)診斷措施,應(yīng)用范圍比較廣泛。傳統(tǒng)的細(xì)菌實(shí)驗(yàn)室檢查以及鑒別,主要是根據(jù)細(xì)胞的組織形態(tài)性特征以及生理性狀,對(duì)細(xì)菌進(jìn)行培養(yǎng)以及生化反應(yīng)、免疫學(xué)檢測(cè)等［7］,檢測(cè)環(huán)節(jié)十分復(fù)雜,且無(wú)法給出理想的鑒定結(jié)果。隨著我國(guó)分子生物學(xué)的發(fā)展,PCR 技術(shù)以快速、敏感以及特異的優(yōu)勢(shì),靈活用于微生物檢測(cè)中。

細(xì)菌性陰道炎、其他類型陰道炎以及健康女性陰道分泌物都能檢出加德納菌。研究顯示,細(xì)菌性陰道炎患者和健康女性檢查中的加德納菌檢出率存在顯著差異［8］。因此,不能單純對(duì)細(xì)菌性陰道炎女性進(jìn)行PCR 檢測(cè),還需對(duì)其進(jìn)行定量研究,以此明確檢測(cè)結(jié)果,為臨床醫(yī)生提供更多的診斷數(shù)據(jù)。熒光定量PCR檢測(cè)法是一種可以進(jìn)行定量檢測(cè)的基因擴(kuò)增的PCR 技術(shù),此種檢測(cè)技術(shù)的住院原理是在PCR 系統(tǒng)中添加一些熒光染料或者熒光分子標(biāo)記的寡核苷酸鏈,通過(guò)物質(zhì)和PCR 相結(jié)合產(chǎn)生特定的物質(zhì),且此種物質(zhì)在紫外線的刺激之下,可以發(fā)生特定的熒光。檢測(cè)人員通過(guò)觀察實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的熒光信號(hào)可以將檢測(cè)體系中相關(guān)數(shù)值顯示出來(lái),促使檢測(cè)人員可以將檢測(cè)的基因數(shù)量拷貝出來(lái),并根據(jù)其推理最初的基因數(shù)量。熒光標(biāo)記的探針匯總主要包括水解探針和雜交探針［9］。而熒光定量PCR 檢測(cè)法中主要包括［10-12］：①絕對(duì)的定量措施,通過(guò)構(gòu)建合理的基因序列標(biāo)準(zhǔn),并對(duì)其進(jìn)行一系列的定量檢測(cè)工作,將標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行合理的稀釋工作之后可以獲得多個(gè)不同稀釋之后的循環(huán)閾值(Ct 值)數(shù)值。而Ct 數(shù)值也是被檢測(cè)標(biāo)本熒光達(dá)到熒光閾值的循環(huán)數(shù)量,其主要是將核算數(shù)量作為根本的橫坐標(biāo),將log(Ct)作為縱坐標(biāo)進(jìn)行繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線,其通過(guò)檢測(cè)標(biāo)本的Ct 值在坐標(biāo)上的位置可以基本判定檢測(cè)標(biāo)本的核算數(shù)量；②相對(duì)定量：其主要是檢測(cè)人員根據(jù)公式進(jìn)行推到獲得的基因,可以直接對(duì)目的基因相對(duì)管家基因的量,檢測(cè)人員不需要做一些額外的標(biāo)準(zhǔn)曲線,其具有簡(jiǎn)便、省時(shí)等優(yōu)勢(shì)。

熒光定量PCR 檢測(cè)法還具有以下幾種檢測(cè)優(yōu)勢(shì)：檢測(cè)人員可以實(shí)時(shí)檢測(cè)檢測(cè)標(biāo)本的基因擴(kuò)增數(shù)量,并定量估算樣本中存在的基因初始數(shù)量,并經(jīng)過(guò)檢測(cè)中的熒光信號(hào)清晰獲取PCR 的全過(guò)程［13］。檢測(cè)人員進(jìn)行的操作比較簡(jiǎn)單,且需要消耗的檢測(cè)時(shí)間比較短,其具有較高的特異性以及靈敏度,可以顯著提升檢測(cè)的準(zhǔn)確性［14］。檢測(cè)人員在封閉的環(huán)境中進(jìn)行熒光定量PCR 實(shí)時(shí)檢測(cè)工作,可以顯著降低標(biāo)本發(fā)生污染的幾率［15］?，F(xiàn)如今,熒光定量PCR 已經(jīng)獲得積極普及使用,而對(duì)于mRNA 基因的表達(dá)研究、多個(gè)不同基因的定量分析、點(diǎn)突變的分析以及等位基因分析、單核苷酸多態(tài)性分析以及多個(gè)微生物,都可以進(jìn)行定量、定性的檢測(cè)分析工作［16］。

本次研究顯示,實(shí)驗(yàn)組標(biāo)本進(jìn)行實(shí)時(shí)定性PCR 檢測(cè),PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過(guò)電泳檢測(cè)后可以發(fā)現(xiàn)111 bp 特異性條帶。對(duì)其進(jìn)行序列分析,實(shí)驗(yàn)結(jié)果與同源性對(duì)比發(fā)現(xiàn),擴(kuò)增DNA 片段與序列符合率100%。實(shí)驗(yàn)組加德納菌陽(yáng)性率高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。由此可見(jiàn),對(duì)細(xì)菌性陰道炎患者進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)法檢測(cè),可以靈活檢測(cè)出陰道內(nèi)的加德納菌含量,進(jìn)而為醫(yī)生的診斷提供依據(jù)。本次實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)細(xì)菌性陰道炎女性體內(nèi)的加德納菌含量,其具有靈敏度、可重復(fù)操作的優(yōu)勢(shì),可以準(zhǔn)確發(fā)現(xiàn)患者體內(nèi)的加德納菌DNA 含量,幫助醫(yī)生對(duì)患者進(jìn)行更好的診斷。

綜上所述,對(duì)細(xì)菌性陰道炎患者進(jìn)行實(shí)施熒光定量PCR 法檢測(cè)檢測(cè)加德納菌,可以幫助醫(yī)生剛好診斷病情,提高診治效果。