◎ 孫 娜，燕如娟

（飛鶴（甘南）乳品有限公司，黑龍江 齊齊哈爾 162100）

生化鑒定技術(shù)主要是根據(jù)不同種屬的微生物其酶系統(tǒng)、代謝途徑和代謝產(chǎn)物的較大差異，以及這些代謝產(chǎn)物的不同生化特征，從而對這些代謝產(chǎn)物加以生化測定進而鑒定微生物的種類。

1 生化鑒定原理方法及注意事項

1.1 革蘭氏染色

1.1.1 革蘭氏染色的原理

革蘭氏染色是19世紀80年代由丹麥醫(yī)師Gram創(chuàng)立，可用于鑒別革蘭氏陰性菌與陽性菌，經(jīng)革蘭氏染色后的細菌可在鏡下清楚觀察到細菌的形態(tài)及結(jié)構(gòu)特征，可用以細菌分類鑒定。①革蘭氏陽性。革蘭氏陽性菌細胞壁較厚，主要成分由肽聚糖相互交聯(lián)而形成致密的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。當細菌被結(jié)晶紫溶液染色后利用乙醇進行脫色時，細菌細胞壁的肽聚糖層因失水而導致孔徑縮小以至關(guān)閉，使結(jié)晶紫與碘染色復合物無法脫色而被保留在胞內(nèi)，呈現(xiàn)藍紫色。②革蘭氏陰性。革蘭氏陰性菌細胞壁中肽聚糖含量低，脂類物質(zhì)含量高，用乙醇進行脫色時，細胞壁中的脂類物質(zhì)被乙醇溶解，增加了細胞壁的通透性，使得結(jié)晶紫與碘染色復合物易被乙醇抽出而脫色，隨后被沙黃溶液復染著色，使細胞呈現(xiàn)紅色。

1.1.2 操作方法

革蘭氏染色法包括初染、媒染、脫色和復染等4個步驟。涂片后固定載玻片，加龍膽紫液染色10 s，水洗，甩干；加碘溶液染色10 s，水洗，甩干；加脫色液脫色10～20 s，水洗，甩干；加沙黃溶液復染 10 s，水洗；待干，鏡檢。

1.1.3 注意事項

①要確保使用的革蘭氏染色試劑有效，并按照說明書進行試驗。②選用活躍生長期菌種進行染色，部分衰老或死亡的革蘭氏陽性細菌細胞壁會自行溶解，使細胞壁通透性增加，從而被乙醇脫色，因此沙黃復染后會有假陰性的情況出現(xiàn)。③要均勻涂片，否則太厚的地方脫色不均勻。此外，固定時不要燒過，以免菌體萎縮以至于變形。整體涂片不宜過厚，以免脫色不完全而造成假陽性。④媒染時間不宜過長。結(jié)晶紫與碘液作用時間過長會導致其復合物過于牢固結(jié)合在菌體細胞壁上，影響乙醇脫色效果，從而導致假陽性結(jié)果的出現(xiàn)。⑤掌握合適的脫色時間。洗脫是革蘭氏染色的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，應嚴格控制在10～20 s以保證洗脫效果。洗脫時間過短會導致革蘭氏陰性菌體內(nèi)的結(jié)晶紫復合物不能被有效洗脫出來，使陰性菌出現(xiàn)假陽性；而洗脫時間過長，革蘭氏陽性菌的細胞壁結(jié)構(gòu)可能會被乙醇破壞，導致胞內(nèi)的結(jié)晶紫復合物被洗脫，出現(xiàn)假陰性。

1.2 糖發(fā)酵試驗

糖發(fā)酵試驗是腸道細菌鑒定中最常用的生化反應，其目的在于檢測不同細菌利用各種碳源的能力。大多數(shù)細菌都能利用糖類作為碳源，但不同的細菌表達不同的酶系，所以在分解糖類物質(zhì)的種類和能力上有很大差異[1]。實驗室微生物檢驗項目中腸桿菌科的鑒定多用到葡萄糖發(fā)酵實驗，具體操作方法為用接種針挑取典型菌落，穿刺于葡萄糖瓊脂內(nèi)，于（36±1）℃培養(yǎng)（24±2）h，若試管內(nèi)的內(nèi)容物變?yōu)辄S色，判為陽性反應；不變色判為陰性反應。此外，用接種針挑取典型菌落，穿刺于葡萄糖瓊脂內(nèi)時，應注意不要觸及試管底部。

1.3 吲哚試驗

1.3.1 原理

吲哚試驗又名靛基質(zhì)試驗，其原理是基于某些細菌能夠分解色氨酸生成吲哚，吲哚可以與試劑中的對二甲氨基苯甲醛結(jié)合生成玫紅色的玫瑰吲哚，用以檢測細菌分解色氨酸的能力[2]。

1.3.2 操作方法及注意事項

按照API20E說明書使用棉簽拭子從分離物的平板上挑取已分離提純的單個菌落至安瓿瓶中，用毛細滴管反復吹打，制成均一的菌懸液，將菌液接種到小管及小杯中，利用石蠟油覆蓋指定的生化孔（有劃線的孔），蓋上蓋子進行培養(yǎng)，按操作說明書規(guī)定，將附加試劑加進小孔內(nèi)，進行判讀。用接種環(huán)挑取菌落不容易混勻，還易挑到培養(yǎng)基對結(jié)果產(chǎn)生一定的干擾，可使用專用的棉簽拭子挑取菌落。

1.4 氧化酶試驗

1.4.1 原理

氧化酶又稱細胞色素氧化酶、細胞色素氧化酶C或呼吸酶，細胞色素呼吸酶系統(tǒng)的終末呼吸酶，該實驗用以檢測細菌中是否存在該酶。該試驗原理基于細胞中氧化酶可氧化細胞色素C，而氧化型細胞色素C可氧化四甲基對苯二胺，出現(xiàn)紫色反應[3]。實驗室可用氧化酶試驗鑒定克羅諾桿菌屬（阪崎腸桿菌）以及腸桿菌科等。

1.4.2 操作方法及注意事項

在平皿中放置一張普通的濾紙并滴上氧化酶試劑。用接種環(huán)挑取一單獨的菌落在濾紙上涂抹少許。一張濾紙可進行多個菌落的實驗。觀察菌落15 s內(nèi)顏色的變化，若變成紫色或深紫色，為氧化酶陽性；不變色，為氧化酶陰性；同時滴1滴氧化酶試劑在沒有沾取菌落的濾紙上做陰性對照，應不變色。此外，應使用鉑/銥接種環(huán)或玻璃棒（不要用鎳鉻接種環(huán)）挑取單個菌落。

1.5 賴氨酸脫羧酶試驗

1.5.1 原理

賴氨酸脫羧酶的原理基于某些能產(chǎn)生賴氨酸脫羧酶的細菌可將賴氨酸脫羧生成堿性更強的胺和二氧化碳，經(jīng)溴甲酚紫指示劑染色后可使培養(yǎng)基呈紫色[4]。

1.5.2 操作方法及注意事項

用接種環(huán)或接種針挑取單個菌落，接種賴氨酸脫羧酶試驗培養(yǎng)基，（36±1）℃培養(yǎng)18～24 h，必要時可延長培養(yǎng)時間至48 h。實驗室主要用于沙門氏菌的鑒定。在進行沙門氏菌驗證時，接種三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基時先于斜面劃線，然后再底層穿刺；接種針接種時應注意不要滅菌，直接接種于賴氨酸脫羧酶培養(yǎng)基與營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上。

1.6 尿素酶試驗

1.6.1 原理

尿素酶試驗的原理基于某些能夠表達尿素酶的細菌可分解尿素產(chǎn)氨，使培養(yǎng)基呈堿性[5]。因此，將被檢菌接種于相應的尿素培養(yǎng)基，于（36±1）℃培養(yǎng)18～24 h后觀察結(jié)果，可以產(chǎn)生尿素酶的細菌分解尿素后培養(yǎng)基呈堿性，可以使酚紅指示劑變紅。實驗室主要用尿素酶試驗鑒定沙門氏菌。

1.6.2 操作方法及注意事項

用接種環(huán)或接種針挑取單個菌落，直接接種于尿素酶培養(yǎng)基，（36±1）℃恒溫培養(yǎng)18～24 h后觀察，必要時可延長至48 h。此外，在進行沙門氏菌驗證時，接種三糖鐵瓊脂和賴氨酸脫羧酶試驗培養(yǎng)基的同時，可直接接種尿素酶。

1.7 三糖鐵瓊脂試驗

1.7.1 原理

在進行三糖鐵瓊脂試驗時，可同時觀察乳糖和蔗糖發(fā)酵產(chǎn)酸或產(chǎn)酸產(chǎn)氣（變黃），產(chǎn)生硫化氫（變黑），實驗室主要用三糖鐵瓊脂試驗鑒定沙門氏菌。

1.7.2 操作方法及注意事項

在進行沙門氏菌驗證時，從選擇性瓊脂培養(yǎng)基上分別挑取2個以上典型或可疑菌落，接種三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基，先于斜面上劃線，再于底層穿刺；于（36±1）℃培養(yǎng)18～24 h，必要時可延長至48 h。在進行沙門氏菌驗證時，接種三糖鐵瓊脂要注意先在斜面劃線，再于底層穿刺。

1.8 血清學反應

1.8.1 原理

在微生物分類鑒定中，血清學反應是指利用血清學反應的基本原理，將已知菌種或菌型的細菌免疫動物制備抗血清，然后根據(jù)待檢微生物樣品是否能與其發(fā)生特異性的血清學反應來鑒定未知菌種的方法。實驗室主要用血清學反應鑒定沙門氏菌。

1.8.2 操作方法及注意事項

按照說明書進行試驗，于載玻片上選取兩塊約 1 cm×2 cm的區(qū)域，用無菌接種環(huán)挑取待測菌接種于每塊區(qū)域的上部，于其中一塊區(qū)域的下方滴加多價菌體抗血清，另一區(qū)域下部滴加等量生理鹽水為陰性對照。然后用無菌接種環(huán)分別將兩區(qū)域的待測菌與抗血清（生理鹽水）研磨成乳液狀，并將載玻片傾斜，持續(xù)搖動混合1 min，于黑暗背景下觀察凝集狀態(tài)，出現(xiàn)任何程度的凝集現(xiàn)象均可判定為陽性反應。在進行血清學試驗時，應注意使用接種環(huán)或針將菌苔研成乳狀液時，先在生理鹽水中研磨，再進行血清研磨。

1.9 過氧化氫酶試驗

1.9.1 原理

過氧化氫酶試驗的原理是黃酶系統(tǒng)的呼吸酶在電子傳遞鏈將氫傳遞給分子氧生成過氧化氫，而過氧化氫活細胞具有毒性，含有過氧化氫酶細菌可以催化過氧化氫使其分解為水和分子態(tài)氧。判定標準為30 s內(nèi)產(chǎn)生大量氣泡為陽性，不產(chǎn)生氣泡為陰性。革蘭氏陽性球菌中，葡萄球菌與微球菌可產(chǎn)生過氧化氫酶，因此該反應呈陽性，而鏈球菌屬細菌過氧化氫酶反應呈陰性，因此該反應可用于區(qū)分葡萄球菌和鏈球菌，實驗室多用于蠟樣芽孢桿菌與金黃色葡萄球菌的鑒定。

1.9.2 操作方法

用吸管吸1滴3%過氧化氫溶液在載玻片上。用無菌的塑料接種環(huán)或木制無菌牙簽挑取一單獨菌落與過氧化氫溶液混合。如果有氣泡產(chǎn)生，判定為過氧化酶陽性；沒有氣泡產(chǎn)生，判定為過氧化酶陰性。一般微球菌屬和芽孢桿菌屬為陽性結(jié)果，乳酸桿菌屬和鏈球菌屬為陰性結(jié)果。

1.9.3 注意事項

①自配的3% H2O2溶液，不能倒入長有菌落的血瓊脂平板上，可能會產(chǎn)生假陽性結(jié)果。②不能用鉑金類或鎳合金類的接種針或接種環(huán)去混合培養(yǎng)物和3% H2O2溶液，可能會產(chǎn)生假陽性。③菌落較小時可能出現(xiàn)假陰性的結(jié)論。

1.10 蛋白質(zhì)毒素結(jié)晶試驗

1.10.1 操作方法

挑取純培養(yǎng)的獨立可疑菌落接種于硫酸錳營養(yǎng)瓊脂平板上，經(jīng)（30±1）℃培養(yǎng)（24±2）h，并將平板置于室溫放置3～4 d，挑取少量培養(yǎng)物于載玻片上，加入蒸餾水混勻。自然干燥然后微火固定，加甲醇作用30 s后棄去，然后通過火焰進行干燥，再于載玻片上滴滿0.5%堿性復紅，再次放火焰上加熱，1～2 min 后移去火焰，再更換染色液染色30 s，傾去染色液用蒸餾水徹底清洗、晾干后鏡檢。實驗室可用于鑒別蠟樣芽孢桿菌與蘇云金芽孢桿菌。

1.10.2 注意事項

①菌液濃度過高，可能會導致非典型的結(jié)論。②在載玻片上滴滿0.5%堿性復紅時，在火焰上加熱需要微見蒸氣，注意不要使染液沸騰。③如發(fā)現(xiàn)游離芽孢的形成不豐富，應將培養(yǎng)物置室溫2～3 d再進行檢查。

1.11 動力試驗

動力試驗是有動力的細菌會延穿刺路線擴散生長，實驗室主要用于蠟樣芽孢桿菌和單核細胞增生李斯特氏菌的鑒定。具體操作方法為用接種針挑取培養(yǎng)物穿刺接種于動力培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)24 h。有動力的蠟樣芽孢桿菌應沿穿刺線呈擴散生長。此外，用接種針挑取典型菌落進行穿刺時，注意不要觸及試管 底部。

1.12 溶血試驗

1.12.1 原理

溶血試驗的原理基于某些細菌在代謝過程中可以產(chǎn)生能夠使人或動物的紅細胞裂解的溶血素，因此將待檢細菌劃線接種于綿羊血平板后，可在菌落周圍觀察到明顯溶血圈。當待檢菌落周圍出現(xiàn)透明的溶血圈時，待測菌為完全溶血（β溶血）；當待檢菌落周圍出現(xiàn)綠色溶血圈，待測菌為不完全溶血（α溶血）；當待檢菌落周圍無溶血環(huán)則為不溶血（γ溶血）。實驗室主要用于金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌以及單核細胞增生李斯特氏菌的鑒定。

1.12.2 操作方法及注意事項

挑取純培養(yǎng)的單個疑似菌落，接種至胰酪胨大豆羊血瓊脂培養(yǎng)基上，（30±1）℃培養(yǎng)（24±2）h。典型菌落為淺灰色，且不透明，似白色毛玻璃狀，有完全溶血環(huán)或草綠色溶血環(huán)。用接種針挑取典型菌落時，注意不要觸及平皿底部。

1.13 血漿凝固酶試驗

1.13.1 原理

血漿凝固酶試驗的原理基于某些細菌產(chǎn)生的血漿凝固酶可以使血漿中的纖維蛋白原變?yōu)槔w維蛋白。細菌分泌的凝固酶大致分為兩類。①一種凝固酶可直接結(jié)合于細菌的細胞壁，當血漿中的纖維蛋白直接接觸時可將細菌凝集成顆粒狀，針對產(chǎn)生該種凝固酶的細菌多用玻片法進行鑒定。②凝固酶也稱游離血漿凝固酶，指細菌將凝固酶分泌至胞外，在接觸血漿后將血漿中的纖維蛋白原凝集為纖維蛋白，多用試管法進行檢驗。判定標準為檢測6 h內(nèi)，待檢管和陽性對照管出現(xiàn)凝集，陰性對照管不凝集，凝固酶檢測為陽性。實驗室主要用于金黃色葡萄球菌鑒定，一般凝固酶呈陰性的葡萄球菌多為非致病性，而凝固酶呈陽性的葡萄球菌多為致病性葡萄球菌。

1.13.2 操作方法

打開凍干血漿，每支西林瓶中加入0.5 mL無菌生理鹽水完全溶解，加BHI培養(yǎng)基中的培養(yǎng)物0.2～0.3 mL， 并充分振蕩搖勻，放置于（36±1）℃培養(yǎng)箱內(nèi)，每間隔30 min觀察一次，觀察至6 h，如呈現(xiàn)凝固或凝固體積大于原體積的一半，可判定陽性結(jié)果。

1.13.3 注意事項

在進行血漿凝固酶試驗時，要同時以血漿凝固酶試驗陽性菌株和陰性葡萄球菌菌株的肉湯培養(yǎng)物作為對照試驗。

2 結(jié)語

生化鑒定技術(shù)有顯著的特異性，上述實驗在實驗室的生化鑒定過程中不斷地實踐與總結(jié)經(jīng)驗，隨著科學技術(shù)的發(fā)展，越來越多的生化鑒定技術(shù)應用到微生物鑒定中，給微生物檢測帶來新的機遇和發(fā)展。