何爽，王喜紅，陳夢琳，張興華，唐閣*

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎病科，天津 300193；2.國家中醫(yī)針灸臨床醫(yī)學(xué)研究中心，天津 300193）

0 引言

腎性貧血是由促紅細(xì)胞生成素缺乏所導(dǎo)致的正色素正細(xì)胞性貧血，是慢性腎臟?。╟hronic kidney disease,CKD）的常見并發(fā)癥[1]，也是CKD患者合并心血管并發(fā)癥的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[2]。當(dāng)腎小球?yàn)V過率降至60m L/(min·1.73m2)以下時(shí)，疾病進(jìn)展速度加快，并且腎小球?yàn)V過率越低，病情越嚴(yán)重。該病多發(fā)生于CKD4-5期患者，其中CKD4期患者的發(fā)病率約為50%，終末期腎臟病患者的發(fā)病率更是高達(dá)90%以上。糾正貧血可在一定程度上降低CKD患者死亡率、住院率，同時(shí)提高患者的生活質(zhì)量[3]。

近年來，隨著腎性貧血中醫(yī)病因病機(jī)的研究不斷深入，中醫(yī)藥治療腎性貧血取得了較大進(jìn)展。中藥復(fù)方在治療腎性貧血方面具有多靶點(diǎn)、整體調(diào)治、安全性高的顯著優(yōu)勢。四物湯作為補(bǔ)血調(diào)血的基礎(chǔ)方，已被廣泛應(yīng)用于各種類型的貧血[4-6]。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析四物湯（組成分別為當(dāng)歸、川芎、白芍、熟地黃）的有效活性成分及作用靶點(diǎn)，探究其治療腎性貧血的潛在作用機(jī)制，以期為后續(xù)的臨床及實(shí)驗(yàn)研究提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 四物湯相關(guān)靶點(diǎn)的收集

通過中醫(yī)藥系統(tǒng)藥理學(xué)平臺TCMSP（old.tcmsp-e.com/tcmsp.p hp）分別檢索當(dāng)歸、川芎、白芍、熟地黃四味中藥，以口服利用度（OB）≥30%，且類藥性（DL）≥0.18為標(biāo)準(zhǔn)，對有效活性成分及其對應(yīng)靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行篩選，篩選后根據(jù)已發(fā)表的文獻(xiàn)補(bǔ)充未檢測到的靶點(diǎn)。完成上述步驟后在Unip rot數(shù)據(jù)庫（https://w w w.uniprot.org/）進(jìn)行蛋白和基因的標(biāo)準(zhǔn)化轉(zhuǎn)換。

1.2 四物湯治療腎性貧血相關(guān)靶點(diǎn)的篩選

通過人類基因數(shù)據(jù)庫G e n e C a r d s（http s://w w w.genecard s.org）和人類基因和遺傳疾病數(shù)據(jù)庫OMIM（http s://w w w.omim.org），以“Renal anemia”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，同時(shí)利用DrugBank數(shù)據(jù)庫（https://go.d rugbank.com）對疾病基因進(jìn)行補(bǔ)充，去除重復(fù)項(xiàng)得到最終的腎性貧血相關(guān)基因，并與藥物成分的相應(yīng)靶點(diǎn)取交集，所得到的交集基因即是四物湯治療腎性貧血的潛在作用靶點(diǎn)。

1.3 四物湯成分—腎性貧血靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將得到的交集基因通過S t r i n g數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org）進(jìn)行生物信息分析。利用Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建藥物有效成分—疾病—靶點(diǎn)的蛋白互作（PPI）的可視化網(wǎng)絡(luò)。

1.4 四物湯成分—腎性貧血靶點(diǎn)功能與通路的富集分析

將四物湯治療腎性貧血的靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape數(shù)據(jù)庫（https://metascape.org）進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，借助微生信（w w w.bioinformatics.com.cn）對其結(jié)果進(jìn)行可視化處理，分析四物湯治療腎性貧血的潛在機(jī)制。

1.5 分子對接驗(yàn)證

根據(jù)Degr ee值篩選出排名前3的核心靶點(diǎn)與頻次最高的3個(gè)關(guān)鍵成分，分別在PDB數(shù)據(jù)庫(http://w w w.p d b.org/)下載蛋白的3D結(jié)構(gòu)、Pubchem數(shù)據(jù)庫（http s://p ubchem.ncbi.nlm.nih.gov）下載有效成分的2D結(jié)構(gòu)，利用Auto Dock和Pymol軟件對四物湯中的主要成分和核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對接，對其結(jié)合活性進(jìn)行分子驗(yàn)證。一般結(jié)合能越小，分子對接結(jié)果越好，當(dāng)結(jié)合能≤-5 k J/mol，提示核心靶點(diǎn)與有效成分間的結(jié)合活性較好[7]。

2 結(jié)果

2.1 四物湯的化學(xué)活性成分與腎性貧血的相關(guān)靶點(diǎn)

通過對當(dāng)歸、川芎、白芍、熟地黃的有效成分進(jìn)行檢索，共獲得18個(gè)有效成分，分別為β-谷甾醇、豆甾醇、Mand enol、楊梅酮、黑麥草堿、川芎萘呋內(nèi)酯、谷甾醇、甲酰胺、芍藥黃酮、(3S,5R,8R,9R,10S,14S)-3,17-d ihyd roxy-4,4,8,10,14-p entamethyl-2,3,5,6,7,9-hexahy d r o-1H-cy clop enta[a]p henanthrene-15,16-d ione、芍藥苷、丁子香萜、山柰酚、(+)-catechin。共獲得245個(gè)靶點(diǎn)，合并后4刪除重復(fù)值共得到靶點(diǎn)105個(gè)。通過Gene Card s、OMIM和Drugbank數(shù)據(jù)庫以“Renal anemia”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，經(jīng)過合并及刪除重復(fù)靶點(diǎn)后共獲得1834個(gè)腎形貧血相關(guān)靶點(diǎn)。

表1 四物湯中主要活性成分

2.2 四物湯成分—腎性貧血相關(guān)靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

將篩選出的105個(gè)藥物成分靶點(diǎn)與1834個(gè)疾病靶點(diǎn)取交集，獲得36個(gè)共同靶點(diǎn)，韋恩圖顯示結(jié)果如下，見圖1。將共同靶點(diǎn)輸入至string平臺，得到四物湯治療腎性貧血靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)。通過Cytoscap e 3.7.2軟件將結(jié)果根據(jù)Degree值調(diào)節(jié)進(jìn)行進(jìn)一步處理，得到一個(gè)具有36個(gè)節(jié)點(diǎn)，298條邊的可視化網(wǎng)絡(luò)，見圖2。

圖1 四物湯成分與腎性貧血相關(guān)靶點(diǎn)韋恩圖

圖2 四物湯與腎性貧血的可視化PPI網(wǎng)絡(luò)

2.3 靶點(diǎn)功能與通路的富集分析

將四物湯治療腎性貧血的靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascap e數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行GO功能富集分析，共獲得的生物過程(Biological Process,BP)有712條，細(xì)胞組成(Cell Composition,CC)有24條，分子功能(Molecular Function,MF)有58條，按校正P值分別取BP、CC、MF排名的前10條，共計(jì)30條，主要與對細(xì)菌來源的分子的反應(yīng)、對脂多糖的反應(yīng)、對無機(jī)物的反應(yīng)等生物功能有關(guān)，見圖3。對四物湯治療腎性貧血的靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析，共獲得126條通路，按校正P值排名取前30條通路在微生信進(jìn)行可視化，其中點(diǎn)越大表示富集基因數(shù)越多，顏色越紅表示四物湯對腎性貧血的干預(yù)越密切，由圖可知，其機(jī)制主要與脂質(zhì)和動脈粥樣硬化、AGE-RAGE等通路有關(guān)，繪圖后顯示如下，見圖4。

圖3 GO功能富集分析

圖4 KEGG通路富集分析

2.4 分子對接驗(yàn)證

利用AutoDock和Pymol軟件對排名前3的活性成分β-谷甾醇、豆甾醇、山柰酚和排名前三的核心靶點(diǎn)IL-6、AKT1、TNF，分別進(jìn)行分子對接。具體對接結(jié)果如下，見表2，由表2可知四物湯有效成分β-谷甾醇、豆甾醇、山柰酚和核心靶點(diǎn)IL-6、AKT1、TNF的結(jié)合能均≤-5 k J/mol，表明本研究中有效成分與核心靶點(diǎn)對接活性較好，可能是四物湯治療腎性貧血的主要有效活性成分；其中豆甾醇與AKT1結(jié)合力最強(qiáng)，其次是豆甾醇與IL-6、豆甾醇與TNF，分子對接結(jié)果見圖5。

表2 核心靶點(diǎn)與活性成分對接結(jié)果—最低結(jié)合能（kJ·mol-1）

AKT1與豆甾醇對接情況

IL-6與豆甾醇對接情況

TNF與豆甾醇對接情況圖5分子對接結(jié)果

3 討論

腎性貧血是CKD中后期較為常見的并發(fā)癥，亦是導(dǎo)致CKD患者心血管風(fēng)險(xiǎn)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。目前臨床上主要使用促紅細(xì)胞生成素（erythrop oietin,EPO）或EPO類似物，但可能誘發(fā)心血管事件、高鉀血癥和感染等并發(fā)癥，并增加死亡風(fēng)險(xiǎn)[8]。中藥在改善腎性貧血的臨床癥狀方面有極大潛力。賈梅等[9]在實(shí)驗(yàn)中證實(shí)四物湯可改善小鼠的外周血象、免疫器官指數(shù)及紅細(xì)胞膜能量代謝酶活力，起到較好補(bǔ)血的作用。在腎性貧血的臨床研究中，梁同衍等[10]證實(shí)四物湯不僅可升高維持性血液透析患者的血紅蛋白水平，亦可降低C反應(yīng)蛋白、IL-6水平，即改善患者的微炎癥狀態(tài)，從而間接發(fā)揮改善腎性貧血的作用。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選得到四物湯18種有效活性成分，其中β-谷甾醇、豆甾醇、山柰酚可能是發(fā)揮防治腎性貧血作用的關(guān)鍵成分。CKD患者中后期常伴有不同程度的貧血，炎癥反應(yīng)是CKD患者貧血加重的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[2]，而β-谷甾醇、豆甾醇、山柰酚均具有抗炎作用[11-13]。炎癥反應(yīng)時(shí)鐵代謝紊亂，巨噬細(xì)胞內(nèi)鐵滯留，最終導(dǎo)致紅細(xì)胞半衰期減少，EPO功能和紅細(xì)胞祖細(xì)胞分化受抑制[14]。豆甾醇可通過降低炎癥因子IL-1β和TNF-α水平，升高抗炎因子IL-10水平，以達(dá)到抗炎，減輕貧血的作用[12]。山柰酚可通過增加巨噬細(xì)胞數(shù)量，抑制脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的TNF-α和IL-1的表達(dá)，抑制TNF-α介導(dǎo)NF-κB p65向細(xì)胞核的易位，起到抗炎作用，進(jìn)而減輕貧血的作用[15]。β-谷甾醇在抗氧化方面的治療具有較大潛力，可顯著降低谷胱甘肽過氧化物酶和Mn超氧化物歧化酶活性，減緩紅細(xì)胞老化，從而起到減輕貧血的作用[16,17]。上述關(guān)鍵成分均可通過抑制炎癥反應(yīng)，發(fā)揮減輕貧血的作用。另有研究顯示，β-谷甾醇是一種植物固醇，可通過抑制促炎細(xì)胞因子、TNF-α的分泌，同時(shí)激活抗炎細(xì)胞因子，進(jìn)而發(fā)揮抑制EPO細(xì)胞凋亡，減輕腎性貧血發(fā)生的作用[16,18]。

從靶點(diǎn)角度考慮，IL-6、AKT1、TNF在PPI網(wǎng)絡(luò)中處于核心位置，可能是四物湯治療腎性貧血的核心作用靶點(diǎn)。四物湯中大多數(shù)活性成分作用于靶點(diǎn)IL-6。該成分可通過誘導(dǎo)肝素導(dǎo)致紅細(xì)胞生成中的鐵供應(yīng)減少，促進(jìn)腎性貧血的發(fā)展[19]。一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)研究得出IL-6導(dǎo)致貧血的機(jī)制或與肝素的激活、腎纖維化的加重、EPO軸的改變和紅細(xì)胞破壞的激活有關(guān)，并提出有必要對IL-6進(jìn)一步研究[20]。TNF是機(jī)體的另一重要炎性因子，當(dāng)其升高時(shí)亦可加重炎癥反應(yīng)，進(jìn)而促進(jìn)貧血的發(fā)生、發(fā)展[21]。CKD患者長期處于微炎癥狀態(tài)，分析可知，此狀態(tài)是貧血加重的原因之一。AKT是PI3K/AKT/m TOR信號通路的樞紐，此通路廣泛參與干細(xì)胞的代謝、生長、增殖和存活，與造血干細(xì)胞密切相關(guān)[22,23]。分子對接結(jié)果表明主要活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)結(jié)合較強(qiáng)，親和力較好，進(jìn)一步驗(yàn)證了此次研究的可靠性。

通過對GO功能富集分析和KEGG通路富集分析的結(jié)果可知，GO功能富集結(jié)果顯示四物湯治療腎性貧血的機(jī)制主要與刺激反應(yīng)、氧化應(yīng)激等生物過程有關(guān)。KEGG通路富集結(jié)果顯示四物湯治療腎性貧血的機(jī)制主要與調(diào)控脂質(zhì)和動脈粥樣硬化、AGE-RAGE等信號通路有關(guān)。脂質(zhì)和動脈粥樣硬化通路是慢性腎衰竭合并心血管風(fēng)險(xiǎn)的主要因素，心血管疾病可加快CKD進(jìn)展，進(jìn)而加重貧血，即脂質(zhì)和動脈粥樣硬化通路可間接導(dǎo)致貧血的發(fā)生[24]。AGERAGE信號通路可通過誘導(dǎo)腎小球硬化和間質(zhì)纖維化來加快CKD進(jìn)展，進(jìn)而增加貧血的發(fā)生率[25]。此外，炎癥是腎性貧血發(fā)生、發(fā)展的重要原因，AGE-RAGE信號通路與炎癥密切相關(guān)，四物湯中的有效成分可通過調(diào)控此通路激活的炎癥通道，抑制炎癥反應(yīng)，達(dá)到改善貧血的作用[26]。因此，推測四物湯通過調(diào)控脂質(zhì)和動脈粥樣硬化、AGE-RAGE等信號通路，作用于IL-6、AKT1、TNF等核心靶點(diǎn)而發(fā)揮治療腎性貧血的作用。

綜上，研究結(jié)果表明四物湯治療腎性貧血具有多成分、多靶點(diǎn)、多通路的特點(diǎn)。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，從分子水平初步探討四物湯治療腎性貧血的主要有效活性成分、關(guān)鍵靶點(diǎn)及信號通路，初步闡述四物湯治療腎性貧血的作用機(jī)制，為臨床治療腎性貧血提供理論依據(jù)，也為中藥復(fù)方治療腎性貧血提供新的方法和思路。本研究還存在一定的局限性，研究結(jié)果僅僅基于生物信息學(xué)與數(shù)據(jù)計(jì)算的結(jié)果，初步解釋四物湯治療腎形貧血的機(jī)制，并未進(jìn)行相關(guān)的動物、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)；其次，數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)尚不完善、更新周期較長。為了進(jìn)一步驗(yàn)證此結(jié)果，還需要大量的基礎(chǔ)研究。