丁鳳磊，張 樂，余 磊，王鶴鵑，張麗麗，李笑笑 ，宋 賀，董召榮

(1.安徽農業(yè)大學 農學院，合肥 230036；2.合肥豐樂種業(yè)股份有限公司，合肥 230088)

玉米是中國重要的糧食作物之一，2020 年中國玉米總產量達到2.61 億t，居于三大糧食首位[1-2]。氮素是玉米生長發(fā)育所必需的大量元素，在玉米生長發(fā)育和產量形成過程中起至關重要的作用[3-4]。中國玉米種植的當季氮肥施用量持續(xù)增長，從20 世紀70 年代的90 kg/hm2增加到21 世紀初的240 kg/hm2[5]。然而，中國玉米氮肥利用效率僅為26.1%，遠低于其他國家和地區(qū)[6]。玉米的氮肥利用效率與根系氮素吸收、植株氮素同化和植株氮素積累分配密切相關[7]。不同玉米品種氮素吸收受根系構型和空間分布影響，且具有基因型差異[8-9]。米國華等[10]認為：高氮吸收玉米品種的理想根系構型為根系下扎能力強，分布深，根系活力強；王敬鋒等[11]研究發(fā)現(xiàn)：高氮吸收效率玉米品種根系總量和深層根系多于氮低效品種，并且根系空間分布更合理。此外，玉米氮吸收能力還受土壤氮素轉化的影響，但目前關于不同玉米品種根區(qū)氮素轉化差異的研究較少。深入研究不同玉米品種根區(qū)土壤氮素轉化差異，明確關鍵影響因素，對提高玉米氮肥利用效率以及氮高效玉米品種選育具有重要意義。

土壤氮素轉化主要包括硝化過程和反硝化過程[12]。硝化過程是指NH3在好氧微生物的作用下氧化成，接著被氧化為的過程，其中第1 步的氨氧化過程被認為是限速步驟，由氨氧化細菌(ammonia-oxidizing bacteria，AOB)和氨氧化古菌(ammonia-oxidizing archaea，AOA)共同驅動[13-14]。前人研究表明：不同玉米品種的硝化過程存在一定差異[15]。SARR 等[16]研究發(fā)現(xiàn)：植株會通過影響AOA 和AOB 的豐度來影響硝化過程。硝化過程不僅受品種和氨氧化微生物的影響，還受土壤pH[17]、速效氮[18]、有機質[19]和溫度[20]等土壤理化性質的影響。反硝化過程是指在厭氧條件下微生物將硝酸鹽或亞硝酸鹽還原成N2O、NO和N2的過程，其中第2 步還原成NO 是首次將土壤中離子態(tài)氮轉化成氣態(tài)氮，該過程由nirS和nirK基因編碼的亞硝酸鹽還原酶催化，是反硝化過程的限速步驟[21]；第4 步N2O 還原為N2的過程由nosZ基因編碼的氧化亞氮還原酶催化完成。這兩步是土壤氮素損失的主要過程，也是目前人們關注的重點[22]。不同玉米品種之間反硝化過程也存在一定差異。前人研究表明：氮低效玉米品種T250 根際土壤norB/C和nosZ反硝化基因表達量高于氮高效玉米品種LO5[15]。盡管前人比較了不同玉米品種硝化或反硝化過程之間的差異，但由于硝化和反硝化之間相互影響，需要綜合研究才能更全面地理解玉米品種氮素轉化過程，然而，目前鮮有結合2 個過程的綜合研究。

玉米的氮素轉化還受土壤供氮量的影響，在不同含氮量下玉米對氮的需求存在一定差異，因此會反向影響土壤氮素轉化。本研究設置了傳統(tǒng)施氮處理和不施氮處理，比較不同玉米品種之間硝化和反硝化能力的差異，分析AOA 和AOB 以及nirK、nirS和nosZ型反硝化微生物的豐度差異，結合玉米氮素積累的分析，明確影響玉米氮利用的關鍵過程和主導因素，以期為闡明不同玉米品種氮素轉化差異特點、提高玉米氮肥利用效率和氮高效玉米品種選育提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗地點

試驗于2018 年5—7 月在安徽農業(yè)大學生物科技樓人工氣候室進行。試驗用土壤取自安徽農業(yè)大學農翠園(N32°52′，E117°14′)，土壤類型為黃褐土，基礎理化性質為：全氮含量1.26 g/kg，全磷含量0.48 g/kg，全鉀含量17.97 g/kg，有機質含量19.43 g/kg，有效磷含量11.41 g/kg，速效鉀含量184.61 mg/kg，pH 值為7.37。

1.2 試驗設計與樣品采集

在前期14 個玉米品種篩選試驗的基礎上，選取了具有代表性的4 個不同基因型玉米品種作為試驗材料，分別是：偉科702、隆平206、農華101 和先玉335。試驗設置2 個氮素水平：0 (CK)和220 kg/hm2(N)，每個處理3 次重復。根箱由PVC 管制成(直徑16 cm，高30 cm，單邊封口)，中間用20 μm 尼龍網分成3 個隔室以確保根系無法穿過，中間隔層土壤為根區(qū)土壤。磷肥(P2O5)和鉀肥(K2O)施用量分別為44.58 和46.88 mg/kg。氮、磷和鉀肥分別選用尿素、過磷酸鈣和氯化鉀。肥料與土壤摻混均勻后放入根箱內，在中間隔室播種2 粒玉米種子，到三葉期進行間苗，每個根箱保留1 株玉米苗。人工氣候室設置為：白天溫度30 ℃，持續(xù)16 h；夜間溫度20 ℃，持續(xù)8 h；相對濕度為70%。

在玉米生長第20 天，對根箱進行破壞性取樣。將玉米植株地上部分從根箱中取出，置于烘箱中105 ℃殺青30 min，85 ℃烘干至恒質量，稱量并記錄植株干質量。植株樣品粉碎過篩，用元素分析儀(Elementar Vario Micro Cube，德國)測定全氮含量。從中間隔層中取出土壤，去除玉米根系后過2 mm 篩。將土壤分為兩部分儲藏，一部分放在-80 ℃保存，用于硝化和反硝化功能基因豐度測定；另一部分土壤樣品放入4 ℃冰箱保存，用于室內培養(yǎng)試驗和土壤理化性質測定。

1.3 土壤理化性質測定

土壤pH 值由pH 計(ST3100，中國)測定，水土體積比為2.5∶1.0；稱取鮮土10 g，加入1 mol/L KCl 溶液50 mL，振蕩浸提30 min，過濾后使用化學分析儀(Cleverchem380plus，德國)測定土壤硝態(tài)氮和銨態(tài)氮含量；稱取鮮土10 g，用0.5 mol/L K2SO4溶液振蕩浸提30 min，過濾后采用有機碳分析儀(Analytik Jena，德國)測定土壤可溶性有機碳(DOC)。

1.4 硝化勢測定

采用懸浮液培養(yǎng)法[23]。稱取鮮土5 g 置于培養(yǎng)瓶中，加入硝化培養(yǎng)液(含1.5 mmol/L0.3 mmol/L KH2PO4和0.3 mmol/L K2HPO4) 50 mL，在恒溫振蕩器 (30 ℃，1 80 r/min) 中振蕩培養(yǎng)48 h，分別在培養(yǎng)后6、12、24、36 和48 h 取樣，共取樣5 次。取樣前搖勻，每次吸取混合液4 mL 離心后取上清液，用化學分析儀測定的含量。硝化勢用單位時間內的產生量表示。

1.5 反硝化能力測定

參照?IMEK 等[24]的標準方法。稱取2 份相當于10 g 干土的鮮土置于培養(yǎng)瓶中，再均勻加入42.9 mmol/L KNO3培養(yǎng)液5 mL，加鋁蓋密封；用真空泵抽真空，再用氦氣反復沖洗3 次。一組向瓶中加入乙炔10 mL，其N2O 氣體變化率為反硝化能力，代表單位時間內反硝化總量(N2O+N2)的產生率；另一組不作處理，N2O 氣體變化率代表反硝化過程N2O 排放率。平衡大氣壓后，將培養(yǎng)瓶置于恒溫培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)48 h，期間，分別在24 和48 h 時用注射器收集氣體5 mL，取樣后加入等量氦氣平衡大氣壓。采用氣相色譜儀(Agilent 7890A,美國)測定N2O 含量。

1.6 土壤微生物總DNA 提取和功能基因熒光定量分析

稱取土樣0.5 g，使用土壤DNA 提取試劑盒(Fast DNA Spin Kit For Soil，美國)提取土壤微生物總DNA，提取總量約為80 μL。AOB 和AOA功能基因amoA的豐度采用實時熒光定量PCR 系統(tǒng)(StrataGene Mx3005P，美國)測定，擴增引物分別選擇amoA1F/amoA2R和Arch-amoAF/ArchamoAR；反硝化菌功能基因nirK、nirS和nosZ的擴增引物分別選擇nirK1F/nirK5R、nirScd3aF/nir-SR3cd和nosZ1F/nosZ1R。質粒和標準曲線的制作按照王曉輝[25]的方法。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 23 進行方差分析和相關性分析；采用Heml 1.0 軟件制作熱圖；使用Canoco for Windows 軟件(版本4.5)進行冗余分析；采用Microsoft Excel 2019 作圖。

2 結果與分析

2.1 不同品種玉米根區(qū)土壤理化性質差異

由表1 可知：CK 處理下，WK702 和LP206根區(qū)土壤pH 值顯著低于NH101 和XY335，XY-335 根區(qū)土壤硝態(tài)氮含量為 30.40 mg/kg，顯著高于WK702 和LP206；施氮處理下，不同品種玉米根區(qū)土壤pH 值無顯著差異，WK702 根區(qū)土壤中含量最低，而NH101 最高；CK和施氮處理下，不同品種玉米根區(qū)土壤可溶性有機碳含量均無顯著差異，但銨態(tài)氮含量均呈LP-206＜WK702＜XY335＜NH101 的規(guī)律，且4 個品種間的差異達到顯著水平。

表1 不同玉米品種根區(qū)土壤理化性質差異Tab.1 Differences in soil physical and chemical properties in root zone of different maize varieties

2.2 不同品種玉米地上部氮素積累量差異

由圖1 可知：CK 處理下，WK702 和LP2-06 地上部氮素積累量分別比NH101 高24.6%和24.4% (P＜0.05)，分別比XY335 高21.4%和21.2%(P＞0.05)；施氮處理下，WK702 和LP206 地上部氮素積累量均顯著高于NH101 和XY335。

圖1 不同品種玉米地上部氮素積累量差異Fig.1 Differences in aboveground nitrogen accumulation of different maize varieties

2.3 不同品種玉米根區(qū)土壤硝化勢及氨氧化細菌和古菌豐度差異

由圖2 可知：CK 處理下，WK702 和LP206根區(qū)土壤硝化勢均顯著低于XY335，且分別較NH101 低35.5%和15.6%；施氮處理下，不同品種玉米根區(qū)土壤硝化勢無顯著差異。

圖2 不同品種玉米根區(qū)土壤硝化勢差異Fig.2 Difference of soil nitrification potential in root zone of different maize varieties

由圖3 可知：CK 處理下，WK702、LP206和XY335 根區(qū)土壤AOA-amoA拷貝數(shù)顯著低于NH101，而WK702、LP206 和XY335 之間無顯著差異；WK702 和LP206 根區(qū)土壤中AOB-amoA拷貝數(shù)顯著低于NH101，XY335 根區(qū)土壤AOBamoA拷貝數(shù)分別是WK702、LP206 和NH101 的2.4 倍、2.5 倍和1.5 倍；施氮處理下，XY335 和WK702 根區(qū)土壤AOA-amoA拷貝數(shù)顯著高于LP-206 和NH101，4 個品種的AOB-amoA拷貝數(shù)大小依次為XY335＞LP206＞NH101＞WK702，且差異達到顯著水平。

圖3 不同品種玉米根區(qū)土壤氨氧化古菌(AOA)和氨氧化細菌(AOB)豐度差異Fig.3 Differences in the abundance of ammonia-oxidizing archaea (AOA) and ammonia-oxdizing bacteria (AOB) in root zone of different maize varieties

2.4 不同玉米品種根區(qū)土壤反硝化能力和反硝化菌群豐度差異

由圖4 可知：CK 處理下，WK702 根區(qū)土壤反硝化能力顯著低于NH101 和XY335，且LP206分別比NH101 和XY335 低17.8%和19.5%；施氮處理下，WK702 和LP206 根區(qū)土壤反硝化能力均顯著低于NH101，且分別比XY335 低24.1%和29.5%。

圖4 不同玉米品種根區(qū)土壤反硝化能力差異Fig.4 Difference of soil denitrification ability in root zone of different maize varieties

由圖5 可知：CK 處理下，nirS基因拷貝數(shù)大小依次為WK702＜LP206＜NH101＜XY335，且4 個品種間差異達顯著水平；WK702、LP206 和NH101 根區(qū)土壤中nirK基因拷貝數(shù)均顯著低于XY335；WK702 和LP206 根區(qū)土壤中nosZ基因拷貝數(shù)均顯著低于NH101，且XY335 比NH101高2 倍；施氮處理下，WK702 和NH101 根區(qū)土壤中nirS基因拷貝數(shù)顯著低于LP206，且LP206顯著低于XY335；WK702 根區(qū)土壤nirK基因拷貝數(shù)顯著低于其他3 個玉米品種，LP206 和NH101顯著低于XY335；nosZ基因拷貝數(shù)大小依次為WK702＜LP206＜NH101＜XY335 的趨勢，且4 個品種間差異達到顯著水平。

圖5 不同品種玉米根區(qū)土壤nirS、nirK 和nosZ 豐度差異Fig.5 Differences in the abundance of nirS,nirK and nosZ in the root zone of different maize varieties

2.5 不同玉米品種根區(qū)土壤氨氧化微生物熱度分析

由圖6a 可知：不施氮條件下，AOA 的OTU1、OTU2 和OTU17 在WK702、LP206、NH101和XY335 的根區(qū)土壤中占優(yōu)勢地位，占比分別達到64.6%、65.8%、66.1%和64.6%；WK702和LP206 根區(qū)土壤中OTU11 和OTU19 的豐度高于NH101 和XY335；NH101 根區(qū)土壤中OTU4、OTU2 和OTU13 菌群占優(yōu)；XY335 根區(qū)土壤中OUT12 和OUT14 豐度低于其他3 個品種。由圖6b 可知：WK702、LP206、NH101 和XY335根區(qū)土壤中均以OTU1 為優(yōu)勢菌群，分別占總OUT 豐度的65.7%、72.9%、67.8%和64.1%；WK702 根區(qū)土壤中OTU6、OTU14、OTU16、OTU21、OTU22 和OTU24 菌群占優(yōu)勢地位；LP-206 根區(qū)土壤中OTU4、OTU6、OTU10、OTU-16、OTU19 和OTU25 的豐度低于其他3 個品種；NH101 根區(qū)土壤中OTU25 和OTU23 菌群占優(yōu)勢；NH101 和XY335 的OTU3、OTU9、OTU15和OTU17 菌群豐度高于WK702 和LP206。

圖6 CK 處理不同品種玉米根區(qū)土壤AOA (a)和AOB (b)熱圖Fig.6 Heat map of soil AOA (a) and AOB (b) in the root zone of different maize varieties treated with CK

2.6 不同品種玉米根區(qū)土壤AOA 和AOB 群落與環(huán)境因子冗余分析

由圖7 可知：對AOA 而言，二維分析解釋了36.2%的群落環(huán)境關系累積方差，AOA 群落結構與含量極顯著負相關(P＜0.01)、與含量顯著負相關(P＜0.05)；對AOB 而言，二維分析解釋了32.9%的群落環(huán)境關系累積方差，AOB 群落結構與根區(qū)土壤pH 值呈顯著正相關(P＜0.05)。LP206、NH101 和XY335 的AOA 和AOB 群落結構存在顯著差異。

圖7 CK 處理不同品種玉米根區(qū)土壤AOA (a)和AOB (b)群落與環(huán)境因子的冗余分析Fig.7 Redundancy analysis of soil AOA (a) and AOB (b) community and environmental factors in the root zone of different maize varieties treated with CK

2.7 不同品種玉米各因子間相關性分析

CK 處理下，不同品種玉米地上部氮素積累量與根區(qū)土壤硝化勢(r=-0.608)和反硝化能力(r=-0.658)呈顯著負相關(P＜0.05)；土壤硝化勢與AOB-amoA基因拷貝數(shù)(r=0.723，P＜0.01)呈極顯著正相關，反硝化作用與nirS基因拷貝數(shù)(r=0.689，P＜0.05)呈顯著正相關；根區(qū)土壤pH 與AOB-amoA(r=0.837)和nirS基因拷貝數(shù)(r=0.816)呈極顯著正相關(P＜0.01)，與nirK(r=0.673)和nosZ基因拷貝數(shù)(r=0.701)呈顯著正相關(P＜0.05)；含量與AOB-amoA(r=0.789)、n irS(r=0.772)和nosZ基因拷貝數(shù)(r=0.740)呈極顯著正相關(P＜0.01)，與nirK基因拷貝數(shù)(r=0.678，P＜0.05)呈顯著正相關；含量與AOA-amoA基因拷貝數(shù)(r=0.901，P＜0.01)呈極顯著正相關。

施氮處理下，不同品種玉米地上部氮素積累量與土壤反硝化能力(r=-0.734)和nosZ基因拷貝數(shù)(r=-0.726)呈極顯著負相關(P＜0.01)；nosZ基因拷貝數(shù)與土壤pH (r=0.665)、(r=0.630)和含量(r=0.612)呈顯著正相關(P＜0.05)；含量與反硝化能力(r=0.676，P＜0.05)呈顯著正相關。

3 討論

3.1 不同品種玉米的氮素積累能力差異

前人研究發(fā)現(xiàn)：不同基因型玉米的氮素吸收速率和氮素吸收能力存在一定差異[26-27]，而玉米植株在一定時期氮素的積累量從某種意義上反映了玉米的氮素吸收率和吸收能力。本研究中，無論是否施氮，WK702 和LP206 地上部氮素積累量均高于NH101 和XY335，說明WK702 和LP-206 的氮素吸收效率高于NH101 和XY335。玉米的氮素積累量反映了植株對氮素的吸收和同化能力[28]，此外，有研究指出：硝化和反硝化會顯著影響玉米根系對氮素的吸收[29]。本研究相關性分析發(fā)現(xiàn)：地上部氮素積累量與根區(qū)土壤硝化和反硝化呈顯著負相關，說明不施氮處理下高氮吸收效率品種根區(qū)土壤硝化勢和反硝化能力低，土壤氮素損失少，植株吸收的氮素多，地上部氮素積累量高；而在施氮處理下，地上部氮素積累量僅與根區(qū)土壤反硝化能力呈極顯著負相關，推測土壤氮素充足的情況下，氮素損失主要以反硝化為主。因此，在高氮吸收效率品種選育過程中需重視根區(qū)氮素的反硝化損失。

3.2 不同品種玉米的硝化過程差異

硝化作用是土壤氮素循環(huán)的重要組成部分，與植物生長所需氮的有效性和氮素利用效率密切相關[30-31]。本研究分析了不同品種玉米在不同氮素水平下的根區(qū)土壤硝化過程差異。CK 處理下，WK702 和LP206 根區(qū)土壤硝化勢和AOB 豐度均低于NH10；施氮處理下，4 個玉米品種硝化勢無顯著差異。AOA 和AOB 是驅動土壤硝化作用的關鍵微生物[32]。前人研究發(fā)現(xiàn)：在許多生態(tài)環(huán)境下，AOA 數(shù)量均高于AOB[33-34]，AOA 也在農業(yè)土壤氨氧化過程中發(fā)揮著重要作用[35]。本研究中，CK 處理各品種根區(qū)土壤中AOA 豐度均高于AOB，這與AOA 適宜在營養(yǎng)貧瘠的低氮環(huán)境中生存的特性[36-37]相符。相關性分析發(fā)現(xiàn)：土壤硝化勢僅與AOB 豐度呈極顯著正相關，而與AOA 無相關性，說明AOB 在硝化過程中的作用更加重要。此外，AOB 豐度與根區(qū)土壤含量呈極顯著正相關。在低pH 或低氮環(huán)境下，植物會產生一類抑制硝化作用的物質——生物硝化抑制劑[38-39]，這種物質會通過抑制AOA 和AOB 豐度達到減弱硝化作用的目的[40]。本研究中，WK702 和LP206 根區(qū)土壤pH 和含量低于NH101 和XY335，可能會誘導玉米根系分泌某種生物硝化抑制劑，抑制AOB 豐度，這種物質具有減少土壤氮素損失的潛力，是未來研究的方向。不同品種玉米不僅會影響土壤氮循環(huán)微生物豐度，還會影響微生物的群落結構[15]。熱圖分析發(fā)現(xiàn)：CK 處理下各品種玉米AOB 群落結構差異較大，NH101 和XY335的OTU3、OTU9、OTU15 和OTU17 菌群豐度高于WK702 和LP206，推測這些菌群可能與不同品種的硝化作用差異有關；AOB 的OUT1 菌群占比最高，該菌群可能也與硝化作用密切相關。冗余分析發(fā)現(xiàn)：土壤pH是影響AOB 群落結構的重要因素，而AOA 群落結構與土壤含量密切相關。本研究發(fā)現(xiàn)：低氮土壤中，含量與AOA 菌群結構呈極顯著負相關，而AOA 的結構反映了其優(yōu)勢種群的相對豐度。本研究顯示：低氮環(huán)境中，含量可顯著影響AOA 菌群中某種優(yōu)勢種群的相對豐度，如土壤含量從1.68 mg/kg 上升到2.77 mg/kg 時，OTU1 相對豐度從27.5%降低到23.4%，與VERHAMME 等[41]的研究結果類似。值得注意的是，低氮土壤中與AOA 豐度呈極顯著正相關，說明土壤提供了更多的，為AOA 的生長提供了更多的能源和底物，促進了AOA 豐度的提高[42]。可見，低氮土壤中，含量會改變AOA 菌群結構，也會顯著提高AOA的豐度，進而影響根區(qū)土壤氮素的轉化。

3.3 不同品種玉米的反硝化過程差異

前人研究發(fā)現(xiàn)：不同玉米品種土壤反硝化過程存在顯著差異[43]。本研究CK 處理中，不同品種玉米根區(qū)土壤反硝化能力存在一定差異，WK-702 根區(qū)土壤反硝化能力顯著低于NH101 和XY-335，說明WK702 通過反硝化損失的土壤氮素較NH101 和XY335 少。反硝化作用由反硝化微生物驅動，其豐度變化會對反硝化作用產生一定的影響[43]。CK 處理下，各品種根區(qū)土壤中nirS、nirK和nosZ基因拷貝數(shù)均表現(xiàn)為WK702＜LP2-06＜NH101＜XY335，且nirS基因拷貝數(shù)比nirK和nosZ基因低1～2 個數(shù)量級。nirS型反硝化菌適宜生活在有機質和營養(yǎng)元素豐富的環(huán)境中[44]，而CK 處理根區(qū)土壤營養(yǎng)貧瘠，這可能是導致nirS基因拷貝數(shù)低的原因。相關性分析顯示：根區(qū)土壤反硝化能力僅與nirS基因拷貝數(shù)呈顯著正相關，說明nirS型反硝化菌雖然數(shù)量少，但在反硝化過程中起著至關重要的作用。前人研究發(fā)現(xiàn)：土壤理化性質會顯著影響反硝化菌豐度[45]。本研究發(fā)現(xiàn)：pH 和含量顯著影響nirS、nirK和nosZ基因拷貝數(shù)，且不同品種玉米根區(qū)土壤pH和含量存在差異，但彭鈺潔等[46]研究表明：在85%常規(guī)施氮量下，玉米根系分泌物中蘋果酸水平顯著上升，說明不同品種玉米根區(qū)土壤反硝化微生物豐度出現(xiàn)差異可能與根系分泌的有機酸不同有關。作為反硝化作用的底物，其含量也會對反硝化微生物豐度產生影響。

4 結論

CK 處理下，WK702 和LP206 地上部氮素積累量高的原因在于硝化和反硝化造成的氮素損失量少；AOB 在硝化過程中發(fā)揮重要作用，其豐度變化與根區(qū)土壤pH 和含量有關；土壤含量是影響AOA 群落結構的重要因素；pH 和含量差異也是造成土壤nirS、nirK和nosZ基因拷貝數(shù)變化的主導因子。施氮處理下，WK702 和LP206 反硝化損失的氮素較少是導致其地上部氮素積累量高的主要原因；減少氮素反硝化損失是提高玉米氮素積累的重要途徑。在未來選育高氮吸收效率玉米品種時，要注重在低氮條件下篩選。