張新洛，彭勁諭，王玉昌，王大瑋

(1.西南林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，云南 昆明 650224；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，北京 100000)

隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的快速發(fā)展，利用分子遺傳改良技術(shù)對(duì)云南栘的種質(zhì)資源進(jìn)行保護(hù)與利用是必然趨勢(shì)，而高質(zhì)量的DNA 提取是從分子遺傳水平研究云南栘的前提。近年來，植物總DNA 提取的主要方法有CTAB 法[11]、SDS 法[12]、高鹽法[13]以及各品牌試劑盒法[13]，但不同物種的提取方法有所不同。云南栘組織細(xì)胞中含有大量的多酚和多糖等次生代謝產(chǎn)物[14-15]，多糖易與DNA 結(jié)合形成膠狀物質(zhì)，多酚易與DNA 產(chǎn)生不可逆的結(jié)合，極易氧化褐變，嚴(yán)重影響了總DNA的提取[16-17]。SSR 標(biāo)記是以PCR 為基礎(chǔ)的一種分子標(biāo)記技術(shù)，該技術(shù)具有數(shù)量豐富、檢測(cè)簡(jiǎn)便、多態(tài)性強(qiáng)、重復(fù)性高和共顯性遺傳等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于果樹育種研究[18-22]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.2 DNA 提取方法

CTAB 法參照劉鈺嬌等[11]的研究；SDS 法參照侯澤菁等[12]的研究；MAGEN 試劑盒法(MAGEN HiPure SF Plant DNA Kit)和磁珠試劑盒法(Wolact?Magnetic beads Plant DNA Purification Kit)按照試劑盒說明書操作；尿素法和改良尿素法均參考李軍等[23]的研究，并在裂解液中添加PVP (2%)和NaAC (1.4 mol/L)。

1.3 DNA 質(zhì)量檢測(cè)

1.3.1 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)

1.3.2 超微量分光光度計(jì)檢測(cè)

用移液槍吸取DNA 1 μL，使用超微量分光光度計(jì)(Thermo NanoDrop2000)檢測(cè)其質(zhì)量濃度并查看260 和280 nm 的吸光度值A(chǔ)260和A280；利用SPSS 23.0 對(duì)6 種方法提取的云南栘葉片總DNA 質(zhì)量濃度、純度和試驗(yàn)時(shí)間等數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和多重比較。

1.4 SSR-PCR 反應(yīng)體系建立

引物來自PENG 等[24]的研究。從18 對(duì)SSR 引物中隨機(jī)選出引物TRINITY-244 (F：5′-CTCGATCGCTTCTCTTCTATT-3′，R：5′-ATACGACCGACAGGGAAT-3′)，退火溫度為58 ℃，用于優(yōu)化后體系擴(kuò)增的穩(wěn)定性驗(yàn)證。引物由Sangon 生物工程技術(shù)公司(中國(guó)上海)合成。

在25 μL 的SSR 反應(yīng)體系中，通過設(shè)立5 因素4 水平正交試驗(yàn)(表1)，觀察不同模板DNA 質(zhì)量(30、60、90 和120 ng)、TaqDNA 聚合酶含量(0.2、0.3、0.4 和0.5 U)、引物濃度(0.50、0.75、1.00 和1.25 μmol/L)、dNTPs 濃度(1.0、1.5、2.0和2.5 mmol/L)以及Mg2+濃度(0.5、1.0、1.5 和2.0 mmol/L)對(duì)擴(kuò)增效果的影響，試驗(yàn)設(shè)3 次重復(fù)。

表1 SSR 反應(yīng)條件正交組合Tab.1 Orthogonal combination of SSR reaction conditions

1.4.1 PCR 反應(yīng)程序及產(chǎn)物檢測(cè)

PCR 擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性45 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共30 個(gè)循環(huán)，72 ℃后延伸10 min，PCR 產(chǎn)物于4 ℃保存[25]。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物使用6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)。

1.4.2 SSR-PCR 反應(yīng)體系驗(yàn)證

采用優(yōu)化構(gòu)建的SSR-PCR 反應(yīng)體系對(duì)來自不同居群的30 個(gè)云南栘個(gè)體(表2)進(jìn)行驗(yàn)證，檢測(cè)擴(kuò)增得到的產(chǎn)物，檢測(cè)方法同1.4.1 節(jié)。

表2 云南栘采樣地地理信息Tab.2 Geographic information of Docynia delavayi sampling sites

表2 云南栘采樣地地理信息Tab.2 Geographic information of Docynia delavayi sampling sites

2 結(jié)果與分析

2.1 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果

由圖1 可知：6 種DNA 的提取方法中，只有改良尿素法提取的DNA 質(zhì)量最好，條帶單一、完整、無污染；使用尿素法、磁珠試劑盒法和CTAB 法提取的DNA，雖然能看到條帶，但條帶不清晰、不明亮，存在一定程度的彌散現(xiàn)象，點(diǎn)樣孔殘留有一定的雜質(zhì)且存在降解現(xiàn)象；使用MAGEN 試劑盒法及SDS 法提取的DNA 較差。

圖1 6 種方法提取的DNA 電泳圖Fig.1 Electrophoretogram of DNA extracted by six methods

2.2 超微量分光光度計(jì)檢測(cè)結(jié)果

表3 6 種方法提取總DNA 的質(zhì)量濃度、純度與試驗(yàn)時(shí)間Tab.3 Mass concentration,purity and experimental time of total DNA extracted by six methods

2.3 SSR-PCR 擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果

由圖2 可知：16 個(gè)組合的擴(kuò)增結(jié)果有明顯差異。所有組合中，除組合7 和12 未擴(kuò)增出條帶外，其余組合均能有效擴(kuò)增；在能有效擴(kuò)增的組合中，組合3、4、5、6、11、15 和16 的條帶明顯優(yōu)于其他組合；再次檢測(cè)這7 個(gè)組合發(fā)現(xiàn)：組合4的條帶清晰、雜帶少、穩(wěn)定性高，因此將組合4 選為最佳組合，即在25 μL 的PCR 體系中，含模板DNA 30 ng，dNTPs 2.5 mmol/L，Mg2+2.0 mmol/L，TaqDNA 聚合酶0.5 U，引物1.25 μmol/L。

圖2 正交試驗(yàn)PCR-SSR 反應(yīng)體系的擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 Amplification results of PCR-SSR reaction system by orthogonal experiment

2.4 SSR-PCR 最佳反應(yīng)體系驗(yàn)證

由圖3 可知：優(yōu)化的SSR-PCR 反應(yīng)體系對(duì)30 個(gè)云南栘個(gè)體的擴(kuò)增條帶均清晰無拖帶現(xiàn)象，多態(tài)性強(qiáng)，同時(shí)具有較好的穩(wěn)定性和重復(fù)性，可以應(yīng)用于云南栘的遺傳多樣性研究。

圖3 SSR-PCR 優(yōu)化反應(yīng)體系對(duì)30 個(gè)云南栘樣本的擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 Amplification results of SSR-PCR optimization reaction on 30 samples of Docynia delavayi

3 討論

高質(zhì)量DNA 是進(jìn)一步開展遺傳多樣性分析等研究的重要基礎(chǔ)[26]。本研究采用6 種方法對(duì)云南栘DNA 進(jìn)行提取，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示：尿素法、磁珠試劑盒法和CTAB 法所提取的云南栘DNA 條帶不明顯，DNA 質(zhì)量不高，推測(cè)原因是這3 種方法不能有效去除葉片中糖類、蛋白質(zhì)和酚類物質(zhì)[27-28]；MAGEN 試劑盒法和SDS 法凝膠電泳結(jié)果顯示無條帶，表明無法有效提取DNA，推測(cè)原因可能是試驗(yàn)時(shí)間太短導(dǎo)致沒有有效提取DNA[29]；采用改良尿素法對(duì)云南栘葉片DNA 提取的效果最為明顯，其原因是該方法不僅可以有效阻止細(xì)胞中多酚和多糖類等物質(zhì)與DNA 結(jié)合[30]，而且能使DNA 更充分地溶解在溶液中[31]，提高DNA 的提取質(zhì)量。這與同科植物梨(Pyrus)的DNA 最優(yōu)提取方法不同[32]，說明同科不同物種因其所含化學(xué)成分不同可導(dǎo)致DNA 的提取方法有差異。此外，改良尿素法提取的DNA 符合后續(xù)SSR-PCR 反應(yīng)體系的要求，為后續(xù)分子試驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。

建立穩(wěn)定的SSR-PCR 反應(yīng)體系是進(jìn)行遺傳圖譜構(gòu)建及多樣性分析、親緣關(guān)系鑒定、種質(zhì)資源保護(hù)及利用的重要基礎(chǔ)[33-37]。本研究采用正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)建立SSR-PCR 反應(yīng)體系，與其他利用單因素試驗(yàn)所建立的反應(yīng)體系[38]有一定差異。與傳統(tǒng)的單因素試驗(yàn)相比，正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)不僅能夠分析各影響因子之間的作用[39]，而且能夠解決單因素試驗(yàn)過程中持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)和過程繁瑣的問題[40]，該方法不僅具有省時(shí)、省力和省物等優(yōu)點(diǎn)，而且能夠篩選最優(yōu)組合，提高試驗(yàn)效率[41]。本研究采用L16(45)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)建立云南栘SSR-PCR 反應(yīng)體系，與蘋果[42]、山梨[43]和樹莓[44]的SSR 反應(yīng)體系有所差異，說明不同物種的最優(yōu)SSR 體系有所不同。SSR-PCR 擴(kuò)增出的條帶是多種影響因子多重交叉作用的結(jié)果[45]，不同物種SSR 反應(yīng)體系差異很大。SSR-PCR 反應(yīng)體系受到模板DNA、Mg2+、引物、TaqDNA 聚合酶和dNTPs 的影響[46]，因此使用適合的方法確定各個(gè)影響因素的最佳濃度和用量是云南栘SSR 體系優(yōu)化的關(guān)鍵[47]。

4 結(jié)論