王 浩，孫 亮，張濟(jì)民，賈文杰，吳雅文，張小平，李 想，王有國(guó)

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 園林園藝學(xué)院，云南 昆明 650201；2.金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院 農(nóng)學(xué)院，浙江 金華 321017；3.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 花卉研究所，云南 昆明 650205)

百合(Liliumspp.)是百合科(Liliaceae)百合屬(Lilium)多年生草本球根植物，是世界上重要的觀賞花卉之一。百合品種西伯利亞(Lilium oriental‘Siberia’)屬于東方百合雜種系，是百合中的名優(yōu)品種，由于其花色豐富、氣味芳香而深受消費(fèi)者喜愛，在近幾年的國(guó)際和國(guó)內(nèi)花卉市場(chǎng)中十分暢銷，在切花生產(chǎn)中的地位也越來越重要[1]。然而，百合鱗莖具有休眠的特性，解除休眠的時(shí)間太長(zhǎng)或休眠解除不徹底會(huì)嚴(yán)重影響百合切花質(zhì)量，造成品質(zhì)差和產(chǎn)量低等問題，從而嚴(yán)重影響百合切花的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[2]。因此，研究百合鱗莖休眠機(jī)理并挖掘與篩選百合休眠相關(guān)基因至關(guān)重要。

AP2/ERF 轉(zhuǎn)錄因子是一種具有多種生物功能的基因家族，它包含1 個(gè)有60～70 個(gè)氨基酸的保守AP2/ERF DNA 結(jié)合區(qū)[3]。根據(jù)組成AP2/ERF 保守結(jié)構(gòu)域數(shù)量和序列的差異，AP2/ERF 基因家族被劃分為4 個(gè)亞家族，包括AP2、CBF/EREB、RAV和ERF 亞家族[4]。作為AP2/ERF 轉(zhuǎn)錄因子家族的成員之一，乙烯響應(yīng)因子(ethylene response factors，ERFs)擁有1 個(gè)典型的AP2/ERF 結(jié)構(gòu)域。根據(jù)ERF基因的DNA 結(jié)合區(qū)和順式反應(yīng)單元的特異性，ERF 轉(zhuǎn)錄因子的家族成員被分為2 種不同的類別，第1 種可以與GCC-box (AGC-CGCC)結(jié)合調(diào)控下游基因的表達(dá)；第2 種與DRE/CRT 順式作用元件結(jié)合，在誘導(dǎo)逆境(干旱、鹽堿和冷害等)基因表達(dá)過程中起重要作用[5]。

ERF 轉(zhuǎn)錄因子已被證明在植物生命周期中發(fā)揮著多種作用，是若干生物學(xué)過程的關(guān)鍵調(diào)節(jié)者，包括植物發(fā)育[6]、植物初級(jí)和次級(jí)代謝物調(diào)節(jié)[7]以及生物和非生物脅迫響應(yīng)[8]等。另有研究指出：ERF 類轉(zhuǎn)錄因子還與植物的休眠解除密切相關(guān)。如：馮丹等[9]通過克隆從馬鈴薯(Solanum tuberosumL.)塊莖中獲得1 個(gè)馬鈴薯ERF5基因，結(jié)合實(shí)時(shí)熒光定量的結(jié)果認(rèn)為該基因在打破馬鈴薯的塊莖休眠以及塊莖芽的生長(zhǎng)過程中發(fā)揮調(diào)控作用；在牡丹(Paeonia sufiuticosaAndr.)花芽的休眠解除過程中，PsERE11基因通過調(diào)控相關(guān)內(nèi)源激素的合成對(duì)牡丹花芽休眠解除起作用[10]；JIMENEZ 等[11]研究發(fā)現(xiàn)：用乙烯利處理歐洲水青岡(Fagus sylvaticaL.)的種子，或在有限的含水量下通過潮濕的預(yù)冷卻處理打破休眠時(shí)，F(xiàn)sERF1基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著增加，種子的休眠被打破、開始萌發(fā)；王月[12]研究認(rèn)為：PpCERF1基因在中國(guó)櫻桃[Prunus pseudocerasus(Lindl.) G.Don]休眠解除過程中起關(guān)鍵作用，PpcERF1可能是通過調(diào)控CYP 和JA 類基因表達(dá)而發(fā)揮促進(jìn)休眠解除的作用；此外，還有研究發(fā)現(xiàn)桃(Prunus persicaL.)PpeERF3b[13]以及楊樹(Populus simoniivar.przewalskii(Maxim.) H.L.Yang]EBB1基因[14]也與種子萌發(fā)相關(guān)。

目前，通過克隆和實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)技術(shù)，ERF 類轉(zhuǎn)錄因子在大量物種中得到了研究，如：擬南芥(Arabidopsis thalianaL.)[15]、水稻(Oryza sativaL.)[16]、煙草(Nicotiana tabacumL.)[17]和玉米(Zea maysL.)[18]等，但這些研究重點(diǎn)關(guān)注了模式植物，在百合中的研究相對(duì)較少。本研究通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)獲得了百合品種西伯利亞小鱗莖休眠解除過程中的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，篩選和克隆參與小鱗莖休眠解除的AP2/ERF 基因LoERF4，并對(duì)該基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析和表達(dá)分析，旨在為探析百合ERF基因?qū)Π俸削[莖休眠解除的調(diào)節(jié)機(jī)制研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗(yàn)所用材料為百合品種西伯利亞的小鱗莖。西伯利亞開花種球于2021 年1 月6 日購(gòu)自云南沃德園藝有限公司，在28 ℃恒溫條件下包埋平均圍徑(12～14 cm)的中、外層鱗片，培養(yǎng)45 d 繁殖獲得小鱗莖。將小鱗莖用濕度為70%的椰糠基質(zhì)包裹，放置在(4±1) ℃的低溫環(huán)境中冷藏處理70 d，冷處理結(jié)束后取出并將其根部切取1～2 cm，水洗后晾干備用。

1.2 方法

1.2.1 乙烯對(duì)百合小鱗莖休眠解除的影響

選擇60 個(gè)大小一致、鮮質(zhì)量約為0.4 g 的供試小鱗莖隨機(jī)分成2 組，每組30 個(gè)(含3 次重復(fù))，一組小鱗莖用蒸餾水(CK)浸泡處理2 h，另一組小鱗莖用100 μmol/L 的乙烯溶液處理2 h (該濃度是實(shí)驗(yàn)室在前期試驗(yàn)中篩選出的最佳處理濃度)。處理完畢后用吸水紙吸干，將小鱗莖接種到以瓊脂作為基質(zhì)的玻璃瓶中，每瓶接種5 個(gè)小鱗莖；后將其置入恒溫箱中 28 ℃黑暗培養(yǎng)30 d，每天觀察小鱗莖萌發(fā)狀態(tài)，以小鱗莖培養(yǎng)至長(zhǎng)出鱗片葉并突破頂端0.5 cm 即認(rèn)為萌發(fā)，記錄各處理組小鱗莖開始萌發(fā)的時(shí)間；同時(shí)在培養(yǎng)后的0、10、20 和30 d 對(duì)小鱗莖進(jìn)行取樣，用液氮迅速冷凍處理后存儲(chǔ)在-80 ℃的低溫冰箱中，0 和30 d 的材料用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。每個(gè)樣品3 次生物學(xué)重復(fù)。

1.2.2 百合小鱗莖總RNA 及cDNA 的反轉(zhuǎn)錄

采用改良的CTAB 法[19]提取待測(cè)百合小鱗莖的總RNA，然后按照iScriptTMgDNA Clear cDNA Synthesis Kit 試劑盒說明書，冰上配制16 μL 去gDNA 體系，25 ℃孵育5 min，75 ℃孵育5 min，去除gDNA。冰上配制20 μL 反轉(zhuǎn)錄體系，25 ℃孵育5 min，46 ℃孵育20 min，95 ℃變性1 min，冰上冷卻，立即用于qPCR 檢測(cè)。然后將cDNA置于-20 ℃冰箱內(nèi)中保存待用。

1.2.3LoERF4基因全長(zhǎng)序列克隆

本研究前期的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)由北京百邁客生物科技有限公司通過邊合成邊測(cè)序(sequencing by synthesis，SBS)技術(shù)獲得，在這些數(shù)據(jù)中篩選得到LoERF4基因的序列，以cDNA 為模板，在該基因序列兩端分別設(shè)計(jì)帶有酶切位點(diǎn)(BsaI 與Eco32 I 雙酶切處理)的引物，由武漢伯遠(yuǎn)生物科技有限公司合成正、反向引物(表1)。經(jīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增PCR，然后克隆LoERF4基因的全長(zhǎng)片段。PCR 總反應(yīng)體系為50 μL，包括cDNA 模版1 μL，正、反向引物各2 μL，dNTP 25 μL，去離子水20 μL。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5min，94 ℃變性30 s，50 ℃退火45 s，72 ℃延伸36 s，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，16 ℃保持30 min，停止反應(yīng)。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳在5 v/cm 電壓條件下電泳20 min，在紫外燈下切取電泳片段，使用Axygen AxyPrepTMMag PCR 純化試劑盒進(jìn)行溶膠回收和純化，檢測(cè)無誤后將PCR 產(chǎn)物連接至pBWA(V)HS 載體，再轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞top10 上。菌落PCR 篩選陽性克隆，送至武漢伯遠(yuǎn)生物科技有限公司測(cè)序。

1.2.4LoERF4的實(shí)時(shí)熒光定量PCR 表達(dá)分析

以1.2.2 節(jié)反轉(zhuǎn)錄待用的各處理cDNA 為材料，以Actin基因?yàn)閮?nèi)參基因，通過qRT-PCR 分析各處理下LoERF4基因在小鱗莖中的表達(dá)情況。參照bimake 生產(chǎn)的2× SYBR Green qPCR Master Mix 試劑盒的操作說明書進(jìn)行熒光定量PCR 分析，引物序列見表1。qRT-PCR 反應(yīng)體系為20 μL，包括SYBR Green qPCR Master Mix (2×)10 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 7 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性15 s；60 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s，40 個(gè)循環(huán)。溶解曲線制作程序?yàn)椋?5 ℃ 15 s，60 ℃60 s，95 ℃ 15 s。每個(gè)樣品均設(shè)3 個(gè)重復(fù)。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

采用2-ΔΔCt計(jì)算相對(duì)表達(dá)量；采用SPSS 軟件中的one-way ANOVA 進(jìn)行方差分析，并用Turkey test 分析不同樣品間的顯著性；采用Origin 2018 制圖。

1.2.5 生物信息分析

利用ORF finder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)分析基因開放閱讀框(open reading frame，ORF)；利用BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)進(jìn)行序列比對(duì)和同源序列搜索；利用ProtParam (http://web.expasy.org/protparam/) 分析蛋白質(zhì)的物理和化學(xué)性質(zhì)；利用ProtScale (http://www.expasy.org/cgi-bin/protscale.pl) 分析蛋白質(zhì)的親水性和疏水性；利用TMHMM Server v.2.0 (https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0) 解析蛋白跨膜區(qū)域；利用SignalP3.0 Server(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-3.0) 分析蛋白質(zhì)信號(hào)肽；利用WoLF PSORT(https://wolfpsort.hgc.jp/) 分析蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位方式；利用NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi) 分析蛋白質(zhì)的保守結(jié)構(gòu)域；利用Expasy (htps://www.expasy.org/) 分析蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)；利用 SWISS-MODEL (https://www.swissmodel.expasy.org/) 分析蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)。

采用DNAman 軟件將LoERF4 氨基酸序列與NCBI 基因數(shù)據(jù)庫中陸地棉(Gossypium hirsutum，XP_016753339.1)、茶樹(Camellia sinensis，XP_028108250.1)、葡萄(Vitis vinifera，CBI30599.3)、圓錐南芥(Arabis alpina，KFK31657.1)、獼猴桃(Actinidia deliciosa，ADJ67436.1)、煙草(Nicotiana tabacum，NP_001312182.1)、雜交百合(Liliumhybrid division I，QYI40124.2)和冬瓜(Benincasa hispida，XP_038883348.1)的ERF 氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)；利用MAGA 7.0 中的鄰近法(neighbor-joining)對(duì)具有高相似度的氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建，校驗(yàn)參數(shù)步長(zhǎng)(bootstrap)設(shè)置為1 000 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 LoERF4 基因克隆及測(cè)序結(jié)果

以百合品種西伯利亞小鱗莖cDNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，其產(chǎn)物在500～750 bp 間有1 條清晰的條帶(圖1)；切膠回收后的測(cè)序結(jié)果顯示其全長(zhǎng)為606 bp，共編碼201 個(gè)氨基酸(圖2)。

圖1 LoERF4 的PCR 產(chǎn)物Fig.1 PCR products of LoERF4

圖2 LoERF4 基因序列及其編碼的氨基酸Fig.2 LoERF4 gene sequence and its encoded amino acid

2.2 LoERF4 基因所編碼蛋白的理化性質(zhì)預(yù)測(cè)

LoERF4 蛋白氨基酸的區(qū)間含有1 個(gè)典型的保守AP2 結(jié)構(gòu)域，證實(shí)LoERF4 蛋白屬于AP2/ERF家族成員蛋白。

ProtParam 分析結(jié)果顯示：LoERF4 蛋白的相對(duì)分子量約為21.52 ku，理論等電點(diǎn)為6.43，分子式為C950H468N268O301S2，共含有2 989 個(gè)原子。該蛋白由20 種不同的氨基酸組成，以丙氨酸的含量最高，占總量的12.9%；胱氨酸、蛋氨酸和色氨酸的含量最低，分別占總量的0.5%。LoERF4蛋白有24 個(gè)帶負(fù)電荷的殘基(Asp+Glu)和23 個(gè)帶正電荷的殘基(Arg+Lys)，不穩(wěn)定系數(shù)為53.72，表明該蛋白屬于不穩(wěn)定蛋白；脂肪系數(shù)為61.79；總的平均親水性系數(shù)為-0.418。

ProtScale 分析結(jié)果(圖3)顯示：LoERF4 蛋白在氨基酸第86 位分?jǐn)?shù)最低(-2.944)，擁有的親水性質(zhì)最強(qiáng)，分?jǐn)?shù)小于0 的位點(diǎn)多位于第5～8、16～49、52～61、66～75、81～112、130～138 和155～172 位；在第118 位分?jǐn)?shù)最高(1.411)，擁有的疏水性質(zhì)最強(qiáng)，分?jǐn)?shù)大于0 的位點(diǎn)主要定位在第9～15、76～80、113～129、141～150、175～181、186～190 和192～196 位。因此，推測(cè)該蛋白是不穩(wěn)定的親水性蛋白。

圖3 LoERF4 蛋白的疏水性預(yù)測(cè)Fig.3 Hydrophobicity prediction of LoERF4 protein

2.3 LoERF4 蛋白跨膜區(qū)和亞細(xì)胞定位

LoERF4 蛋白不存在跨膜螺旋，其數(shù)值為0；N-末端位于細(xì)胞質(zhì)側(cè)膜的總數(shù)為0.005 59。結(jié)合圖4 可知：全部蛋白質(zhì)是膜外蛋白質(zhì)的可能性大于1，而膜內(nèi)蛋白質(zhì)和跨膜蛋白的可能性是0，故認(rèn)為該蛋白質(zhì)沒有跨膜結(jié)構(gòu)。WoLF PSORT 分析結(jié)果表明：LoERF4 蛋白可能定位于細(xì)胞核上。

圖4 LoERF4 蛋白跨膜結(jié)構(gòu)分析Fig.4 Analysis of the tansmembrane structure of LoERF4 protein

2.4 LoERF4 蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

由圖5 可知：LoERF4 蛋白包含4 種二級(jí)結(jié)構(gòu)，包括40 個(gè)氨基酸形成的α-螺旋(占19.90%)、43 條延伸鏈(占21.39%)、17 個(gè)氨基酸形成的β-轉(zhuǎn)角(占8.46%)和101 條隨機(jī)卷曲(占50.25%)。因此，該蛋白的主要結(jié)構(gòu)為隨機(jī)卷曲。對(duì)Lo-ERF4基因所編碼蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果(圖6)顯示：其三級(jí)結(jié)構(gòu)以無規(guī)則卷曲為主，符合二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果。

圖5 LoERF4 蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析Fig.5 Secondary structure analysis of LoERF4 protein

圖6 LoERF4 蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)分析Fig.6 Tertiary structure prediction of LoERF4 protein

由圖7 可知：LoERF4 蛋白存在信號(hào)肽的可能性為0.023，位于第18～19 位最可能剪切位點(diǎn)的可能性為0.015。該蛋白質(zhì)剪切位點(diǎn)分值為0.044，位于第 36 位；綜合剪切位點(diǎn)分值為 0.045，位于第6 位；信號(hào)肽分值為0.332，位于第1 位；平均信號(hào)肽分值為0.268，位于第1～5 位。因此，預(yù)測(cè)LoERF4 所編碼的蛋白為非分泌蛋白，不存在信號(hào)肽。

圖7 LoERF4 蛋白質(zhì)的信號(hào)肽分析Fig.7 Signal peptide analysis of LoERF4 protein

2.5 LoERF4 蛋白同源性與系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

由圖8 可知：LoERF4 同參與比對(duì)的植物氨基酸序列具有較高的相似性，且都含有1 個(gè)AP2/ERF 保守結(jié)構(gòu)域。系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖9)顯示：百合品種西伯利亞與雜交百合在同一分支，表明它們之間的親緣關(guān)系最近。

圖8 LoERF4 蛋白與其他植物的同源性比對(duì)Fig.8 Homology comparison of LoERF4 protein with other plants

圖9 LoERF4 的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.9 Phylogenetic tree of LoERF4

2.6 小鱗莖不同休眠時(shí)期的形態(tài)學(xué)變化和LoERF4基因表達(dá)分析

由圖10 可知：乙烯處理組小鱗莖在第20 天表現(xiàn)出萌發(fā)特性，萌發(fā)出鱗片葉；而對(duì)照組小鱗莖直到第30 天才開始萌發(fā)，表明100 μmol/L 乙烯可以有效促進(jìn)百合品種西伯利亞小鱗莖打破休眠并提前萌發(fā)。

圖10 不同休眠時(shí)期小鱗莖的形態(tài)變化Fig.10 Morphological changes of bulblets in different dormancy stages

由圖11 可知：乙烯處理后，LoERF4基因的相對(duì)表達(dá)量總體上呈現(xiàn)下降—上升—下降的趨勢(shì)，并且在0 d 時(shí)極顯著高于對(duì)照，表明該基因在乙烯處理后，快速響應(yīng)并表達(dá)；10 d 時(shí)，乙烯處理組的表達(dá)量低于對(duì)照組，表明乙烯可能在小鱗莖休眠解除前期抑制了LoERF4基因的表達(dá)；20 d 時(shí)(小鱗莖開始萌發(fā))，乙烯處理組的表達(dá)量極顯著高于對(duì)照組，約為對(duì)照組的3.44 倍；30 d時(shí)，對(duì)照組和處理組的LoERF4基因均呈現(xiàn)低表達(dá)，表明乙烯主要在小鱗莖萌發(fā)時(shí)起作用。

圖11 不同休眠時(shí)期小鱗莖的LoERF4 基因相對(duì)表達(dá)量Fig.11 Relative expression level of LoERF4 gene in different dormancy stages

3 討論

作為百合科百合屬植物，百合在觀賞、食用和藥用等方面有廣泛的應(yīng)用，探究百合的休眠調(diào)控機(jī)制對(duì)中國(guó)百合花卉產(chǎn)業(yè)有重要的價(jià)值。到目前為止，很少有ERF基因在百合屬植物中被克隆，關(guān)于該基因?qū)Π俸闲菝呓獬挠绊懸参匆妶?bào)道。

本研究從百合品種西伯利亞小鱗莖轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選、克隆得到1 個(gè)與小鱗莖休眠解除密切相關(guān)的基因LoERF4，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析和基因表達(dá)量分析，結(jié)果顯示：LoERF4全長(zhǎng)606 bp，編碼201 個(gè)氨基酸，包含1 個(gè)典型的AP2保守區(qū)域，表明其屬于ERF 亞家族轉(zhuǎn)錄因子；其蛋白相對(duì)分子量約為21.52 ku，理論等電點(diǎn)為6.43，為親水性蛋白，無跨膜結(jié)構(gòu)；通過蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)：LoERF4 蛋白中無規(guī)則卷曲占比最高，而螺旋相對(duì)較少，表明該蛋白是不穩(wěn)定蛋白，符合其三級(jí)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果。

ERF 類轉(zhuǎn)錄因子在不同的激素、非生物脅迫以及病原體所引起的信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[20]，如調(diào)節(jié)植物對(duì)激素、病原和脅迫等的應(yīng)答反應(yīng)，從而對(duì)植物的生長(zhǎng)和逆境進(jìn)行調(diào)控[21]。鑒于ERF 類轉(zhuǎn)錄因子是植物響應(yīng)非生物脅迫的關(guān)鍵調(diào)節(jié)者，為排除水分等關(guān)鍵非生物脅迫因子對(duì)LoERF4表達(dá)的影響，課題組前期對(duì)小鱗莖進(jìn)行了瓊脂糖培養(yǎng)、基質(zhì)(無土)栽培和土壤栽培試驗(yàn)，結(jié)果表明：在同樣處理?xiàng)l件下，瓊脂糖培養(yǎng)的百合小鱗莖萌發(fā)率相對(duì)一致，且在瓊脂糖培養(yǎng)條件下利用乙烯溶液浸泡處理小鱗莖后再進(jìn)行栽培能有效解除西伯利亞小鱗莖的休眠[22]。本研究表明：100 μmol/L 乙烯溶液有助于打破小鱗莖休眠，這與前期研究得到的結(jié)果一致。結(jié)合基因表達(dá)量分析發(fā)現(xiàn)：與對(duì)照組相比，乙烯處理組百合小鱗莖的LoERF4表達(dá)量在處理后的0 和20 d 極顯著上調(diào)，表明乙烯介導(dǎo)的百合小鱗莖萌發(fā)需要LoERF4在早期維持較高的表達(dá)水平，暗示Lo-ERF4可能是小鱗莖萌發(fā)的重要調(diào)節(jié)因子。

已有研究證明：ERF基因受各類信號(hào)分子的誘導(dǎo)表達(dá)并行使相應(yīng)的功能。對(duì)枸杞(Lycium chinenseMiller)的研究發(fā)現(xiàn)：乙烯可誘導(dǎo)LchERF基因表達(dá)從而增強(qiáng)植株鹽脅迫抗性[23]；對(duì)擬南芥的研究也發(fā)現(xiàn)：在外源乙烯誘導(dǎo)下，AtERF4基因?qū)σ蚁┑拿舾行韵陆礫24]；對(duì)多花水仙(Narcissus tazettavar.chinensis)[25]休眠的研究也發(fā)現(xiàn)：NtERF2和NtERF115可通過響應(yīng)乙烯參與多花水仙鱗莖的休眠解除過程。這與本研究結(jié)果基本一致，但基因表達(dá)量的變化趨勢(shì)有所差異，推測(cè)這是由于不同植物對(duì)乙烯的敏感性不同以及乙烯處理材料的方法不同所致。此外，有研究發(fā)現(xiàn)：ERF 類轉(zhuǎn)錄因子可以通過調(diào)節(jié)下游基因表達(dá)實(shí)現(xiàn)相應(yīng)的功能，如：在葡萄(Vitis viniferaL.)芽休眠解除過程中，轉(zhuǎn)錄因子VvERF59控制下游基因VvACS1的表達(dá)，參與乙烯生成、細(xì)胞壁降解、呼吸速率調(diào)節(jié)和非生物脅迫響應(yīng)等，最終解除葡萄芽休眠[26]。然而，百合中ERF基因是如何調(diào)控下游基因的表達(dá)還需進(jìn)行更深入的研究。

百合鱗莖休眠的形成和解除休眠的調(diào)節(jié)過程并不是由某一個(gè)基因調(diào)節(jié)引起的，而是由鱗莖各個(gè)系統(tǒng)和相應(yīng)的代謝途徑共同決定。在蘭州百合[Lilium davidiivar.willmottiae(E.H.Wilson) Raffill]的鱗莖休眠解除過程中發(fā)現(xiàn)：維持休眠的內(nèi)源脫落酸(ABA)含量明顯下降，而內(nèi)源生長(zhǎng)素(IAA)和赤霉素(GA3)水平快速上升，導(dǎo)致鱗莖休眠被打破并開始萌發(fā)[27]。已有研究也發(fā)現(xiàn)：乙烯參與植物種子的休眠和萌發(fā)過程，并通過調(diào)控脫落酸的代謝以及信號(hào)傳導(dǎo)途徑對(duì)脫落酸產(chǎn)生拮抗作用[28]。結(jié)合本研究結(jié)果和已有研究結(jié)論，推測(cè)LoERF4的表達(dá)量在0 和20 d 極顯著高于對(duì)照而在10 d 低于對(duì)照組的原因可能與小鱗莖內(nèi)源乙烯或其他植物激素信號(hào)變化有關(guān)。今后可以結(jié)合小鱗莖休眠解除過程中的激素變化研究百合鱗莖休眠解除的分子機(jī)制。

4 結(jié)論

本研究在百合品種西伯利亞中成功克隆了LoERF4，該基因?qū)儆贓RF 亞家族轉(zhuǎn)錄因子，是沒有跨膜結(jié)構(gòu)的親水性蛋白。LoERF4的表達(dá)量在小鱗莖萌發(fā)時(shí)極顯著上升，表明其參與了小鱗莖休眠解除且受到外源乙烯的誘導(dǎo)，推測(cè)LoERF4可能是引起小鱗莖休眠解除并萌發(fā)的潛在因子。