趙文植，魯 華，辛 靜，馬路遙，王正德，沈偉祥，王 飛，辛培堯

(1.西南林業(yè)大學(xué)，國家林業(yè)和草原局西南風(fēng)景園林工程技術(shù)研究中心，云南 昆明 650224；2.西南林業(yè)大學(xué)，西南地區(qū)生物多樣性保育國家林業(yè)和草原局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224；3.云南轎子山國家級自然保護(hù)區(qū)管護(hù)局，云南 祿勸 651515)

華山松(Pinus armandiiFranch.)為松科(Pinaceae)松屬(Pinus)常綠喬木[1]，是中國特有的造林樹種，也是重要的園林造景植物。在云南華山松是僅次于云南松的針葉造林樹種，在生態(tài)林建設(shè)和林產(chǎn)業(yè)發(fā)展中起著極其重要的作用。然而，長期引種單一類型的華山松種源進(jìn)行純林營建，導(dǎo)致其生長量持續(xù)減緩、生長勢明顯衰退，繼而引發(fā)多種病蟲害以及木材品質(zhì)變劣[2]。為了挖掘更新的優(yōu)良遺傳資源，充分利用潛在的遺傳變異，提高林分生產(chǎn)力，自1970 年起，中國便開始了華山松的種質(zhì)改良工作，并獲得了較大成就，為華山松的良種選育提供了一定的理論基礎(chǔ)和實(shí)踐指導(dǎo)[3]。由于種種原因，目前云南省華山松林的資源狀況、經(jīng)營技術(shù)和產(chǎn)業(yè)水平與其地位極不相稱，存在如種質(zhì)資源退化、良種選育滯后、利用水平低下和產(chǎn)品附加產(chǎn)出低等問題。因此，要實(shí)現(xiàn)華山松種植的產(chǎn)業(yè)化、優(yōu)質(zhì)化和高效化，需從根本上解決其良種選育、繁育及高效栽培問題，其中，明確現(xiàn)有種質(zhì)資源的遺傳基礎(chǔ)研究是良種選育的核心問題。

隨著分子生物學(xué)及其相關(guān)技術(shù)的快速發(fā)展，分子標(biāo)記被廣泛用于澳洲堅(jiān)果(Macadamia integrifolia)[4]、東北杏(Prunus mandshurica)[5]、紫薇(Lagerstroemia indica)[6]和山核桃(Carya cathayensis)[7]等木本植物的遺傳改良。在眾多分子標(biāo)記中，相關(guān)序列多態(tài)性(sequence-related amplified polymorphism，SRAP)標(biāo)記由于操作簡單、穩(wěn)定性好、結(jié)果重復(fù)率高且在基因組中均勻分布等特點(diǎn)，已在多種木本植物如云南松(P.yunnanensis)[8]、黑松(P.thunbergii)[9]、紅松(P.koraiensis)[10]、馬尾松(P.massoniana)[11]、刺梨(Rosa roxburghii Tratt)[12]、榿木(Alnus cremastogyne)[13]、花椒(Zanthoxylum bungeanum)[14]和土沉香(Aquilaria sinensis)[15]等的遺傳多樣性研究中有所報(bào)道。葉鵬等[16]對華山松SRAP 遺傳多樣性引物進(jìn)行篩選，并成功獲得15 個(gè)引物組合；在此基礎(chǔ)上，劉成等[17]以楚雄市華山松種子園內(nèi)的60 個(gè)無性系樣本為材料，對其SRAP 遺傳多樣性進(jìn)行了分析，為SRAP 標(biāo)記應(yīng)用于華山松的遺傳改良奠定了良好的基礎(chǔ)。然而，由于引物組合數(shù)量以及遺傳材料樣本量不足，其研究結(jié)果存在一定的局限性，不能對該種子園內(nèi)的華山松無性系群體進(jìn)行全面且準(zhǔn)確的評價(jià)，所獲得的遺傳信息較為有限，從而影響其在華山松遺傳改良工作中的應(yīng)用?；谏鲜鲈?，本研究利用更多的SRAP 分子標(biāo)記引物，對該種子園內(nèi)來自6 個(gè)種源的所有96 份華山松無性系進(jìn)行深入的遺傳分化及遺傳多樣性研究，全面了解該種子園內(nèi)華山松無性系的群體遺傳結(jié)構(gòu)，以期為在該種子園內(nèi)進(jìn)行華山松良種選育提供理論基礎(chǔ)及實(shí)踐指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料來源

試驗(yàn)材料采自云南省楚雄市華山松無性系種子園，分別來自會(huì)澤、騰沖、南華、巍山、宜良和楚雄6 個(gè)種源地，樣本數(shù)量共計(jì)96 份，均為無病蟲害單株的新鮮幼嫩針葉(表1)。所采針葉分別按單株裝入自封袋并編號，保存于-80 ℃冰箱，備用。

表1 華山松6 個(gè)自然群體的地理位置信息及樣本數(shù)Tab.1 Geographical information and number of samples of six natural populations of Pinus armandii

1.2 PCR 擴(kuò)增反應(yīng)

1.2.1 引物來源

引物組合序列 (表2) 一部分來自已報(bào)道的華山松SRAP 引物組合11 對[17]；另一部分則通過對已報(bào)道的思茅松[18]、番木瓜[19]和棉花[20]等植物相關(guān)文獻(xiàn)中的引物序列進(jìn)行組合，然后再進(jìn)行引物對篩選。SRAP 引物組合由上海生物工程有限公司合成。

表2 SRAP 標(biāo)記的引物信息Tab.2 Forward and reverse primer information of SRAP markers

1.2.2 引物篩選

以上、下游各13 個(gè)引物隨機(jī)組合獲得169對引物組合。采用改良CTAB 法對所有華山松樣本基因組DNA 進(jìn)行提取[21]，然后隨機(jī)選取8 份不同華山松無性系樣本DNA 作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增；在1%瓊脂糖凝膠中對合成的SRAP 引物組合進(jìn)行初篩，再利用初篩得到引物和已有SRAP引物組合對8 份華山松樣本DNA 進(jìn)行8%聚丙烯酰胺凝膠電泳復(fù)篩。

1.2.3 PCR 擴(kuò)增反應(yīng)及程序

采用經(jīng)優(yōu)化的華山松SRAP 分子標(biāo)記PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系及程序[17]進(jìn)行SRAP-PCR 擴(kuò)增試驗(yàn)。

1.3 聚丙烯酰胺凝膠電泳

采用周延清等[22]的方法進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳試驗(yàn)，并依據(jù)電泳結(jié)果圖統(tǒng)計(jì)多態(tài)性條帶，有條帶的記錄為“1”，無條帶的記錄為“0”，最終制成供統(tǒng)計(jì)軟件分析的(0,1)矩陣。

1.4 數(shù)據(jù)分析

(1) 采用POPGEN 1.32 計(jì)算群體多態(tài)位點(diǎn)百分率(P)、Shannon 多樣性指數(shù)(I)、等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)和基因流(Nm)等。

(2) 采用POPGEN 1.32 計(jì)算華山松群體遺傳距離和遺傳相似性系數(shù)；按照UPGMA 法進(jìn)行聚類圖的構(gòu)建和分析，并對華山松群體的遺傳距離和相對地理距離進(jìn)行Mantal 檢測。

(3)采用Structure 2.3.1[23]分析華山松的群體遺傳結(jié)構(gòu)，估計(jì)最佳群體組群數(shù)(K值)。設(shè)置K值為1～10 之間，重復(fù)運(yùn)行5 次，ΔK最大時(shí)對應(yīng)的K值為研究物種的最優(yōu)群體數(shù)。

(4) 采用GenAlEX 6.41[24]對華山松種源間的遺傳變異水平進(jìn)行AMOVA 分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 SRAP 引物組合的初篩與復(fù)篩

通過對169 對引物組合的初篩，最終新篩選得到15 對條帶清晰、明亮且具有較高多態(tài)性的華山松SRAP 引物組合(表3 和圖1)。利用初篩得到的15 對和已有的11 對SRAP 引物組合(共計(jì)26 對)對8 份不同無性系華山松樣本DNA 進(jìn)行8%聚丙烯酰胺凝膠電泳復(fù)篩發(fā)現(xiàn)：26 對SRAP引物組合均可獲得清晰、明亮且具有較高多態(tài)性的條帶(圖2)，可用于96 份華山松無性系DNA樣本的遺傳多樣性分析。

圖1 部分引物初篩結(jié)果Fig.1 Partial results of primer screening

圖2 部分 (ME13-EM3) 聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果Fig.2 Partial (ME13-EM3) results of polyacrylamide gel electrophoresis

表3 新篩15 對多態(tài)性SRAP 引物序列信息Tab.3 SRAP sequence information of the 15 polymorphic primer for P.armandii

2.2 華山松SRAP 位點(diǎn)遺傳多樣性分析

由表4 可知：基于26 對SRAP 引物組合，6個(gè)種源共擴(kuò)增出52 個(gè)等位基因，平均每對引物組合2 個(gè)等位基因；有效等位基因數(shù)最高的是ME2-EM9 (1.818 2)，最低的是ME3-EM5 (1.259 2)，平均值為1.511 6；Shannon 多樣性指數(shù)(I)最高的是ME2-EM9 (0.635 9)，最低的是ME3-EM5 (0.310 7)，平均值為0.467 4；Nei’s 遺傳多樣性指數(shù)(H)最高的是ME2-EM9 (0.445 1)，最低的是ME3-EM5(0.180 4)，平均值為0.306 2。比較H值和I值可知：H值低于I值，且二者值的變化關(guān)系呈正相關(guān)關(guān)系。說明篩選到的26 對SRAP 引物組合在6 個(gè)華山松種源中有較好的多態(tài)性，可用于6 個(gè)華山松種源的遺傳多樣性分析。

表4 華山松26 個(gè)引物多樣性信息Tab.4 The 26 primers diversity informations of P.armandii

2.3 華山松6 個(gè)種源間遺傳多樣性

由表5 可知：華山松6 個(gè)種源平均等位基因數(shù)(Na)為1.672 3，變化范圍在1.408 7～1.969 0 之間；平均有效等位基因數(shù)(Ne)為1.436 0，變化范圍在1.385 7～1.503 8 之間；Shannon 多樣性指數(shù)(I)變化范圍在0.350 1～0.459 7，平均值為0.394 4；Nei’s 遺傳多樣性指數(shù)(H)最大值為巍山(0.301 2)，最小值為宜良(0.231 7)，平均值為0.259 5；多態(tài)位點(diǎn)百分率平均值為81.22%。上述結(jié)果說明：6 個(gè)種源的Na平均值和Ne平均值差異較小，等位基因較少，I值和H值均處于較低水平，種源間遺傳變異較小，遺傳多樣性水平較低。

表5 不同種源的華山松遺傳多樣性信息Tab.5 The genetic diversity information of different P.armandii provenances

2.4 華山松群體遺傳分析

由圖3 可知：96 份華山松無性系樣品的ΔK值在K值為2 時(shí)最大，即華山松無性系樣品可劃分為2 個(gè)最優(yōu)群體。第1 個(gè)組群包含29 個(gè)無性系，為會(huì)澤和巍山種源；第2 個(gè)組群包含67 個(gè)無性系，為騰沖、宜良、楚雄、巍山及南華種源。Structure 結(jié)果(圖4)分析發(fā)現(xiàn)：以Q值為界限，Q≥0.6 的無性系有58 個(gè)，占60.41%；Q值＜0.6 的無性系有38 個(gè)，占39.58%；Q=0.6 時(shí)，華山松大部分樣本被劃為同一色區(qū)，但有少部分樣本被劃為不同色區(qū)，說明華山松6 個(gè)種源間存在一定的基因交流。以上結(jié)果表明6 個(gè)種源的96 份無性系材料的遺傳背景比較單一。

圖3 lnP(D)和ΔK 隨K 值的變化趨勢Fig.3 Trend of lnP(D) and ΔK with K value

圖4 樣品材料群組遺傳結(jié)構(gòu)Fig.4 Group genetic structure of sample material

2.5 華山松不同種源間的遺傳距離和遺傳一致度

由表6 可知：不同種源的華山松遺傳相似系數(shù)介于0.914 0～0.973 1 之間，平均遺傳相似系數(shù)為0.943 1；遺傳距離變化范圍在0.027 3～0.090 0之間，平均值為0.058 7。會(huì)澤種源和巍山種源之間有著最大的遺傳相似系數(shù)和最小的遺傳距離，表明會(huì)澤種源和巍山種源的親緣關(guān)系最近，遺傳差異較??；而宜良種源和騰沖種源之間有著最小的遺傳相似系數(shù)和最大的遺傳距離，表明宜良種源和騰沖種源的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，遺傳差異較大?？傮w來看，6 個(gè)華山松種源間遺傳相似性系數(shù)較高(＞0.90)，遺傳距離較小(＜0.09)，表明6 個(gè)華山松種源間親緣關(guān)系比較相近，遺傳背景單一，遺傳變異豐富度低。

表6 華山松種源間Nei’s 遺傳相似系數(shù)和遺傳距離Tab.6 Nei’s genetic identity and genetic distance of P.armandii provenances

2.6 群體間遺傳關(guān)系聚類分析

種源間UPGMA 聚類結(jié)果(圖5)顯示：當(dāng)遺傳相似系數(shù)為0.944 0 時(shí)，可將6 個(gè)種源聚為3組：第1 組包括會(huì)澤、巍山和騰沖種源；第2 組包括楚雄和南華種源；第3 組僅有宜良種源。

圖5 華山松6 個(gè)種源聚類分析Fig.5 Cluster analysis of six provenances of P.armandii

2.7 華山松各種源地理距離相關(guān)性檢驗(yàn)

Mantel 檢測結(jié)果(圖6)顯示：各散點(diǎn)較為散亂，未呈現(xiàn)出一定規(guī)律性，且P值為0.202，說明遺傳距離與地理距離在華山松不同種源間無顯著相關(guān)性，地理距離對其遺傳距離的影響不明顯。

圖6 Mantel 檢測遺傳距離和地理距離的相關(guān)性Fig.6 Correlation of genetic distance and geographical distance by Mantel detection

2.8 華山松種源間遺傳分化

AMOVA 分析結(jié)果(表7)顯示：華山松不同種源的遺傳差異主要位于種源內(nèi)，高達(dá)93.26%；種源間的遺傳分化相對較小，僅為6.74%。這表明種子園不同種源無性系的遺傳變異主要來源于種源內(nèi)。

表7 6 個(gè)種源的AMOVA 分析Tab.7 Analysis of molecular variance for six provenances

由表8 可知：華山松種源總基因多樣性在0.173 4～0.431 1 之間，平均值為0.300 3；種源內(nèi)基因多樣性在0.158 4～0.400 9，平均值為0.265 2；種源間基因多樣性在0.010 4～0.089 0 之間，平均值為0.035 1；種源遺傳分化系數(shù)變化范圍在0.048 4～0.214 0 之間，平均值為0.116 9，表明總的遺傳變異中有11.69%來自種源間，有88.31%的遺傳變異來自種源內(nèi)，遺傳變異主要存在于種源內(nèi)；此外，6 個(gè)種源間的基因流平均值為3.777 2，遠(yuǎn)大于1，表明各種源間遺傳分化偏低。

表8 遺傳分化系數(shù)和基因流Tab.8 Genetic differentiation index and gene flow

3 討論

3.1 華山松遺傳多樣性

在遺傳多樣性分析中，通過對Nei’s 遺傳多樣性指數(shù)(H)、Shannon 多樣性指數(shù)(I)和多態(tài)性位點(diǎn)(PPB)三者結(jié)合分析，能夠準(zhǔn)確、有效地反映種群的遺傳多樣性水平[25]。本研究表明：楚雄華山松種子園內(nèi)不同種源間的遺傳多樣性水平較低，這與劉成等[17]對該群體內(nèi)60 個(gè)無性系單株針葉進(jìn)行SRAP 遺傳多樣性分析的結(jié)果一致。趙楊等[26]利用ISSR 標(biāo)記對貴州省平壩華山松無性系種子園遺傳多樣性進(jìn)行研究，指出華山松無性系種子園遺傳多樣性處于較高水平，且遺傳變異主要存在于種源內(nèi)。在馬尾松[27]、紅松[28]、油松[29]和油茶[30]等種子園無性系中也有類似的研究結(jié)果。

3.2 華山松遺傳分化

遺傳分化系數(shù)(Gst)和基因流(Nm)是反映群體間遺傳分化和衡量群體內(nèi)近交程度的重要指標(biāo)[31]。楚雄華山松種子園無性系群體間的Gst平均值為0.116 9，種源內(nèi)的遺傳多樣性占總?cè)后w的占88.31%，遺傳變異主要存在于種源內(nèi)；Nm值為3.777 2＞1，表明6 個(gè)華山松種源間存在較大的基因流動(dòng)，使得華山松無性系種源間遺傳背景一致，變異程度降低。對黑松[9]、紅松[10]、刺梨[12]、榿木[13]、花椒[14]和土沉香[15]等的研究也表明：遺傳變異主要來自于種源內(nèi)的個(gè)體間，而各種源間存在一定的基因互滲現(xiàn)象。對杉木地理種源的遺傳多樣性分析指出：杉木各種源間存在的較強(qiáng)基因流并不完全是由各種源間自然產(chǎn)生的，而是2 000 多年廣泛且大規(guī)模無序栽培引起不同地理種源在不同地點(diǎn)相遇，尤其是距離較遠(yuǎn)的種源之間的相遇，也就是人為因素導(dǎo)致不同種源間的遺傳交流，最終使同一地理種源內(nèi)的遺傳多樣性程度變高，且不同種源間遺傳變異快速縮小[32]。因此，長期人為的造林單位間無序大規(guī)模種子的調(diào)撥、混合以及飛播造林等均會(huì)導(dǎo)致華山松種源間遺傳多樣性程度降低，并提高種源內(nèi)的遺傳多樣性；此外，雜食性鳥類、獸類和嚙齒類的取食行為促進(jìn)了華山松種子傳播，也在一定程度上增加了種源間的基因流動(dòng)[33]。綜上所述，在楚雄華山松種子園內(nèi)進(jìn)行雜交育種工作，應(yīng)更多考慮從種源內(nèi)選擇親本。

3.3 華山松群體遺傳結(jié)構(gòu)和親緣關(guān)系分析

在生物分類學(xué)中，種源間的親緣關(guān)系遠(yuǎn)近主要以遺傳相似性和遺傳距離為依據(jù)。遺傳相似性與遺傳距離具有一定的相關(guān)性，一般認(rèn)為遺傳距離越小、遺傳相似度越高，親緣關(guān)系越近[34-35]。本研究發(fā)現(xiàn)：華山松6 個(gè)種源的遺傳相似系數(shù)高，遺傳距離小，其親緣關(guān)系較近，遺傳基礎(chǔ)較窄。巍山和會(huì)澤種源的遺傳距離最小，遺傳相似系數(shù)最大，親緣關(guān)系較近；而宜良和騰沖種源有著最遠(yuǎn)的親緣關(guān)系，說明各種源間的親緣關(guān)系遠(yuǎn)近與其地理分布并不存在顯著相關(guān)性。對黑松[9,36]、棕櫚[37]、流蘇樹[38]和桑樹[39]等的研究也有類似結(jié)果。分析其原因可能是研究的空間尺度較小，種源間環(huán)境因子差異小，沒有形成相對隔絕的地理隔離，種源間表現(xiàn)不出遺傳差異[40]。因此，今后的林木育種實(shí)踐應(yīng)以DNA 水平的評價(jià)為主要依據(jù)，適當(dāng)參考地理距離遠(yuǎn)近進(jìn)行親本選配，進(jìn)而最大限度地發(fā)揮親本雜交后代的雜種優(yōu)勢。

3.4 不同分子標(biāo)記研究結(jié)果差異分析

不同分子標(biāo)記技術(shù)的原理不同，在對物種進(jìn)行遺傳多樣性分析時(shí)獲得的結(jié)果存在一定的差異。辛靜等[41]和徐劍等[42]也曾分別利用SSR 和SCoT 標(biāo)記對該種子園內(nèi)的相同無性系進(jìn)行遺傳多樣性分析。綜合比較，SRAP 標(biāo)記覆蓋的位點(diǎn)及所揭示的6 個(gè)種源間遺傳相似系數(shù)平均值均高于SCoT 和SSR 標(biāo)記，但Nei’s 遺傳多樣性指數(shù)(H)、Shannon 多樣性指數(shù)(I)和多態(tài)性位點(diǎn)(PPB)等參數(shù)均低于SCoT 和SSR 分子標(biāo)記；此外，3 種標(biāo)記均反映出遺傳變異主要來自于種源內(nèi)。可見，不同的分子標(biāo)記揭示的遺傳多樣性水平和基因組位點(diǎn)數(shù)等存在一定差異，但這3 種分子標(biāo)記之間并不相互排斥，結(jié)合3 種分子標(biāo)記結(jié)果更有利于準(zhǔn)確揭示種源間的親緣關(guān)系和變異情況。

4 結(jié)論

楚雄華山松種子園無性系的種源間遺傳多樣性程度較低，而種源內(nèi)遺傳差異較大；6 個(gè)種源的地理距離與其遺傳距離不存在明顯的相關(guān)性。因此，以該種子園作為華山松遺傳改良的平臺(tái)，應(yīng)充分考慮分子水平的評價(jià)結(jié)果，適當(dāng)參考地理距離進(jìn)行雜交親本的選配等工作，并注重種源內(nèi)無性系個(gè)體間的雜交。