廉瑞婷，任 宏，翟 文，陳連水，湯曉辛

(1.貴州師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.東華理工大學(xué) 化學(xué)生物與材料科學(xué)學(xué)院，江西 南昌 330013)

大白菜(Brassica rapaL.)是十字花科(Brassicaceae)蕓苔屬(Brassica)蔬菜，起源于中國(guó)[1]，根據(jù)生長(zhǎng)形態(tài)可分為結(jié)球型和非結(jié)球型[2]。大白菜原分布于中國(guó)華北，目前在中國(guó)各地廣泛栽培，耐寒，喜好冷涼氣候，不適于栽植在排水不良的黏土地上；其營(yíng)養(yǎng)豐富，菜葉可供炒食、生食、鹽腌和醬漬，外層脫落的菜葉可作飼料，且具有一定的藥用價(jià)值[3]。大白菜是中國(guó)傳統(tǒng)的重要蔬菜，年種植面積約180 萬(wàn)hm2，約占中國(guó)蔬菜種植面積的15%[4]。

大白菜COBRA基因編碼糖基磷脂酰肌醇錨定蛋白(glycosylphosphatidylinositol- anchored protein)，在植物細(xì)胞壁纖維素的合成、細(xì)胞的定向伸長(zhǎng)和纖維素的沉積過(guò)程中起重要作用[5]，其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是：(1) N-端信號(hào)肽將該蛋白質(zhì)定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；(2)碳水化合物結(jié)合區(qū)域(CBM)富含芳香族氨基酸殘基；(3)高度保守的半胱氨酸富集區(qū)(CCVS)；(4)在C-端具有GPI 錨定位點(diǎn)和疏水尾巴。COBL 蛋白 (即COBRA 蛋白) 被分泌到高爾基體囊泡中，然后位于質(zhì)膜上，以調(diào)節(jié)纖維素的組裝和結(jié)晶[6]。根據(jù)COBRA 蛋白序列相似性可將其分為2 個(gè)亞組，其中一個(gè)亞組的N 端氨基酸序列較長(zhǎng)，比另一組約長(zhǎng)45%，外顯子數(shù)量較少[7]。COBRA基因最早發(fā)現(xiàn)于擬南芥根細(xì)胞異常膨大的突變體中[8]。擬南芥中的AtCOBL4是次生細(xì)胞壁纖維素合成所必需，其突變會(huì)使莖稈易折斷[9]；AtCOBL9則會(huì)影響擬南芥根毛的生長(zhǎng)和形態(tài)發(fā)育[10]；COBL2 蛋白功能缺失會(huì)使擬南芥種子表皮黏液分泌細(xì)胞中的纖維素大幅減少[11-12]。水稻Os-BC1L4(COBRA-like 蛋白)突變會(huì)導(dǎo)致葉片細(xì)胞壁纖維素含量降低、果膠含量增加[13]；玉米中COBRA-like 蛋白bk2突變會(huì)使植株變得脆弱，莖和葉中的纖維素含量顯著降低，木質(zhì)素增加[14]。

在擬南芥、玉米、水稻、番茄和大豆等植物中鑒定了COBRA 基因家族成員的數(shù)量分別為12、11、9、17 和24 個(gè)[15-19]，但大白菜COBRA 基因家族的研究尚未有報(bào)道。纖維素含量與蔬菜產(chǎn)量、食用口感、營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)和栽培方式等密切相關(guān)。研究表明：溫度對(duì)細(xì)胞壁合成物質(zhì)和纖維素含量有一定的影響。35 ℃高溫下，非結(jié)球白菜葉片的纖維素含量增加，而在4 ℃低溫時(shí)降低[20]；15 ℃處理下，煙草中的纖維素含量低于25 ℃，但木質(zhì)素含量高于25 ℃[21]。本研究利用生物信息學(xué)方法對(duì)大白菜全基因組中的COBRA 基因家族進(jìn)行鑒定，并對(duì)其基因序列結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)進(jìn)化、啟動(dòng)子元件和低溫脅迫下的表達(dá)模式進(jìn)行分析，以期為深入研究 COBRA 家族各成員功能以及低溫環(huán)境下COBRA基因?qū)χ参锢w維素含量的調(diào)控提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 COBRA 基因家族鑒定

從十字花科植物數(shù)據(jù)庫(kù)(http://brassicadb.cn/)獲取大白菜(B.rapa，AA)[22]、擬南芥(Arabidopsis thaliana)、甘藍(lán)(B.oleracea，CC)、芥菜(B.juncea，AABB)、甘藍(lán)型油菜(B.napus，AACC)的參考基因組及相關(guān)注釋信息。查詢大白菜的COBRA基因，利用HMMER 程序(http://hmmer.org/)和Pfam (http://pfam.xfam.org/)結(jié)果對(duì)COBRA 蛋白保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行確認(rèn)。使用 BlastP 在大白菜全基因蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)中進(jìn)行搜索，篩選閾值(e-value)小于等于10-5，獲得大白菜和其他4 種十字花科植物的COBRA 基因家族成員。

1.2 COBRA 基因序列結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)進(jìn)化分析

利用 Expasy 在線分析蛋白質(zhì)的氨基酸長(zhǎng)度、分子量和理論等電點(diǎn)；在大白菜基因組注釋信息中提取COBRA 家族成員染色體位置信息。使用MEME 程序(Version 5.3.0，http://meme-suite.org/tools/meme)分析大白菜COBRA 蛋白質(zhì)序列的保守基序，迭代次數(shù)為18 000，nmotifs≤10。使用MEGA-X 軟件的ClustalW 工具對(duì)蛋白質(zhì)序列進(jìn)行比對(duì)排序(默認(rèn)參數(shù))；采用鄰接法(neighbor-joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)，Bootstrap 校驗(yàn)值為1 000 次。

1.3 COBRA 基因表達(dá)的分析

提取白菜COBRA 家族基因上游2 kb 序列作為啟動(dòng)子區(qū)域，用PlantCARE 軟件預(yù)測(cè)大白菜COBRA 家族基因的啟動(dòng)子順式調(diào)控元件。

在常溫(25 ℃)下將大白菜(品種：KTRG-B49)培養(yǎng)至四葉一心期，然后分為以下6 個(gè)處理組：(1) 4 ℃ (低溫)分別處理1、4 和6 h；(2) -2 ℃處理2 h；(3) -4 ℃處理1 h；(4) 低溫處理后常溫恢復(fù)1 d。各處理組均以常溫(25 ℃)為對(duì)照組。所有處理均取3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)，共7 組21 個(gè)樣品。采用Illumina HiSeqTM2500 測(cè)序儀對(duì)各組處理的葉片進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。計(jì)算每個(gè)樣品每千個(gè)堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬(wàn)映射讀取的片段(fragments per kilobase of exon model per million mapped fragments，F(xiàn)PKM)均值，分析大白菜COBRA基因在不同條件下的表達(dá)量，將其表達(dá)量通過(guò)TBtools 軟件繪制熱圖。

1.4 熒光定量qPCR 的基因表達(dá)分析

應(yīng)用Primer3 設(shè)計(jì)引物(表1)，內(nèi)參基因?yàn)榘撞薆raActin。使用HiScript ll QRT SuperMix for qPCR (諾維贊)試劑盒對(duì)樣品RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，用ChamQ SYBR qPCR Master Mix(諾維贊)試劑盒進(jìn)行定量PCR 試驗(yàn)。反應(yīng)體系為20 μL，包括：cDNA 2 μL，上、下游引物各0.4 μL，SYBR 10 μL，滅菌ddH2O 補(bǔ)至20 μL。PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 30 s，95 ℃ 10 s，60 ℃22 s，40 個(gè)循環(huán)?；虻南鄬?duì)表達(dá)量以2-ΔΔCt法計(jì)算，用Excel 軟件整理數(shù)據(jù)并繪圖。

表1 qPCR 引物信息Tab.1 Primer sequence of qPCR

2 結(jié)果與分析

2.1 大白菜COBRA 基因家族的鑒定及理化性質(zhì)

大白菜基因組COBRA 家族含有23 個(gè)成員(表2)，命名為BrCOBL1～BrCOBL23，分布在大白菜基因組的8 條染色體上(圖1)。由表2 可知：BrCOBL 蛋白質(zhì)的分子量在8.61～74.53 ku之間，大部分成員的相對(duì)分子量在45～55 ku 之間；氨基酸長(zhǎng)度在98～673 aa 之間，有73.91% 成員的氨基酸長(zhǎng)度大于400 aa；等電點(diǎn)在5.16～10.41 之間，有86.96% 成員的等電點(diǎn)大于7。鑒定出的大多數(shù)COBRA基因具有CCVS 基序、N 端信號(hào)肽和潛在的ω 位點(diǎn)。

圖1 大白菜COBRA 基因家族在染色體上的分布Fig.1 Distribution of COBRA gene family of Brassica rapa on chromosomes

表2 大白菜COBRA 基因家族成員的理化性質(zhì)Tab.2 Physicochemical properties of COBRA gene family members of Brassica rapa

2.2 大白菜COBRA 基因家族的序列結(jié)構(gòu)及保守基序

由圖2 可知：大白菜COBRA 基因家族可分為2個(gè)亞家族(Group1 和Group2)，Group1 有13 個(gè)成員，包括BrCOBL1～BrCOBL13，Group2家族有10 個(gè)成員，包括BrCOBL14～BrCOBL23。對(duì)大白菜23 個(gè)COBRA 家族成員的蛋白質(zhì)保守基序進(jìn)行分析(圖2a 和表3)可知：除BrCOBL3、BrCOBL4 和BrCOB20 外，其他20 個(gè)蛋白都具有 motif2；除BrCOBL4、BrCOBL13 和BrCOBL14外，其他20 個(gè)蛋白均含有motif6，說(shuō)明motif2和motif6 為 COBRA 家族的特征motif。此外，有19 個(gè)蛋白含有 motif1，有19 個(gè)蛋白含有 motif3，有18 個(gè)蛋白含有 motif5、motif7 和motif8，說(shuō)明這些motif 在COBRA 蛋白中也相當(dāng)保守，其中motif5 含有Cys-Cys-Val-Ser (CCVS)結(jié)構(gòu)域。Group1 中除BrCOBL4 外，其他均含有motif2 和motif3；Group2 中除BrCOBL14 外，其他均含有motif1、moti5、motif6 和motif9，且motif4 只存在于Group1，motif9 和motif10 只存在于Group2，表明這些motif 可能與各亞族成員的功能分化有關(guān)。

表3 大白菜COBRA 基因家族的motif 序列及長(zhǎng)度Tab.3 Motif sequence and length of COBRA gene family of B.rapa

圖2 大白菜COBRA 基因家族系統(tǒng)進(jìn)化及基因結(jié)構(gòu)Fig.2 Phylogenetic evolution and gene structure of COBRA gene family of B.rapa

對(duì)大白菜COBRA 家族成員的基因結(jié)構(gòu)分析(圖2b)可知：Group1 家族的外顯子數(shù)量較多。COBRA 家族中有10 個(gè)成員含有5 個(gè)及5 個(gè)以上外顯子，它們都位于Group1。Group2 家族中外顯子數(shù)量較少，其中8 個(gè)成員含有1～3 個(gè)外顯子，2 個(gè)成員含有4 個(gè)外顯子。結(jié)合系統(tǒng)進(jìn)化分析可知：進(jìn)化關(guān)系較近的基因其結(jié)構(gòu)也相似，進(jìn)一步表明系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)聚類(lèi)的可靠性。

2.3 大白菜近緣物種的COBRA 蛋白系統(tǒng)進(jìn)化

由表4 可知：十字花科的5 個(gè)物種共鑒定COBRA 成員147 個(gè)。根據(jù)氨基酸序列相似性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)(圖3)可將基因組成員分為8 個(gè)不同的亞組(I～ VIII)。I 亞組所含成員最多，大白菜有6 個(gè)成員在I 亞組(BrCOBL5～BrCOBL10)，占總數(shù)的18.75%，這6 個(gè)基因跟擬南芥的3 個(gè)基因(AT3G02210、AT3G29810和AT5G15630)位于同一亞組，推測(cè)它們可能有類(lèi)似的功能；BrCOBL1和BrCOBL2位于第II 亞組；BrCOBL3和BrCOBL4位于第III 亞組；BrCOBL11和BrCOBL12位于第V 亞組；BrCOBL18、BrCOBL19和BrCOBL20位于第 VI 亞組；BrCOBL15、BrCOBL16和BrCOBL17位于第VII 亞組；BrCOBL21、BrCOBL22和Br-COBL23位于第VIII 亞組。

圖3 十字花科物種的COBRA 家族系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)Fig.3 COBRA family phylogenetic tree of Brassicaceae species

表4 系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)中的亞組Tab.4 Subgroups in phylogenetic tree

2.4 大白菜COBRA 基因家族對(duì)低溫脅迫的響應(yīng)

由圖4 和圖5 可知：BrCOBL1、BrCOBL2、BrCOBL5、BrCOBL10、BrCOBL15和BrCOBL16基因均在大白菜葉片中表達(dá)，但另外17 個(gè)基因在葉片中幾乎不表達(dá)，推測(cè)大白菜COBRA基因功能可能存在冗余。BrCOBL15和BrCOBL16基因在常溫下表達(dá)量較低，在低溫處理下表達(dá)量顯著增高，恢復(fù)常溫后，其表達(dá)量下降。BrCOBL1和BrCOBL2基因在所有樣品中都有表達(dá)，尤其是在4 ℃處理6 h、-2 ℃處理2 h 和-4 ℃處理1 h的樣品中表達(dá)量較高，在-4 ℃處理1 h 的樣品中BrCOBL1和BrCOBL2基因表達(dá)量分別是對(duì)照的4 倍和3.5 倍；樣品在常溫恢復(fù)1 d 后的表達(dá)量又顯著降低，說(shuō)明低溫脅迫能增加BrCOBL1和BrCOBL2基因的表達(dá)量，且溫度越低或在低溫下處理時(shí)間越長(zhǎng)其表達(dá)量增量越大?？梢?jiàn)，BrCOBL1、BrCOBL2、BrCOBL15和BrCOBL16基因與大白菜響應(yīng)低溫脅迫和低溫下調(diào)控白菜纖維素合成有密切關(guān)系。

圖4 應(yīng)用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析COBRA 在低溫脅迫下的表達(dá)量Fig.4 Expression level of COBRA analyzed by RNA-seq at low temperature stress

圖5 BrCOBL1、BrCOBL2、BrCOBL15 和BrCOBL16 在低溫脅迫下的qPCR 表達(dá)Fig.5 qPCR expression of BrCOBL1, BrCOBL2, BrCOBL15 and BrCOBL16 at low temperature stress

2.5 大白菜COBRA 啟動(dòng)子區(qū)域順式元件預(yù)測(cè)

由圖6 可知：在15 種啟動(dòng)子元件中，每個(gè)COBRA 成員啟動(dòng)子區(qū)域都含有共同的1 個(gè)或多個(gè)TATA-box 和CAAT-box 元件；分別有73.9%、73.9%和56.5%的COBRA 啟動(dòng)子含有ARE、Gbox 和ABRE 元件，這些與植物抗氧化反應(yīng)、光應(yīng)答反應(yīng)以及脫落酸和茉莉酸調(diào)控相關(guān)。Br-COBL2基因啟動(dòng)子區(qū)域的ABRE 元件最多(7個(gè))，而赤霉素調(diào)控元件TATC-box 在BrCOBL1中特異存在，這可能與BrCOBL1和BrCOBL2的特異性表達(dá)有關(guān)。以上結(jié)果說(shuō)明COBRA基因參與大白菜的非生物脅迫響應(yīng)及激素應(yīng)答調(diào)控。

圖6 大白菜COBRA 基因家族啟動(dòng)子順式調(diào)控元件Fig.6 Cis-elements in COBRA gene family promoters

3 討論

COBRA 基因家族是植物特有的基因家族，其主要功能是參與植物細(xì)胞的擴(kuò)增，且與籽粒產(chǎn)量和纖維素的生物合成密切相關(guān)[23-25]。本研究基于生物信息學(xué)方法在大白菜中共鑒定到23 個(gè)COBRA 基因家族成員，從其蛋白序列整體分析結(jié)果可知：COBRA基因分為2 個(gè)亞族，同一亞族的基因具有相似的基因結(jié)構(gòu)，不同亞族之間蛋白長(zhǎng)度差異明顯。在基因結(jié)構(gòu)上，Group1 家族COBRA基因的外顯子數(shù)量多于Group2 家族，該結(jié)果與對(duì)擬南芥[8]、水稻[24]、棉花[26]、冬棗[27]、高粱[28]和大豆[22]的研究結(jié)果基本一致。大白菜COBRA 蛋白結(jié)構(gòu)較保守，有82%以上的成員含有motif2、motif6、motif1 和motif3，且2 個(gè)亞族成員也有各自特有的基序，不同亞族的保守基序不同暗示著基因功能的多樣性。

在系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)中，遺傳距離相近或在同亞組的基因可能執(zhí)行類(lèi)似的功能。大白菜COBRA 家族成員在低溫脅迫下表達(dá)的2 個(gè)基因(BrCOBL15和BrCOBL16)均在第VII 亞組上，在這個(gè)亞組的還有AtCOBL9(AT5G49270)，它會(huì)影響擬南芥根毛的生長(zhǎng)和形態(tài)發(fā)育[10]。BrCOBL5～BrCOBL10的6 個(gè)成員在Group1 家族，與擬南芥的AtCOBL4(AT5G15630)均位于I 亞組，AtCOBL4為擬南芥次生細(xì)胞壁纖維素合成所必需，其突變會(huì)使莖稈易折斷[23]。

‘cob-5’ (AT5G60950)功能缺失會(huì)嚴(yán)重影響植株的生長(zhǎng)發(fā)育，同時(shí)會(huì)積累大量應(yīng)激化合物(如花青素和胼胝體等)，還會(huì)導(dǎo)致參與花青素合成的基因上調(diào)、參與細(xì)胞生長(zhǎng)的基因下調(diào)并大量誘導(dǎo)防御脅迫相關(guān)的基因，如植物茉莉酸信號(hào)通路[29]。大白菜的BrCOBL3和BrCOBL4與擬南芥At-COBL5都在第III 亞組，推測(cè)它們可能有類(lèi)似的基因功能。

纖維素是細(xì)胞壁的重要成分，低溫會(huì)影響植物細(xì)胞壁各物質(zhì)的含量或改變細(xì)胞壁的機(jī)械結(jié)構(gòu)。研究表明：4 ℃低溫下，非結(jié)球白菜的纖維素含量降低了22.16%[20]；15 ℃處理下，煙草的纖維素含量降低而木質(zhì)素含量升高[21]；低溫下棉花纖維的長(zhǎng)度會(huì)顯著縮短[30]。同屬于第II 亞組的BrCOBL1和BrCOBL2在常溫下少量表達(dá)，同屬于第VII 亞組BrCOBL15和BrCOBL16在常溫下幾乎不表達(dá)，這4 個(gè)COBRA基因在低溫時(shí)的表達(dá)量顯著升高，推測(cè)與纖維素合成、細(xì)胞壁形成以及細(xì)胞的定向生長(zhǎng)密切相關(guān)。

4 結(jié)論

低溫環(huán)境下，大白菜BrCOBL1、BrCOBL2、BrCOBL15和BrCOBL16在其葉片顯著表達(dá)，根據(jù)啟動(dòng)子分析結(jié)果推測(cè)BrCOBL基因可能參與大白菜的非生物脅迫響應(yīng)及激素應(yīng)答調(diào)控。COBRA 蛋白序列含有共同的保守基序，且某些基序特異存在于不同的亞組，表明這些基序可能與各亞組的功能分化有關(guān)。