朱金霞 馮 銳 任怡蓮

（1.寧夏農(nóng)林科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心，寧夏農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧夏 銀川 750002；2.寧夏農(nóng)林科學(xué)院農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)與信息技術(shù)研究所，寧夏 銀川 750002；3.寧夏農(nóng)林科學(xué)院，寧夏 銀川 750002）

羊肚菌隸屬子囊菌門、盤菌綱、盤菌目、羊肚菌科、羊肚菌屬（Morchella），因其菌蓋呈褶皺網(wǎng)狀似羊肚而得名，在民間也被稱為陽雀菌、狼肚菌、麻子菌、天狼肚、包谷菌兒、編笠菌、雞蛋花等[1]。羊肚菌味道鮮美，含有鐵、鋅等礦質(zhì)元素，24.5%蛋白質(zhì)，19 種氨基酸[2]，還含有羊肚菌酸、多糖、甾醇等特征成分[3]，具有“菌中之王”的美譽(yù)，廣受歐洲、美洲、東亞、東南亞一些國家歡迎。

據(jù)《本草綱目》記載，羊肚菌性平，味甘寒，有益腸胃、助消化、化痰理氣、補(bǔ)腎壯陽、補(bǔ)腦提神等功效[4]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，羊肚菌能降血脂、調(diào)節(jié)免疫、抗疲勞、抗病毒、抗菌、抑制腫瘤和減輕放化療引起的毒副作用等[2,3]。隨著社會經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人們對羊肚菌營養(yǎng)和保健價(jià)值認(rèn)知的加深，對于羊肚菌的需求也會越來越大，生產(chǎn)高品質(zhì)的羊肚菌既符合當(dāng)代消費(fèi)者的需求，也是羊肚菌產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要契機(jī)。

硒是人類生命活動(dòng)必需的微量元素之一，人體適量攝入硒元素能預(yù)防細(xì)胞癌變、減緩衰老、增強(qiáng)免疫力和解毒排毒等，嚴(yán)重缺硒會誘發(fā)大骨節(jié)病、克山病、呆小癥等病癥[5]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)表明，威脅人類健康和生命的疾病中有四十多種與缺硒有關(guān)[6]。由于人體不能自身合成硒，所以硒的營養(yǎng)水平主要來源于日常飲食，而土壤或栽培料又是植物硒的主要來源[7]。

中國是全球嚴(yán)重缺硒的地區(qū)之一，低硒地區(qū)占全國的72%，部分地區(qū)嚴(yán)重缺硒[5]，外源添加硒元素是提高作物硒含量的重要途徑。自然界中硒主要以有機(jī)硒和無機(jī)硒的形態(tài)存在，人類需要的是有機(jī)硒[5]，而納米硒粒徑較小，比表面積大，表面活性高，易被腸道吸收，具有較高的生物利用率。此外，納米硒急性毒性顯著低于亞硒酸鈉，比常用的硒化物的安全劑量范圍更廣[8]。

食用菌是良好的硒生物轉(zhuǎn)化載體，能夠?qū)h(huán)境中的無機(jī)硒轉(zhuǎn)化為安全高效的有機(jī)硒[9]，開展食用菌富硒栽培，能夠?qū)⑹秤镁臀氐墓δ苡袡C(jī)融合，研制富硒的食品或藥品，對于食品、保健和醫(yī)藥領(lǐng)域都具有重要意義[10,11]。而食藥用菌中所積累的微量元素含量與生長環(huán)境類型、食藥用菌種類、元素類型有關(guān)，生長環(huán)境中過量的硒元素會阻礙菌絲生長和子實(shí)體形成[12,13]。

本研究在總結(jié)前人工作的基礎(chǔ)上，以改良PDA培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基（對照），比較培養(yǎng)基不同納米硒添加量對羊肚菌母種菌絲生長的影響，以篩選出羊肚菌母種菌絲富硒培養(yǎng)最適的納米硒添加量，為羊肚菌母種菌絲的富硒馴化培養(yǎng)和菌種制作提供理論基礎(chǔ)和數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

（1）菌種。供試羊肚菌品種為六妹羊肚菌（Morchella sextelata），由寧夏農(nóng)林科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心微生物與酶工程研究室經(jīng)子實(shí)體組織分離、培養(yǎng)和純化后獲得，4 ℃保存于試管中。

（2）羊肚菌母種培養(yǎng)基制備?；A(chǔ)培養(yǎng)基為改良PDA 培養(yǎng)基（T0），制作方法：馬鈴薯（去皮、切條）250 g，加蒸餾水約1 000 mL 加熱至沸騰，小火煮沸15 min，4 層紗布過濾。濾液中添加葡萄糖30.0 g、KH2PO42.5 g、MgSO42.0 g、蛋白胨2.0 g、瓊脂15.0 g，用蒸餾水定容至1 000 mL，分裝。富硒母種培養(yǎng)基制備方法：在分裝后的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入納米硒，121 ℃滅菌30 min 后制作平板。納米硒添加量設(shè)置7 個(gè)水平，分別為0.052、0.104、0.208、0.416、0.832、1.664 和3.328 mg/L，編號T1～T7。每個(gè)水平重復(fù)6 次。

1.2 菌種活化方法

在基礎(chǔ)培養(yǎng)基平板中央接入羊肚菌試管種，在12±1 ℃條件下暗培養(yǎng)5 天，備用。

1.3 菌落長勢調(diào)查方法

在無菌條件下，活化的羊肚菌平板種打孔制成直徑10.0 mm 菌餅，分別接種至不同納米硒添加量的平板中央，在12±1 ℃下暗培養(yǎng)。接種后第3 天開始用游標(biāo)卡尺測量菌落直徑（mm），至培養(yǎng)第10 天時(shí)結(jié)束實(shí)驗(yàn)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同納米硒添加量的羊肚菌菌落直徑

由圖1 可知，培養(yǎng)基中納米硒添加量對羊肚菌菌落直徑影響顯著，菌落直徑隨培養(yǎng)基中納米硒添加量的增加呈先增大后減小的趨勢。納米硒添加量為0.104 mg/L（T2）時(shí)，菌落直徑最大。在接種后第3～6 天，T2 處理菌落直徑分別可達(dá)35.1 mm、48.6 mm、62.7 mm 和77.2 mm，比未添加納米硒的對照T0 大23.17%、19.93%、18.99%和15.16%。

圖1 不同處理的羊肚菌菌落直徑變化

培養(yǎng)基中納米硒添加量為0.416 mg/L（T4）時(shí)，菌落直徑與T0（CK）比較差異不顯著（P>0.05）。隨著培養(yǎng)基中納米硒添加量的增大，當(dāng)硒添加量≥0.832 mg/L（T5）時(shí)，菌落直徑顯著小于對照（P<0.05），往后硒添加量越大，菌落直徑越小。

由表1 可知，母種培養(yǎng)基中納米硒添加量對羊肚菌菌落直徑日均增長量具有顯著影響。菌落直徑日均增長量，除T0（CK）處理隨培養(yǎng)時(shí)間增加呈先增大后減小的趨勢外，其他處理均呈增大趨勢。各處理菌落直徑日均增量最大值出現(xiàn)時(shí)間，T0（CK）為第4 天，而添加納米硒的其他處理均為第6 天。

表1 不同處理羊肚菌菌落直徑日平均增長量（單位：mm）

2.2 不同處理羊肚菌菌絲體的形態(tài)特征

由圖2 可看出，培養(yǎng)基中納米硒添加量為0～3.328 mg/L 時(shí)（T0～T7），羊肚菌菌絲均能生長，但各處理間形態(tài)差異明顯。在接種后第10 天，T0～T5 處理的菌絲均已長滿平板，以T2 處理的菌絲體長勢最旺，密度最大。T7 處理雖然菌絲體密度大，但長速慢、長勢弱，可見，培養(yǎng)基中硒添加量過大，對羊肚菌菌絲體生長具有顯著抑制作用。

圖2 不同富硒處理羊肚菌菌絲體形態(tài)特征（第10 天）

3 討論與結(jié)論

天然食用菌中硒含量普遍偏低[14]，食用菌具有一定的富硒功能，外源添加硒元素是提高食用菌硒含量的重要方法，目前已經(jīng)培育出的富硒食用菌種類有靈芝、金針菇、平菇、香菇和猴頭菌等[9,10]。羊肚菌具有較強(qiáng)的富硒能力，能通過生物吸附及細(xì)胞內(nèi)生化作用吸收無機(jī)硒，并與大分子活性物質(zhì)結(jié)合，最終以硒蛋白或硒多糖等形式存在[15]。羊肚菌菌絲體富硒培養(yǎng)相比于常規(guī)培養(yǎng)，其菌絲體多糖具有更高的體外抗氧化作用[16]，且菌絲體兼具硒的生物活性，價(jià)值更高。

隨著富硒食用菌優(yōu)勢的逐漸顯現(xiàn)，其價(jià)值漸被認(rèn)可，隨著富硒食用菌優(yōu)勢的逐漸顯現(xiàn)，其價(jià)值漸被認(rèn)可，相關(guān)研究增多。如有學(xué)者研究表明，低濃度的亞硒酸鈉對靈芝菌絲具有促進(jìn)作用，靈芝斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí)最佳亞硒酸鈉濃度為0.05 g/L[17]；白靈菇母種培養(yǎng)基和培養(yǎng)料中添加40～80 mg/kg 亞硒酸鈉能提高菌種質(zhì)量，促進(jìn)菌絲生長，提高子實(shí)體富硒能力和產(chǎn)量[18]。

現(xiàn)階段關(guān)于富硒羊肚菌的研究主要集中在菌絲體發(fā)酵培養(yǎng)階段，且菌株間存在較大差異。李娟[19]報(bào)道泰山羊肚菌液體培養(yǎng)最適硒離子濃度為200 mg/kg，此時(shí)菌絲體有機(jī)硒含量比對照提高145 倍。冮潔等[20]報(bào)道，羊肚菌液體培養(yǎng)的適宜亞硒酸鈉濃度為10 mg/L。張躍非[16]研究發(fā)現(xiàn)，亞硒酸鈉濃度為9 g/L 時(shí)羊肚菌菌絲體生物量最高，超過11 g/L時(shí)菌絲體生物量有所下降，但在5 g/L 時(shí)，菌絲體富硒率高于生物量最高時(shí)的富硒率。

本研究結(jié)果表明，母種培養(yǎng)基中，納米硒添加量低于0.416 mg/L 時(shí)，六妹羊肚菌菌絲能夠正常生長；添加量≥0.832 mg/L 時(shí)，則呈現(xiàn)出顯著的抑制作用；添加量為0.104 mg/L 時(shí)，菌絲生長快而旺盛，菌絲體密度大，是六妹羊肚菌母種培養(yǎng)基的最佳納米硒添加量。