張 嫻，陳春宇，何 綱，甄沛林

非結(jié)核分枝桿菌（non-tuberculous mycobacteria，NTM） 是分枝桿菌屬內(nèi)不包括結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群（mycobacterium tuberculosis complex，MBTC） 和麻風(fēng)分枝桿菌以外的其他分枝桿菌，到目前為止至少存在190 余種NTM[1]。Xu D 等[2]一項(xiàng)報(bào)告顯示，在中國結(jié)核病疑似患者中，NTM 感染率從1.60 %（2004年～2009年）到3.13%（2012年～2017年），提示近年來NTM 的感染呈明顯增加的趨勢[3～8]。不僅如此，NTM病與結(jié)核病在臨床癥狀和影像學(xué)表現(xiàn)上均十分相似，同時(shí)NTM 在痰標(biāo)本涂片抗酸桿菌檢查上可呈陽性，因此臨床上NTM 病容易被誤診為結(jié)核病[9]。由于NTM 對臨床上常用的抗結(jié)核藥耐藥[10，11]，因此及早識別出NTM的感染至關(guān)重要。然而傳統(tǒng)檢測NTM 的方法操作需要2～3 個(gè)月，操作復(fù)雜，無法滿足臨床的實(shí)際需求，亟待使用和推廣新型的診斷技術(shù)。近年來隨著以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) （polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)技術(shù)不斷發(fā)展，極大地促進(jìn)了NTM 檢測技術(shù)的進(jìn)步。

PCR 技術(shù)基本原理是利用各種分枝桿菌特異的DNA 引物對待檢的DNA 序列進(jìn)行體外擴(kuò)增，根據(jù)擴(kuò)增的、特異的DNA 片段對分枝桿菌進(jìn)行鑒定。PCR技術(shù)對實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境要求較高，樣品易被污染，產(chǎn)生假陽性或非特異性擴(kuò)增的結(jié)果[12]。因此，在此基礎(chǔ)上發(fā)展延伸的用于檢測分枝桿菌的各項(xiàng)技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。筆者將對以PCR 技術(shù)為基礎(chǔ)的分子診斷技術(shù)在NTM 檢測中的進(jìn)展進(jìn)行系統(tǒng)綜述。

1 基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物的現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)

1.1 限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)

限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction linked restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）技術(shù)是選取分枝桿菌的一段特異的基因序列進(jìn)行擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶消化后再進(jìn)行凝膠電泳分析，電泳產(chǎn)生不同的酶切指紋圖譜，通過分析電泳圖譜對分枝桿菌菌種進(jìn)行鑒定。常用于PCR-RFLP 診斷分枝桿菌的靶基因序列有65 kDa 熱休克蛋白編碼基因（65-kDa heat shock protein gene，hsp65）、rpoB 基因 IS6110、16S -23S rRNA 基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal trans scribed spacer，ITS）序列、16S rRNA 基因等[13]。Ong CS 等[14]分別使用PRA-hsp65 和PRA-rpoB 對90 株NTM 菌株進(jìn)行鑒定，PRA-hsp65 鑒定出83 株菌株 （占92.2 %），PRA-rpoB 鑒定出78 株菌株（占86.7%）；對于47 種快生長非結(jié)核分枝桿菌（rapidly growing non-tuberculous mycobacteria，RGM） 菌種，PRA-hsp65 鑒定出的菌種數(shù)量（占89.4%）少于PRA-rpoB（占95.7%），但是對于23 種慢生長非結(jié)核分枝桿菌 （slowly growing non-tuberculous mycobacteria，SGM）菌種，PRA-hsp65可鑒定出91.3%，而PRA-rpoB 僅鑒定出52.5%，提示PRA-hsp65 比PRA-rpoB 在鑒定分枝桿菌菌種時(shí)鑒別準(zhǔn)確度更高，特別是對SGM 的鑒定。Huang CC 等[15]一項(xiàng)研究分析376 株痰標(biāo)本涂片抗酸桿菌檢查陽性的分枝桿菌培養(yǎng)物，包括200 株MBTC 和176 株NTM。聯(lián)合利用PRA-rpoB 和PRA-hsp65，鑒定MTBC 的準(zhǔn)確率為100%（200 株菌株），鑒定NTM 的準(zhǔn)確率為91.4%（161 株菌株）。該研究表明，聯(lián)合利用PRArpoB 和PRA-hsp65 可提高NTM 檢測的準(zhǔn)確率。然而，PCR-RFLP 在用凝膠電泳進(jìn)行分析時(shí)，很難區(qū)分大小幾乎相同的條帶，也不能對小于60 bps 的條帶進(jìn)行區(qū)分[16]。此外，由于缺少標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一的操作方法，不同的操作方法也會造成不同的識別結(jié)果。

1.2 分子線性探針技術(shù)

最常用的直接探針雜交測定法是美國Gen-Probe 公司的Accuprobe 基因探針。Accuprobe 基因探針技術(shù)鑒定的菌種數(shù)量有限，僅可鑒定4 種分枝桿菌菌種和2 種分枝桿菌復(fù)合群，包括MBTC、鳥分枝桿菌復(fù)合群、胞內(nèi)分枝桿菌、戈登分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌和鳥分枝桿菌，其可鑒定的NTM 菌種數(shù)量有限[17]。而新一代分子雜交技術(shù)是分子線性探針技術(shù)（Hain技術(shù)），可鑒定的菌種種類與直接探針雜交測定法相比明顯增加。

分子線性探針技術(shù)是首先使用PCR 擴(kuò)增目的基因片段，然后用固定在膜上的特異性探針與擴(kuò)增產(chǎn)物雜交，最后通過判斷顯色反應(yīng)的結(jié)果鑒定分枝桿菌菌種?，F(xiàn)有的商業(yè)探針主要有3 種：比利時(shí)Innogenetics公司生產(chǎn)的INNO LiPA 試劑盒、德國Hain Lifescience公司生產(chǎn)的GenoType Mycobacterium CM/AS 試劑盒、西班牙Vincel 公司生產(chǎn)的Speed-Oligo Mycobacteria試劑盒。它們的靶基因序列分別位于16S-23S rRNA ITS、23S rRNA 基因、16S rRNA 基因和16S-23S rRNA ITS。其中GenoType Mycobacterium CM/AS 試劑盒最為常用。CM 試劑盒可識別以下分枝桿菌菌種：MBTC、鳥分枝桿菌、龜分枝桿菌、膿腫分枝桿菌、偶發(fā)分枝桿菌、戈登分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌、瘰疬分枝桿菌、插入分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、瑪爾摩分枝桿菌、海分枝桿菌/潰瘍分枝桿菌、外來分枝桿菌、蟾分枝桿菌，而AS 試劑盒進(jìn)行第二次雜交，對相對少見的NTM 的鑒定，包括猿分枝桿菌、黏液分枝桿菌、戈地分枝桿菌、隱藏分枝桿菌、恥垢分枝桿菌、日內(nèi)瓦分枝桿菌、緩黃分枝桿菌、M.heckeshornense、蘇爾加分枝桿菌、草分枝桿菌、嗜血分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、潰瘍分枝桿菌、胃分枝桿菌、亞洲分枝桿菌、下出分枝桿菌[18]。Lee AS 等[19]利用GenoType Mycobacterium CM/AS 試劑盒對131 株NTM 菌株和19 株對照菌株進(jìn)行鑒定，對照菌株包括14 種分枝桿菌菌種和5 種其他菌種。GenoType Mycobacterium CM/AS 試劑盒正確的鑒定了131 株NTM 菌株中的119 株，占90.8%（119/131），其中GenoType 分枝桿菌CM 試紙正確鑒定出87 株，占66.4%（87/131），AS 條用于鑒定其余的44 株NTM 菌株，包括CM 試紙無法區(qū)分2個(gè)密切相關(guān)的菌種，包括海分枝桿菌和潰瘍分枝桿菌、嗜血分枝桿菌和瑪爾摩分枝桿菌。該研究表明GenoType Mycobacterium CM/AS 試劑盒具有快速、準(zhǔn)確度較高、鑒定范圍廣、技術(shù)要求較低等優(yōu)點(diǎn)。

1.3 熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)熔解曲線法

熒光定量PCR 熔解曲線法的基本原理是在PCR擴(kuò)增反應(yīng)完成后，對PCR 產(chǎn)物進(jìn)行加熱，隨著反應(yīng)中雙鏈DNA 逐漸解鏈，熒光信號逐漸降低，當(dāng)加熱的溫度超過雙鏈DNA 解鏈50%的溫度（melting temperature，Tm）時(shí)，雙鏈DNA 迅速解鏈，熒光信號驟降，形成熒光信號曲線上變化的拐點(diǎn)。對熒光信號曲線進(jìn)行負(fù)一階求導(dǎo)得到熔解曲線圖，熔解曲線峰值對應(yīng)的溫度就是雙鏈DNA 的Tm 值。廈門致善生物科技股份有限公司發(fā)布了MeltPro 分枝桿菌測定法[20]，該方法基于獨(dú)特的多色探針溶解曲線分析技術(shù)及“熒光-熔點(diǎn)”二維標(biāo)簽技術(shù)，可在一個(gè)PCR 反應(yīng)管內(nèi)鑒別臨床上常見的分枝桿菌，包括牛分枝桿菌、恥垢分枝桿菌、海分枝桿菌/潰瘍分枝桿菌、瘰疬分枝桿菌、結(jié)核分枝桿菌、猿分枝桿菌、緩黃分枝桿菌、龜分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、戈登分枝桿菌、膿腫分枝桿菌、偶然分枝桿菌、土地分枝桿菌、蘇爾加分枝桿菌、瑪爾摩分枝桿菌、蟾分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌、鳥分枝桿菌，具有高通量、操作簡單、閉管檢測等優(yōu)點(diǎn)。在臨床檢測中，熒光定量PCR 熔解曲線法存在一定的局限性：①標(biāo)準(zhǔn)曲線很容易受到各種因素的影響，如引物或探針設(shè)計(jì)不合理、引物之間或者引物與探針的比例不合適、Taq 酶的效率、熒光染料的濃度和PCR 產(chǎn)物片段的長度等；②部分標(biāo)本中存在反應(yīng)抑制劑，如血液抗凝劑、甲醛等，降低了擴(kuò)增效率，影響Ct 值；③熒光定量PCR 熔解曲線法是相對定量的方式，因此在不同的模板濃度及低拷貝靶分子的條件下，其檢測精確度、靈敏度均會受到影響，這也是當(dāng)前熒光定量PCR 的最大缺陷。

1.4 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-基因測序法

DNA 測序被認(rèn)為是鑒定NTM 菌種的“金標(biāo)準(zhǔn)”，主要是擴(kuò)增分枝桿菌特異的DNA 序列后直接測序，與基因庫對比得到鑒定結(jié)果，可將分枝桿菌鑒定至種或亞種水平，速度較快，分辨率較高，但費(fèi)用高，難以在臨床上推廣使用。幾種用于NTM 菌種鑒定的常見靶基因詳述如下。

1.4.1 16S rRNA 基因

16S rRNA 基因約有1 500 個(gè)的核苷酸序列，5＇端序列大約有500 bps，在結(jié)構(gòu)上高度保守，只有少量的核苷酸序列出現(xiàn)改變，這些改變的核苷酸序列含有分枝桿菌菌屬或種的特異性，可將分枝桿菌鑒定至種甚至亞種水平，因此16S rRNA 基因測序廣泛用于分枝桿菌菌種的鑒定[21]。16S rRNA 基因測序具有一定的局限性，無法對具有相同高可變區(qū)的分枝桿菌或16S rRNA 基因相同的分枝桿菌進(jìn)行鑒別，比如膿腫分枝桿菌與龜分枝桿菌[21，22]。

1.4.2 65 kDa 熱休克蛋白編碼基因

hsp65 主要通過使用441 bp 大小的hsp65 基因片段來區(qū)分密切相關(guān)的NTM 菌種[22]。hsp65 在分枝桿菌中的保守性比16S rRNA 基因序列低，因此鑒定菌種的準(zhǔn)確度更高，比如可鑒別16S rRNA 基因序列無法鑒別的膿腫分枝桿菌、龜分枝桿菌等某些NTM[22]。然而，目前沒有用于比較序列結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)庫，只有網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫。網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫提供的有關(guān)hsp65 基因序列的信息不僅可能存在信息不全的問題，還可能出現(xiàn)錯(cuò)誤，造成錯(cuò)誤的鑒定結(jié)果。

1.4.3 rpoB 基因

PCR-基因測序法一般擴(kuò)增rpoB 基因360 bp 片段來鑒別分枝桿菌，與16S rRNA 基因相比，rpoB 基因序列足夠小，可以直接在兩個(gè)方向同時(shí)進(jìn)行測序，且包含足夠的信息來區(qū)分目前已知的大多數(shù)分枝桿菌[22]。此外，rpoB 基因序列不僅能識別常見的NTM 菌種及區(qū)分部分16S rRNA 基因無法區(qū)分的分枝桿菌[21]，還能識別更多罕見的NTM 菌種，因此rpoB 基因測序推薦和16S rRNA 基因測序聯(lián)合使用，以提高對NTM菌種鑒定的辨別能力。

1.4.4 其他的同源序列

除了上述3 個(gè)基因序列以外，還有其他常見的同源基因序列，如Erm、DnaJ、see A1 等。Erm（41）通常存在于膿腫分枝桿菌膿腫亞種及膿腫分枝桿菌博萊亞種中，可將膿腫分枝桿菌鑒定至亞種水平[23，24]。

2 在常規(guī)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)基礎(chǔ)上改進(jìn)的新型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增技術(shù)

2.1 巢式聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)

巢式PCR 是通過兩輪PCR 反應(yīng)，使用兩套引物擴(kuò)增特異性的DNA 片段，因此巢式PCR 的擴(kuò)增非常具有特異性。Wu TL 等[25]開發(fā)出一種新的NTM 測定方法：巢式PCR 限制性片段長度多態(tài)性分析（nested PCR-restriction fragment length polymorphism analysis，nested-PRA）。該研究把以hsp65 為靶基因的nested-PRA 與傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法及16S rRNA 基因測序鑒定比較，分析204 份涂片陽性和培養(yǎng)陽性的痰標(biāo)本，這些痰標(biāo)本根據(jù)抗酸桿菌（acid-fast bacillus，AFB）染色等級分為稀少/1+、2+或3+。nested-PRA 的檢測表明，AFB 3+、AFB 2+和AFB 1+樣品的識別率分別為100%，95%和53%，總體識別率為89%，且nested-PRA 得到的菌種鑒定結(jié)果與培養(yǎng)和16S rRNA 基因測序的結(jié)果一致，提示nested-PRA 的診斷效能較高，在結(jié)核病高度流行的地區(qū)，此方法具有極大的臨床應(yīng)用價(jià)值。

2.2 多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)

多重PCR 是在同一PCR 反應(yīng)體系中加上兩對以上引物，同時(shí)擴(kuò)增出多個(gè)核酸片段的PCR 反應(yīng)。韓國Kim MJ 等[26]研發(fā)了兩步九重PCR 檢測方法，在第1 步的九重PCR 檢測鳥分枝桿菌和胞內(nèi)分枝桿菌，第2 步的九重PCR 檢測堪薩斯分枝桿菌、偶發(fā)分枝桿菌、膿腫分枝桿菌和M.massiliense，該研究將兩步九重PCR 和基于多基因序列分析來鑒定320 個(gè)臨床樣本中的NTM 菌株，兩步九重PCR 檢測方法可鑒定超過95%的NTM 菌株[26]。Kim MJ 等[27]開發(fā)了一種五重實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測，該方法可檢測20 種分枝桿菌，包括MBTC、鳥分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌、偶發(fā)分枝桿菌、膿腫分枝桿菌、龜分枝桿菌、外來分枝桿菌、胃分枝桿菌、戈登分枝桿菌、土地分枝桿菌、蘇爾加分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、潰瘍分枝桿菌、膿毒性分枝桿菌、黏液分枝桿菌、隱藏分枝桿菌、恥垢分枝桿菌、蟾分枝桿菌、海分枝桿菌/潰瘍分枝桿菌、瘰疬分枝桿菌，并對來自1 437 例疑似結(jié)核感染患者的3 334 個(gè)臨床樣本進(jìn)行五重實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測。研究結(jié)果顯示，五重實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測MBTC的臨床樣本的靈敏度、特異度分別為87.5%、99.6%，檢測NTM 的臨床樣本的靈敏度、特異度分別為53.3%、99.9%。表明多重PCR 在鑒別MBTC 和NTM 的特異度高，具有明顯的優(yōu)勢；盡管多重PCR 對NTM 病的診斷靈敏度有限，但仍可作為一項(xiàng)快速區(qū)分結(jié)核病和NTM 病的檢測技術(shù)。

3 快速檢測標(biāo)本、無需擴(kuò)增后鑒定產(chǎn)物的新型PCR 技術(shù)

3.1 熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)

第2 代PCR 技術(shù)實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time fluorescence quantify polymerase chain reaction，real-time FQ-PCR）技術(shù)是把熒光基團(tuán)加入PCR反應(yīng)體系中，通過熒光信號的積累來實(shí)時(shí)監(jiān)測PCR的進(jìn)程，進(jìn)而得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，模板DNA 可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線來進(jìn)行定量分析，避免擴(kuò)增后進(jìn)行復(fù)雜的定量檢測工作。韓國Jung YJ 等[28]一項(xiàng)前瞻性研究對100 個(gè)臨床樣本使用常規(guī)PCR 檢測和3 種實(shí)時(shí)PCR 檢測（AdvanSure 試劑盒、Genedia 試劑盒、Real-Q 試劑盒）分析了85 種類型菌株和100 份分枝桿菌培養(yǎng)基的培養(yǎng)產(chǎn)物，菌株的準(zhǔn)確率分別為89.4%、100.0%、98.8%和98.8%，PCR 檢測的總體靈敏度都高于95%，3 種real-time FQ-PCR 檢測在區(qū)分分枝桿菌菌種和非分枝桿菌屬物種方面均比傳統(tǒng)PCR 檢測具有更好的特異度。Real-time FQ-PCR 不僅具有特異性強(qiáng)、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，而且real-time FQ-PCR 基因擴(kuò)增和產(chǎn)物分析可在一個(gè)反應(yīng)管內(nèi)進(jìn)行，擴(kuò)增和檢測一步完成，不用開蓋，減少核酸被污染的風(fēng)險(xiǎn)，不需要后期處理，操作簡單、安全、無污染。

3.2 數(shù)字聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)

數(shù)字聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) （digital polymerase chain reaction，dPCR） 技術(shù)是基于傳統(tǒng)PCR、real-time FQPCR 基礎(chǔ)上發(fā)展起來的第3 代PCR 技術(shù)，通過結(jié)合泊松分布統(tǒng)計(jì)和有限稀釋對DNA 分子進(jìn)行量化，實(shí)現(xiàn)精確的絕對定量檢測。dPCR 的技術(shù)原理是把單個(gè)DNA 分子置于獨(dú)立的反應(yīng)室中進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，利用TaqMan 探針法或染料法檢測特定的靶序列[29]。相比于前兩代PCR 技術(shù)，dPCR 是單分子擴(kuò)增技術(shù)，可以提供樣本細(xì)菌數(shù)量的直接計(jì)數(shù)，提高檢測的靈敏度；同時(shí)，隨著反應(yīng)室的增加，反應(yīng)受到抑制劑的影響就越??；此外，dPCR 無需制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可實(shí)現(xiàn)更靈敏、更精確的絕對定量。宋能等[30]使用dPCR 檢測到26 例結(jié)核病患者血液中的CFP10 DNA 或Rv1768 DNA，結(jié)果表明使用dPCR 的靈敏度、特異度和檢出率均為100%，使用real-time FQ-PCR 的靈敏度、特異度和檢出率分別為65%、100%和65%，對于痰標(biāo)本涂片抗酸桿菌檢查和痰培養(yǎng)，靈敏度分別僅為23%和58%，表明dPCR 比real-time FQ-PCR、痰標(biāo)本涂片抗酸桿菌檢查和痰培養(yǎng)對TB 診斷具有更高的靈敏度。不僅如此，該研究[30]還顯示CFP10 DNA 的檢測限值對于dPCR 為1.2 cp/μL，而對于real-time FQPCR 為15.8 cp/μL，提示dPCR 與real-time FQ-PCR相比還可以更準(zhǔn)確地檢測血液中的極少量的核酸[31]。

dPCR 作為一項(xiàng)新型的PCR 核酸檢測技術(shù)，具有準(zhǔn)確度高、靈敏度高、絕對定量等優(yōu)點(diǎn)，在臨床檢驗(yàn)具有明顯的優(yōu)勢，但目前利用dPCR 技術(shù)檢測NTM 的研究鮮有報(bào)道，值得進(jìn)一步探討和研究。

4 結(jié)語

近年來，隨著PCR 技術(shù)的不斷發(fā)展，涌現(xiàn)出一批新的分枝桿菌菌種鑒定的新技術(shù)，如PCR-基因測序、線性探針、dPCR 等技術(shù)，與傳統(tǒng)的NTM 培養(yǎng)等技術(shù)相比，具有快速、操作簡便、鑒定準(zhǔn)確等優(yōu)勢。基于PCR 的現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)在NTM 菌種鑒定方面具有巨大的應(yīng)用前景，相信在未來將更加完善這些鑒定方法，給臨床治療提供指導(dǎo)。