關(guān)文怡 譚 晨 王喜順

1.北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院，北京 102442；2.北京勤邦生物技術(shù)有限公司，北京 102206；3.北京市延慶區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，北京 102100

隨著養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展，家禽個體間密切接觸，病原廣泛分布，使得禽病表現(xiàn)出疾病種類多、群發(fā)性強(qiáng)、并發(fā)癥多、繼發(fā)感染復(fù)雜的特點(diǎn)，僅依靠流行病學(xué)、臨床癥狀、病理剖檢等方法已不能作出準(zhǔn)確的診斷，實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)已成為準(zhǔn)確診斷禽病的重要依據(jù)。血液樣品的采集、制備與保存是實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)工作的重要準(zhǔn)備，是保證準(zhǔn)確診斷的基本條件。因此，家禽血液樣本的采集技術(shù)、制備方法、保存條件及準(zhǔn)確應(yīng)用是禽病實(shí)驗(yàn)室診斷和禽病監(jiān)測的核心技術(shù)，是獸醫(yī)及時作出診斷結(jié)論、評估禽群免疫抗體水平、掌握疾病與疫情動態(tài)的科學(xué)依據(jù)。

1 禽病的實(shí)驗(yàn)室診斷

常見禽病主要有禽傳染病、禽寄生蟲病和禽常見代謝與中毒病。在禽病日常診斷中，大多通過流行病學(xué)診斷、臨床檢查、病理剖檢診斷可對一般禽病作出初診，但當(dāng)禽病未出現(xiàn)典型癥狀和病理變化時或需要作出確診時，就需要借助實(shí)驗(yàn)室方法進(jìn)行診斷。禽病的實(shí)驗(yàn)室診斷包括病原學(xué)診斷和血清學(xué)診斷2 種方法[1]。

1.1 病原學(xué)診斷

禽病的病原學(xué)診斷包括禽病的細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)、禽病的病毒學(xué)檢驗(yàn)和禽寄生蟲病檢驗(yàn)3 部分。細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)的主要方法有細(xì)菌的涂片、染色、鏡檢，細(xì)菌的生化特性鑒定和藥敏試驗(yàn)等。病毒學(xué)檢驗(yàn)主要是通過動物接種、雞胚培養(yǎng)和組織細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行病毒的分離培養(yǎng)及通過電鏡檢查、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、沉淀反應(yīng)、熒光抗體和酶標(biāo)抗體檢測等方法進(jìn)行病毒的鑒定。禽寄生蟲病檢驗(yàn)主要是用涂片法、沉淀法、漂浮法進(jìn)行的蟲卵檢查和分離法、培養(yǎng)法、染色法進(jìn)行的蟲體檢查等方法。

1.2 血清學(xué)診斷

血清學(xué)診斷是利用免疫學(xué)中抗原抗體反應(yīng)為基本原理的一類用于細(xì)菌、病毒、寄生蟲的分類、鑒定及抗原分析等方面的診斷技術(shù)。用已知的抗體對分離獲得的病原體進(jìn)行鑒定，也可用已知的抗原對已康復(fù)的或隱性感染的家禽及免疫接種后的家禽的抗體進(jìn)行定性或定量的測定。主要技術(shù)包括凝集試驗(yàn)、沉淀試驗(yàn)、血凝與血凝抑制試驗(yàn)、紅細(xì)胞吸附與吸附抵制試驗(yàn)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、病毒中和試驗(yàn)和免疫標(biāo)記技術(shù)等。

2 家禽采血技術(shù)

在禽病的診斷、治療、疫情監(jiān)測、免疫抗體水平監(jiān)測工作中，都需要采集家禽的血液樣本進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)。采血方法的選擇，主要取決于采血的目的、所需血樣或血清的數(shù)量以及家禽的種類、年齡等。家禽的采血方法主要有以下幾種[2]。

2.1 冠髯采血

冠髯采血指將冠髯消毒后，用針頭直接刺破冠髯，擠出血液的采血方式。此法適用于用血量少、直接取用的試驗(yàn)項目，多用于全血平板凝集試驗(yàn)、血細(xì)胞性狀檢查、寄生蟲和微生物的血涂片檢查等。

2.2 跖骨內(nèi)側(cè)靜脈采血

跖骨內(nèi)側(cè)靜脈采血，指在消毒跖骨內(nèi)側(cè)靜脈的一定范圍，持注射器與跖骨皮膚呈10°角順跖骨內(nèi)側(cè)靜脈方向進(jìn)針取血。適用于水禽和4 周齡內(nèi)雛禽。

2.3 靜脈采血

家禽靜脈采血有翅靜脈采血和頸靜脈采血2種方式。由于家禽頸靜脈采血技術(shù)要求高，左右手配合要得當(dāng)，力度適當(dāng)才能完成，因此，臨床常用翅靜脈采血。翅靜脈采血是將翼下靜脈術(shù)部消毒后，由翼根的肌肉處進(jìn)針，向翅膀方向斜向刺入翼下靜脈，抽取血液的方式。此法可一次取血5～8 mL，用于用血量較大的試驗(yàn)，多用于血凝與血凝抑制試驗(yàn)中的紅細(xì)胞懸液配備及其他血清學(xué)檢查中禽血清的制備[3]。

2.4 心臟采血

家禽心臟采血分為雛雞心臟采血和成年雞心臟采血2 種方式。

1）雛雞心臟采血。將雞的鎖骨胸腔入口處消毒，持采血器以平行于頸椎的方式從胸腔入口處進(jìn)針，抽取血液。此法取血量少于2 mL，適合5 周齡以下的雛雞。

2）成年雞心臟采血。將左胸壁消毒，持采血器于胸骨嵴突與肩胛骨末端連線中點(diǎn)處垂直進(jìn)針，抽取血液。此法采血量大，出血快，適用于2 月齡以上的成年雞和用血量大的試驗(yàn)。

3 血液樣本在實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)中的應(yīng)用

在獸醫(yī)臨床檢驗(yàn)中，血液樣本分為全血、血漿、血清3 種[4]。

3.1 全血的應(yīng)用

全血是將血液采集到采血器材內(nèi)所形成的混合物，包括血細(xì)胞和血漿的所有成分，適用于臨床血液學(xué)檢查。在禽病診斷中應(yīng)用全血的項目主要有血液涂片檢查、血常規(guī)檢查、全血平板凝集試驗(yàn)、紅細(xì)胞懸液制備等。

1）血液涂片檢查。制備血液涂片用血量少，可采用刺破冠髯、腳蹼皮下靜脈等組織，以接種環(huán)或吸管直接取新鮮的血液，在載玻片上推出一層薄、透、均的血膜，經(jīng)瑞姬氏法染色后，用顯微鏡檢查。此方法可用于禽細(xì)菌性疾病的診斷，如大腸桿菌、禽霍亂、彎曲桿菌病、葡萄球菌病、鴨疫里氏桿菌病等，以及禽住白細(xì)胞蟲病的檢查。

2）血常規(guī)檢查。進(jìn)行血常規(guī)檢查時用血量少，若可以在實(shí)驗(yàn)室采血，可采用刺破冠髯、腳蹼皮下靜脈等組織，以毛細(xì)吸管直接取新鮮的全血，放入全自動血液細(xì)胞分析儀中，測定血常規(guī)指標(biāo)。若需采血送檢，可采用翅靜脈采血，采血器中加抗凝劑，將抗凝全血送至實(shí)驗(yàn)室檢測。此方法可為禽鐵缺乏癥、中毒?。拮扬炛卸?、魚粉中毒）等確診提供依據(jù)。

3）全血平板凝集試驗(yàn)。進(jìn)行平板凝集試驗(yàn)時用血量少，可采用刺破冠髯、腳蹼皮下靜脈或翅靜脈采血，取全血50 μL 與抗原50 μL 均勻混合，出現(xiàn)顆粒狀、片狀或團(tuán)塊狀凝集時，判定為陽性反應(yīng)。此方法用于雞白痢沙門氏菌病、雞毒支原體感染的診斷，也用于禽結(jié)核的檢疫。

4）紅細(xì)胞懸液制備。在進(jìn)行部分凝集試驗(yàn)和吸附試驗(yàn)時，需滴加紅細(xì)胞懸液，制備紅細(xì)胞懸液可采用翅靜脈或心臟采血，需血量較大，采集需要量的抗凝血，注入離心管中，加入等體積的阿氏液混合，用中性PBS 液洗滌3 次，將洗滌后的紅細(xì)胞配成試驗(yàn)所需的雞紅細(xì)胞懸液。此方法主要用于間接血凝試驗(yàn)和間接血凝抑制試驗(yàn)、血凝試驗(yàn)和血凝抑制試驗(yàn)及紅細(xì)胞吸附和紅細(xì)胞吸附抑制試驗(yàn)等。

3.2 血漿的應(yīng)用

血漿是離開血管的全血經(jīng)抗凝處理后，通過離心沉淀所獲得的不含細(xì)胞成分的液體，適用于血漿生理性和病理性化學(xué)成分的測定?？刹捎贸犰o脈或心臟采血，需血量較大，采集需要量的抗凝血，注入離心管中，經(jīng)離心分離取上層淡黃色液體，放入全自動血液生化儀中測定目標(biāo)項。此方法可為禽中毒病（食鹽中毒）、營養(yǎng)缺乏癥、維生素缺乏癥、微量元素缺乏癥等病癥的確診提供依據(jù)。

3.3 血清的應(yīng)用

血清是離體的血液凝固之后，經(jīng)血凝塊聚縮釋出的液體，適用于臨床血清學(xué)和免疫學(xué)檢驗(yàn)?？刹捎贸犰o脈或心臟采血，需血量較大，將采取的血液樣品試管呈最大斜面傾斜，并置室溫或37 ℃溫箱或水浴中預(yù)溫0.5 h，促使血清析出。待大部分血清析出后，中速(2 000～2 500 r/min)離心5 min，分離血清。用移液器將血清吸移到另一清潔而干燥的試管里，貼上標(biāo)簽。放4 ℃冰箱保存待用，若不能及時檢測，可放入-15 ℃冰箱中凍存，需用時血清從低溫冰箱取出，經(jīng)4 ℃冰箱、室溫、37 ℃水浴條件逐步均勻融解，血清完全融解混勻后使用。解凍血清不宜反復(fù)凍融。血清在禽病診斷中主要用于以下試驗(yàn)[5]。

1）凝集試驗(yàn)。凝集反應(yīng)即細(xì)菌、紅細(xì)胞等顆粒性抗原與相應(yīng)的抗體在電解質(zhì)參與下, 抗原顆粒相互凝集形成團(tuán)塊，這種現(xiàn)象稱為凝集反應(yīng)。參與反應(yīng)的抗體稱為凝集素，抗原稱凝集原。常有平板法、試管法、玻片法及微量凝集法等。可用于禽傳染性鼻炎、禽彎曲桿菌病、禽傳染性滑膜炎等病的診斷。

2）沉淀試驗(yàn)?？乖c相應(yīng)的抗體在含有電解質(zhì)的瓊脂凝膠中會自由擴(kuò)散，形成肉眼可見的沉淀帶稱為免疫瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)（沉淀試驗(yàn)）。可用已知抗原沉淀未知抗體，也可用已知抗體測定未知抗原，特異性強(qiáng)，可用于禽流感、禽霍亂、雞白痢、馬立克、傳染性法氏囊炎、傳染性支氣管炎、傳染性鼻炎、傳染性腦脊髓炎、病毒性關(guān)節(jié)炎、雞包涵體肝炎、小鵝瘟等的診斷。

3）血凝(HA)和血凝抑制(HI)試驗(yàn)。某些病毒或病毒的血凝素，能選擇性地使某種或某幾種動物的紅細(xì)胞發(fā)生凝集，這種凝集紅細(xì)胞的現(xiàn)象稱為血凝（HA）。當(dāng)病毒的懸液中先加入特異性抗體，且這種抗體的量足以抑制病毒顆?；蚱溲?，則紅細(xì)胞表面的受體就不能與病毒顆?；蚱溲刂苯咏佑|。這時紅細(xì)胞的凝集現(xiàn)象就被抑制，稱為紅細(xì)胞凝集抑制（HI）反應(yīng)，也稱血凝抑制反應(yīng)。此方法可用于禽流感、新城疫、傳染性支氣管炎、產(chǎn)蛋下降綜合征、雞痘、雞毒支原體病等的診斷。

4）補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)?？扇苄钥乖c相應(yīng)抗體結(jié)合后，其抗原抗體復(fù)合物可結(jié)合補(bǔ)體，但這一反應(yīng)肉眼無法觀察到，而通過加入溶血系統(tǒng)作指示系統(tǒng)，通過觀察是否出現(xiàn)溶血，來判斷反應(yīng)系統(tǒng)是否存在相應(yīng)的抗原抗體，該過程稱補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)。參與補(bǔ)體結(jié)合的抗體稱補(bǔ)體結(jié)合抗體。此方法主要用于禽衣原體病的診斷。

5）病毒中和試驗(yàn)。中和試驗(yàn)在家禽病毒病的診斷工作中，常用于用已知病毒來檢查未知血清，也可用已知血清來鑒定未知病毒，還可用于中和抗體的效價測定，其原理：病毒（抗原）與相應(yīng)的抗體中和以后，可知病毒喪失感染力，該反應(yīng)具有高度的種、型特異性，而且一定量的病毒必須有相應(yīng)量的中和抗體才能被中和。此方法主要用于禽流感、新城疫、傳染性支氣管炎、雞痘、網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥、番鴨細(xì)小病毒病的診斷。

6）免疫檢測技術(shù)。利用某些能夠通過某種理化因素易于檢測的物質(zhì)標(biāo)記抗體，這些被標(biāo)記的抗體與相應(yīng)的抗原相結(jié)合，通過對標(biāo)記物的測定，從而為抗原定性或定量。該技術(shù)目前廣泛應(yīng)用的主要有：免疫熒光技術(shù)、免疫酶標(biāo)技術(shù)、聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)等。這些方法已用于多種禽病的檢測與診斷，如禽流感、新城疫、產(chǎn)蛋下降綜合征、網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥、傳染性腦脊髓炎、病毒性關(guān)節(jié)炎、傳染性鼻炎、小鵝瘟、鴨傳染性漿膜炎、雞毒支原體病、衣原體病等。

4 結(jié) 語

在禽病實(shí)驗(yàn)室診斷和禽病監(jiān)測的核心技術(shù)家禽血液樣本采集、制備、保存及應(yīng)用的過程中，一些細(xì)節(jié)仍需進(jìn)一步探究，如采血禽品種、日齡、性別的選擇、抗凝劑的使用、保存溫度、濕度的設(shè)定等，通過不斷實(shí)踐和應(yīng)用摸索出更精準(zhǔn)的數(shù)據(jù)，為獸醫(yī)診斷、禽群免疫抗體水平監(jiān)測、疫情動態(tài)監(jiān)控提供科學(xué)依據(jù)。