鄺瑞瑞,雷 榮,江 麗,段維軍,李雪蓮,符 娜,范在豐,李 遠,吳品珊*

(1.中國檢驗檢疫科學(xué)研究院,北京 100176;2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院,北京 100093;3.重慶醫(yī)科大學(xué)永川附屬醫(yī)院,重慶 402177;4.寧波檢驗檢疫科學(xué)技術(shù)研究院,寧波 315012;5.伊犁師范大學(xué),伊犁 835000)

向日葵是我國重要的油料作物之一,栽培面積僅次于大豆和油菜,不僅具有重要的經(jīng)濟價值[1],還有觀賞價值、藥用價值[2]。根據(jù)中國海關(guān)統(tǒng)計數(shù)據(jù),我國每年需要進口15萬t左右的向日葵種子,為防止檢疫性有害生物的傳入及擴散,需持續(xù)加強進境向日葵種子檢疫檢測和田間種植監(jiān)測,為此需不斷提升檢測技術(shù)手段和開發(fā)新技術(shù)。

向日葵黑莖病菌Leptosphaerialindquistii(Frizzi) Gruyter,Aveskamp &Verkley,無性階段為PhomamacdonaldiiBoerema[3],是向日葵上的一種毀滅性有害生物,2010年由原農(nóng)業(yè)部和原國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局(第1472公告,關(guān)于將向日葵黑莖病列為進境檢疫性有害生物的公告)列為進境檢疫性真菌。該病原菌1964年在加拿大被首次發(fā)現(xiàn)后[4],相繼擴展到法國、美國、阿根廷等國家和地區(qū)[3,5-6],引發(fā)的病害發(fā)生率高,產(chǎn)量損失大[7]。2007年我國新疆伊犁地區(qū)首次報道了該病原菌的局部分布[8],隨后內(nèi)蒙古等地也報道了其分布[9]。向日葵黑莖病傳播速度快,嚴(yán)重降低向日葵抗逆性,造成巨大的經(jīng)濟損失[10-11]。向日葵黑莖病初期危害植株葉柄基部,然后擴展到莖稈形成橢圓形、邊緣清晰的黑色病斑,嚴(yán)重時環(huán)繞莖稈造成植株倒伏,葉片枯萎、花盤瘦弱,減產(chǎn)嚴(yán)重[12-13]。

目前對向日葵黑莖病菌的檢疫鑒定,按照出入境檢驗檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《向日葵黑莖病菌檢疫鑒定方法》(SN/T 3174-2012)[14]進行,包括分檢、挑選帶病組織進行分離培養(yǎng)、形態(tài)學(xué)觀察、核酸提取、利用通用引物ITS1/ITS4 或ActF1/ActR1進行擴增、測序及序列比對。其他已報道的檢測技術(shù)包括根據(jù)向日葵黑莖病菌ITS序列特異位點設(shè)計的特異引物320FOR/320REV[15]和LEPB/LEPF[16],以及基于Actin基因設(shè)計的LLF/LLR[17]引物進行PCR檢測等。實時熒光PCR具有不易污染、操作簡單、靈敏度高、特異性強等優(yōu)點[18]，但是需要專門的儀器,耗時較長,不適于田間野外的現(xiàn)場檢測。環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)在60～65℃等溫條件下反應(yīng),可與比色法結(jié)合,檢測向日葵黑莖病菌的靈敏度為10個分生孢子/g向日葵種子[19],但是反應(yīng)溫度較高,需要多對引物,引物設(shè)計復(fù)雜,要求高。

重組酶聚合酶擴增技術(shù)(recombinase polymerase amplification,RPA)是一種仿照T4噬菌體的體外核酸等溫擴增方法。該技術(shù)無需造價高昂的升降溫儀器,僅需一對引物,即可在37～42℃恒溫條件下,對目標(biāo)DNA進行快速的指數(shù)級擴增[27]，降低了設(shè)備需求,反應(yīng)速度更快,靈敏度高和特異性強,是現(xiàn)場快速檢測優(yōu)選的核酸擴增技術(shù)。CRISPR-Cas系統(tǒng)由成簇規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)及CRISPR相關(guān)蛋白(CRISPR associated protein,Cas)構(gòu)成[20],已被廣泛用于病原物檢測[21],但在植物真菌病害上的應(yīng)用較少[22-24]。Cas12a是第二類Ⅴ型CRISPR RNA (CvRNA) 引導(dǎo)的一種核酸內(nèi)切酶[25],在crRNA引導(dǎo)下識別原始間隔區(qū)相鄰基序(protospacer adjacent motif,PAM)(TTTN)序列下游18～25 nt的靶標(biāo)DNA,當(dāng)Cas12a/crRNA復(fù)合體靶向結(jié)合到核酸底物后,會激活非特異性的ssDNA的反式切割活性?；谶@一性質(zhì),Chen等[26]開發(fā)了一種新的DNA 檢測方法—DETECTR(DNA endonuclease targeted CRISPR trans reporter),為病害的分子診斷提供了一種新的策略。

本研究擬將RPA技術(shù)與CRISPR-Cas12a系統(tǒng)相結(jié)合(RPA/CRISPR-Cas12a),在RPA的基礎(chǔ)上進一步增加選擇性和靈敏度[28-30]。采用CRISPR-Cas12a熒光檢測和側(cè)流向試紙條檢測兩種方法,通過優(yōu)化檢測條件,建立一種快速現(xiàn)場檢測向日葵黑莖病菌的分子生物學(xué)方法,為口岸檢疫以及田間早期診斷提供新技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1供試菌株

本研究所用向日葵黑莖病菌菌株來源于從美國進口的向日葵種子中截獲的向日葵黑莖病菌以及向日葵黑莖病菌的近似種、向日葵上發(fā)生的其他真菌和一些常見真菌(表1)。

表1 本研究所用的真菌信息Table 1 Fungal isolates used in this study

1.1.2主要試劑

RPA基礎(chǔ)擴增試劑盒,英國TwistDX公司;側(cè)向流試紙條檢測試劑盒,北京寶盈同匯生物技術(shù)有限公司;DNA濃度測量試劑盒、Qubit?2.0熒光儀、Qubit?dsDNA HS Assay Kit,美國ThermoFisher Scientific公司;磁珠法植物基因組DNA提取試劑盒(DP342)、無酶無菌水、RNA酶抑制劑(40 U/μL,NG209)，天根生化科技(北京)有限公司;Cas12a，美國 NEB 公司;PerfectStart?Ⅱ Probe qPCR SuperMix，北京全式金生物技術(shù)股份有限公司。超純水取自 Milli-Q純水系統(tǒng)(德國 Millipore 公司);LightCycler480 實時熒光 PCR 儀，瑞士羅氏公司。便攜式加熱裝置為自主研發(fā)設(shè)計,委托重慶初生犢科技有限公司制造 (型號為GeneFASD-37)。所用引物序列見表2。

表2 本研究所用的引物、報告分子和探針序列Table 2 Primer,reporter and probe sequences used in this study

1.2 方法

1.2.1菌株培養(yǎng)及其基因組DNA提取

將供試菌株接種到PDA培養(yǎng)基上,25℃,L∥D=12 h∥12 h條件下培養(yǎng)5 d,收集菌絲和孢子,液氮研磨后使用植物基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA。用Qubit?2.0熒光儀和Qubit?dsDNA HS檢測試劑盒對提取DNA進行定量。

1.2.2RPA引物設(shè)計

從NCBI數(shù)據(jù)庫中下載向日葵黑莖病菌及其近似種的ITS序列,選擇特異性序列設(shè)計引物L(fēng)I-RPA-F/LI-RPA-R和LI-crRNA(表2)。引物和LI-crRNA由通用生物(安徽)股份有限公司合成。

1.2.3RPA/CRISPR-Cas檢測方法

RPA反應(yīng)擴增體系(50 μL):每個反應(yīng)管中加入29.5 μL 水化液(rehydration buffer),11.2 μL的RNAse free去離子水,10 μmol/L上游、下游引物各2.4 μL,2 μLDNA,280 mmol/L醋酸鎂2.5 μL,充分混勻后,將反應(yīng)管轉(zhuǎn)移到便攜式加熱裝置中,37℃加熱30 min。

CRISPR-Cas12a檢測采用熒光和試紙條兩種方式。熒光檢測法體系:DEPC-H2O 13.4 μL,NEBuffer 3.1 (10×)2 μL,5 μmol/L Cas12a 0.4 μL,40 U/μL RNase inhibitor 0.5 μL,0.1 mmol/L DTT 0.5 μL,5 μmol/L熒光報告分子FQ-DNA 0.8 μL,0.01 mmol/L LI-crRNA 0.4 μL,將上述溶液加到反應(yīng)管中充分混合后,取2 μL RPA擴增產(chǎn)物加至反應(yīng)管的蓋子內(nèi)側(cè),振蕩離心后,迅速將反應(yīng)管轉(zhuǎn)移到實時熒光PCR儀中,37℃加熱30 min進行熒光檢測。

側(cè)向流層析試紙條檢測體系:DEPC-H2O 12.2 μL,NEBuffer 3.1 (10×)2 μL,5 μmol/L Cas12a 0.4 μL,40 U/μL RNase inhibitor 0.5 μL,0.1 mmol/L DTT 0.5 μL,5 μmol/L側(cè)向流層析試紙條報告分子LF-DNA 2 μL,0.01 mmol/L LI-crRNA 0.4 μL,上述溶液加到反應(yīng)管中充分混合后,加入2 μL RPA擴增產(chǎn)物,振蕩離心后,將反應(yīng)管轉(zhuǎn)移到便攜式加熱裝置中,37℃加熱20 min。反應(yīng)完成后加入80 μL去離子水,混合均勻,將試紙條的樣品端插入離心管中觀察結(jié)果。

1.2.4RPA/CRISPR-Cas檢測體系的特異性

根據(jù)上述 RPA/CRISPR-Cas擴增反應(yīng)體系,以無菌水為陰性對照,采用引物對LI-RPA-F/LI-RPA-R對真菌DNA(表1)進行RPA擴增,其擴增產(chǎn)物首先用CRISPR-Cas12a熒光法檢測。再對RPA擴增產(chǎn)物采用側(cè)向流試紙條進行檢測,每個樣品設(shè)置3個重復(fù),根據(jù)檢測結(jié)果判斷檢測方法是否具有特異性。

1.2.5RPA/CRISPR-Cas檢測體系優(yōu)化

RPA擴增體系中,設(shè)置5個反應(yīng)時間,分別為10、20、25、30 min和40 min,其他條件不變。以無菌水為陰性對照,采用CRISPR-Cas12a熒光檢測,觀察不同條件下熒光信號強度。

CRISPR-Cas12a熒光檢測體系中,對熒光報告分子濃度進行優(yōu)化,設(shè)置最終報告分子濃度為50、100、200、400,800 nmol/L等5個濃度,其他條件不變。以無菌水為陰性對照,觀察不同條件下熒光信號強度。

CRISPR-Cas12a試紙條檢測體系中,對試紙條報告分子濃度,反應(yīng)時間進行優(yōu)化。在最終100 μL反應(yīng)體系中設(shè)置5個報告分子濃度:50、100、200、400,800 nmol/L。反應(yīng)時間設(shè)置5個梯度：5、10、15、20 min和30 min。保持其他條件不變,以無菌水為陰性對照,觀察不同條件下試紙條變化情況。

1.2.6RPA/CRISPR-Cas檢測體系靈敏度

將向日葵黑莖病菌DNA進行10倍梯度稀釋為 1 ng、0.1 ng、10 pg、1 pg、0.1 pg、0.01 pg,每個樣品設(shè)置3個重復(fù),按照優(yōu)化后的反應(yīng)體系進行RPA/CRISPR-Cas擴增和檢測,并與實時熒光PCR方法進行比較。

實時熒光PCR檢測體系采用段維軍等[18]設(shè)計的特異性引物L(fēng)LI1F/LLI1R和探針 LLI(表2)。引物由擎科生物合成,熒光探針和LI-crRNA由通用生物(安徽)股份有限公司合成。探針5′端含有 FAM 報告熒光染料,3′端含有不發(fā)熒光的淬滅基團并具有 MGB 分子。反應(yīng)體系:2xTaqMan PCR Master Mix 10 μL,10 μmol/L上下游引物各0.4 μL,10 μmol/L探針0.4 μL,DNA 1 μL,去離子水補充至20 μL。反應(yīng)條件:95℃ 30 s;94℃ 5 s,60℃ 1 min,循環(huán)40次。

1.2.7實際樣品檢測

抽取寧波口岸進口的來自美國、法國、哈薩克斯坦、意大利和加拿大的向日葵種子以及采自新疆伊犁的向日葵莖稈進行實際樣品檢測,將種子樣品倒入潔凈白瓷盤內(nèi),盡量挑選干癟、弱小、畸形的疑似感病種子,液氮研磨后使用植物基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA。采用本研究優(yōu)化后的RPA/CRISPR-Cas體系進行向日葵黑莖病菌檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 RPA/CRISPR-Cas12檢測向日葵黑莖病菌的特異性分析

根據(jù)向日葵黑莖病菌及其近似種的ITS序列,用DNAMAN進行多序列比對,選擇差異性大的序列設(shè)計了引物L(fēng)I-RPA-F和LI-RPA-R,通過NCBI BLAST進一步驗證擴增產(chǎn)物的特異性,擴增產(chǎn)物總長為114 bp。再結(jié)合CRISPR-Cas識別位點PAM,設(shè)計了LI-crRNA。

采用LI-RPA-F/LI-RPA-R對所有供試真菌的基因組DNA(表1)進行RPA擴增,其擴增產(chǎn)物首先用CRISPR-Cas12a熒光法檢測,結(jié)果(圖1a)顯示,向日葵黑莖病菌DNA樣品出現(xiàn)明顯的熒光信號,而其他真菌DNA的熒光信號很低。CRISPR-Cas12a試紙條測試結(jié)果(圖1b)顯示,向日葵黑莖病菌DNA樣品出現(xiàn)了明顯的質(zhì)控線(C)和檢測線(T),而空白對照及其他真菌DNA樣品僅有質(zhì)控線,無檢測線。對擴增產(chǎn)物進行測序,核苷酸序列與向日葵黑莖病菌的ITS序列一致,說明RPA/CRISPR-Cas12a的RPA引物和LI-crRNA能特異性檢測向日葵黑莖病菌,可以做進一步試驗。

圖1 向日葵黑莖病菌RPA/CRISPR-Cas12a檢測體系的特異性Fig.1 The specificity of RPA/CRISPR-Cas12a detection system for Leptosphaeria lindquistii

2.2 RPA/CRISPR-Cas檢測體系優(yōu)化

2.2.1RPA反應(yīng)時間優(yōu)化

取RPA擴增時間分別為10,20,25,30,40 min后的擴增產(chǎn)物,進行CRISPR-Cas12a熒光檢測。結(jié)果表明,CRISPR-Cas12a熒光強度隨RPA擴增時間增加而增強,而空白對照均無明顯熒光信號(圖2a)。反應(yīng)時間為30、40 min 時,CRISPR-Cas12a熒光檢測強度較高,為了滿足快速檢測的需求,采用RPA擴增時間30 min作為后續(xù)的試驗條件。

2.2.2CRISPR-Cas12a熒光檢測報告分子濃度優(yōu)化

報告分子濃度優(yōu)化結(jié)果表明,CRISPR-Cas12a熒光報告分子濃度越高,熒光強度越強,當(dāng)報告分子終濃度達到200 nmol/L以上時,可以看到明顯的熒光信號,報告分子終濃度為800 nmol/L時,熒光強度極為明顯(圖2b)?？紤]成本,故采用CRISPR-Cas12a熒光報告分子最終濃度200 nmol/L為最優(yōu)選擇。

2.2.3CRISPR-Cas12a試紙條檢測反應(yīng)時間優(yōu)化

CRISPR-Cas12a試紙條檢測反應(yīng)時間優(yōu)化結(jié)果表明,CRISPR/Cas12a反應(yīng)5 min,即可產(chǎn)生可檢測到的產(chǎn)物,顯示弱的檢測線(T線);隨CRISPR反應(yīng)時間增加,檢測線隨之加深,反應(yīng)20 min即出現(xiàn)明顯的檢測線(圖3a)。故可選擇20 min作為CRISPR/Cas12a的反應(yīng)時間。

圖2 向日葵黑莖病菌RPA/CRISPR-Cas12a熒光檢測體系的優(yōu)化Fig.2 Optimization of the RPA/CRISPR-Cas12a fluorescent detection system for Leptosphaeria lindquistii

圖3 向日葵黑莖病菌CRISPR-Cas12a試紙條檢測優(yōu)化Fig.3 Optimization of CRISPR-Cas12a lateral flow assay for Leptosphaeria lindquistii

2.2.4CRISPR-Cas12a試紙條檢測報告分子濃度優(yōu)化

在100 μL試紙條檢測體系中的LF報告分子濃度為50 nmol/L時,空白對照的檢測線有微弱紅色條帶,表現(xiàn)出假陽性。LF報告分子濃度為100 nmol/L時,空白對照的檢測限處隱約有點條帶,說明LF報告分子濃度低,容易產(chǎn)生假陽性(圖3b)。報告分子濃度高于200 nmol/L,空白對照無假陽性現(xiàn)象?？刹捎肅RISPR-Cas12a試紙條報告分子最終濃度200 nmol/L進行后續(xù)的試驗。

2.3 RPA/CRISPR-Cas檢測體系靈敏度

將提取的向日葵黑莖病菌的基因組DNA 10倍稀釋,以引物L(fēng)LI1F/LLI1R和探針LLI進行實時熒光定量PCR檢測,結(jié)果(圖4a)表明,DNA含量為1 ng、0.1 ng、10 pg、1.0 pg、0.1 pg時,都能檢測到熒光信號,表現(xiàn)為陽性擴增,3次重復(fù)試驗的平均Ct值分別為17.95,22.18,25.49,30.26和34.24。雖然0.01 pg基因組DNA產(chǎn)生弱的熒光信號,但是其Ct值為35。表明實時熒光定量PCR方法的靈敏度為0.1 pg,與文獻報道的靈敏度一致。

圖4 兩種方法檢測向日葵黑莖病菌DNA的靈敏度Fig.4 Sensitivity of two methods for detection of Leptosphaeria lindquistii DNA

利用優(yōu)化的RPA/CRISPR-Ca12a熒光法檢測相同的DNA樣品,結(jié)果表明,1 pg向日葵黑莖病菌基因組DNA產(chǎn)生明顯的熒光信號,0.1 pg DNA產(chǎn)生可被檢測的弱熒光信號(圖4b)。表明CRISPR-Cas12a熒光法的靈敏度為0.1 pg,與實時熒光PCR的靈敏度相當(dāng)。利用優(yōu)化的RPA/CRISPR-Cas試紙條檢測10倍梯度稀釋的向日葵黑莖病菌基因組DNA,結(jié)果表明,1 pg DNA產(chǎn)生弱的檢測信號,而0.1 pg DNA不能被檢測到。表明CRISPR-Cas12a試紙條的靈敏度為1 pg,低于實時熒光定量PCR和RPA/CRISPR-Cas12a熒光法。

2.4 向日葵種子樣品的檢測

采用優(yōu)化后的RPA/CRISPR-Cas體系檢測了10份從寧波口岸進口的向日葵種子,其中有2份哈薩克斯坦進口的向日葵種子,熒光法和試紙條檢測都為陽性,與實時熒光定量PCR結(jié)果相同。證明該擴增體系可以檢測來自不同地理來源的向日葵黑莖病菌,適用于口岸向日葵黑莖病菌的快速檢測(圖5)。

圖5 向日葵黑莖病菌實際樣品的檢測Fig.5 Detection of actual samples for Leptosphaeria lindquistii

3 結(jié)論與討論

快速精準(zhǔn)的檢測技術(shù)為防止檢疫性有害生物的傳入及擴散提供強有力的技術(shù)保障。為了有效防控向日葵黑莖病菌的傳播及危害[6],已建立了形態(tài)學(xué)鑒定[30-31]和分子生物學(xué)檢測技術(shù)[15,17-18,32-35]。當(dāng)前采用的分子生物學(xué)技術(shù),以普通PCR[15-17]和TaqMan實時熒光定量PCR[18]為主,雖然靈敏度高[33],但均需要專門的熱循環(huán)設(shè)備,不適合用于田間和口岸的現(xiàn)場檢測。重組酶聚合酶等溫擴增技術(shù)利用一對引物在37℃即可對核酸進行指數(shù)擴增,整個反應(yīng)過程約20 min[36]。本研究建立的CRISPR-Cas12a檢測體系也是在37℃下進行,并且在crRNA的引導(dǎo)下,識別到目標(biāo)DNA后,發(fā)揮其切割功能,因此兩者的結(jié)合,可以極大地提高RPA擴增的特異性和靈敏度。在Cas12a/crRNA反應(yīng)體系中,加入熒光報告分子(FAM-CCACCC-BHQ1),如果存在目標(biāo)序列,熒光報告分子被切割出FAM基團,就可被488 nm光源激發(fā)產(chǎn)生綠色熒光;如果不存在目標(biāo)序列,則FAM基因的熒光會被BHQ1淬滅而不產(chǎn)生綠色熒光。熒光強度大小與目標(biāo)DNA濃度正相關(guān)。由于RPA/CRISPR-Cas12a檢測體系包含RPA的指數(shù)擴增反應(yīng)和Cas12a/crRNA的酶-核酸反應(yīng),熒光強度與原始DNA模板的函數(shù)關(guān)系研究尚無報道,還需要進一步試驗。

RPA/CRISPR-Cas12a熒光檢測法靈敏度高,與TaqMan探針實時熒光定量PCR的靈敏度相當(dāng)[17],但是因為需要激發(fā)光源,易受干擾,對環(huán)境要求高,不適于野外田間檢測。側(cè)流向試紙條檢測法不需要任何儀器設(shè)備,在常溫下即可進行。在CRISPR-Cas12a反應(yīng)體系中加入試紙條報告分子(FAM-T10-Biotin),可采用金納米核酸試紙條進行檢測。當(dāng)Cas12a/crRNA識別到目標(biāo)序列時,報告分子被切割后,產(chǎn)生FAM與金納米(AuNPs)上的FAM抗體結(jié)合,在檢測線處產(chǎn)生條帶;否則AuNPs-FAM-Biotin只留在控制線處產(chǎn)生條帶。由于試紙條檢測在常溫20 min內(nèi)可完成,檢測結(jié)果用肉眼即可觀察,更適合用于野外田間檢測。

為了更好的特異性檢測,本研究采用RPA與CRISPR-Cas12a聯(lián)用的方式,先用RPA對目的基因進行指數(shù)擴增,再用Cas12a/crRNA核酶復(fù)合物進行進一步的目標(biāo)基因識別,從而極大地提高了特異性。RPA的指數(shù)擴增,同時也增加了檢測靈敏度。試驗條件優(yōu)化結(jié)果表明,RPA反應(yīng)時間越長,產(chǎn)生的擴增產(chǎn)物越多,最終的信號越強。但同時也可觀察到,RPA反應(yīng)時間為10 min時,就可檢測到產(chǎn)物。而CRISPR-Cas12a反應(yīng)15 min,就能檢測到擴增產(chǎn)物,說明RPA和CRISPR-Cas12a均為快速檢測技術(shù),可以用于病原菌的快速檢測方法開發(fā)。RPA/CRISPR-Cas12a熒光檢測操作相對復(fù)雜,且需要特定的儀器,但靈敏度高,適用于實驗室內(nèi)檢測。RPA/CRISPR-Cas12a試紙條檢測體系對環(huán)境的要求低,僅需一臺便攜式升溫儀器,恒溫條件37℃下進行反應(yīng),不需要繁瑣的瓊脂糖凝膠電泳檢測,更加簡便快捷,操作易上手,比起傳統(tǒng)的分子檢測,更適用于向日葵黑莖病菌的快速現(xiàn)場檢測、口岸檢疫等需求。