孫偉波,趙楊揚(yáng),明 亮,董靚靚,朱守衛(wèi),趙延存,劉鳳權(quán)*

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所,江蘇省食品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室-省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地,南京 210014;2.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院,合肥 230036;3.江蘇省徐州市農(nóng)業(yè)農(nóng)村綜合服務(wù)中心,徐州 221000)

我國是世界果樹產(chǎn)業(yè)第一大國,果業(yè)在保障食物安全、生態(tài)安全、農(nóng)民增收和農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展中發(fā)揮著日益重要的作用[1]。梨是我國種植范圍最廣的果樹之一,是僅次于蘋果、柑橘的第三大水果,我國梨的栽培面積和產(chǎn)量更占到了世界的近70%,梨產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展對我國乃至世界果業(yè)發(fā)展至關(guān)重要[2]。

梨火疫病(pear fire blight)是由解淀粉歐文氏菌Erwiniaamylovora引起的世界性重要植物細(xì)菌性病害,嚴(yán)重威脅梨等果樹生產(chǎn)。該病害于1780年首次報(bào)道于美國紐約,現(xiàn)已分布于北美、歐洲、非洲、大洋洲的60多個(gè)國家和地區(qū)[3]。梨火疫病菌寄主范圍廣泛,可以侵染40余屬200多種薔薇科植物;可危害梨樹的多個(gè)部位,從春季開始危害花朵,使花朵發(fā)黑萎蔫,出現(xiàn)“花腐”現(xiàn)象,擴(kuò)展至嫩梢后出現(xiàn)褐色至黑色水漬狀病斑,頂端彎曲下垂呈現(xiàn)“牧羊鞭”狀,葉片果實(shí)均會萎蔫發(fā)黑但不掉落,葉柄、果柄等部位常出現(xiàn)褐色菌膿,嚴(yán)重時(shí)整株死亡;梨火疫病傳播途徑廣泛,風(fēng)雨氣流、鳥類遷移、昆蟲授粉以及人為活動(dòng)等均可傳播,給防治帶來極大困難[3-5]。梨火疫病于2020年被我國列入《一類農(nóng)作物病蟲害名錄》,其病原菌于2007年即被列入《中華人民共和國進(jìn)境植物檢疫性有害生物名錄》,是我國重要的農(nóng)業(yè)植物檢疫性有害生物。

藥劑防治是梨火疫病的重要防治手段之一?；瘜W(xué)農(nóng)藥的長期使用不僅危害生態(tài)環(huán)境健康,還會使病原菌產(chǎn)生耐藥性,鏈霉素、土霉素等抗生素因此已被禁用[6-9]。國外開發(fā)了諸多針對梨火疫病的生物防治產(chǎn)品,如利用熒光假單胞菌PseudomonasfluorescensA506開發(fā)的“BlightBan A506”、利用泛菌Pantoeasp.開發(fā)的“BlightBan C9-1”、利用枯草芽胞桿菌BacillussubtilisQST713開發(fā)的“Serenade”等[9],均有一定規(guī)模的應(yīng)用。在我國,截至2022年5月20日,登記防治梨火疫病的產(chǎn)品有12個(gè),有效成分主要有中生菌素、春雷霉素、噻唑鋅、噻霉酮等,還包括1個(gè)復(fù)配產(chǎn)品春雷·噻唑鋅[10],藥劑種類相對較少,長期使用也容易產(chǎn)生抗藥性,因此需要不斷開發(fā)新型防控藥劑。

綠針假單胞菌PseudomonaschlororaphisTC3和抗生素溶桿菌LysobacterantibioticusOH13是本課題組分別從梨樹和水稻根際環(huán)境中分離獲得的生防細(xì)菌,前期對其次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行分離和鑒定,獲得了多個(gè)吩嗪類化合物(圖1),其中一些化合物表現(xiàn)顯著的抗細(xì)菌活性[11-13]。為了明確吩嗪類化合物對梨火疫病菌的抗菌活性,本研究通過測定菌懸液OD600的方法,評價(jià)了5個(gè)吩嗪類化合物、部分登記的防治藥劑及其復(fù)配藥劑對梨火疫病菌的室內(nèi)抗菌活性,以期為進(jìn)一步擴(kuò)充梨火疫病的防治藥劑種類、開發(fā)利用吩嗪類化合物提供依據(jù)。

圖1 吩嗪類化合物結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Chemical structures of phenazine compounds

1 材料與方法

1.1 材料

LB培養(yǎng)基:胰蛋白胨10 g/L,酵母膏5 g/L,氯化鈉10 g/L,121℃滅菌20 min冷卻后備用。固體LB培養(yǎng)基需另加入瓊脂17 g/L。

病原菌:梨火疫病菌Erwiniaamylovora菌株K21-16,由本實(shí)驗(yàn)室2021年分離自新疆庫爾勒香梨枝條,保存于-80℃超低溫冰箱。

供試藥劑:藥劑來源見表1。使用分析天平定量稱取藥劑,先用DMSO溶解并稀釋,配制成不同濃度梯度的母液,后續(xù)取母液10 μL加入到1 mL LB培養(yǎng)基中,配成不同濃度的工作液,工作液濃度梯度見表1。

表1 供試藥劑來源及工作液濃度梯度Table 1 Sources of agents and concentration gradients of working solutions

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1菌懸液制備

取保存于-80℃的梨火疫病菌菌株K21-16,在LB固體平板上劃線,28℃黑暗條件培養(yǎng)2 d。挑取單菌落接種于3 mL LB液體培養(yǎng)基中,置于搖床上,28℃、180 r/min黑暗條件培養(yǎng)18 h,調(diào)節(jié)OD600=1.0制成菌懸液備用。

1.2.2單劑抗菌活性測定

參考相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)和文獻(xiàn)的方法并做適當(dāng)修改[14-16]。具體如下:取無菌的24孔板,每孔加入1 mL LB液體培養(yǎng)基,按1%體積比(10 μL)加入上述菌懸液,再按1%的體積比(10 μL)加入供試藥劑母液,使藥劑濃度為表1中的設(shè)置濃度梯度。將24孔板用封口膜封好后置于搖床中,28℃、120 r/min條件下培養(yǎng)20 h,取出后測定每孔菌液的OD600。以不含藥劑,只加10 μL DMSO溶劑作為對照組,按以下公式求得各藥劑處理的抑制率。

抑制率=(對照組OD600—藥劑處理組OD600)/對照組OD600×100%。

1.2.3復(fù)配藥劑抗菌活性測定

根據(jù)單劑活性大小確定了以吩嗪-1-羧酸∶中生菌素、吩嗪-1-羧酸∶春雷霉素作為復(fù)配組合,該藥劑組合不同質(zhì)量配比和濃度梯度設(shè)置如表2。復(fù)配藥劑組合抑制率的測定方法與1.2.2相同。

1.2.4增效系數(shù)測定

采用Wadley法計(jì)算復(fù)配組合的增效系數(shù)(SR)。公式X1=(Pa+Pb)/(Pa/a+Pb/b),其中X1為混劑EC50理論值,Pa、Pb分別為混劑中A、B的百分含量(%),a、b分別為混劑中A、B的EC50值。增效系數(shù)SR=X1/X2。X2為混劑EC50實(shí)測值。SR<0.5為拮抗作用,0.5≤SR≤1.5為相加作用,SR>1.5為增效作用。

表2 復(fù)配藥劑配制比例和濃度梯度設(shè)置Table 2 Proportions of compound reagents and building up of concentration gradients

1.2.5數(shù)據(jù)處理

藥劑抗菌活性所得數(shù)據(jù)采用DPS 7.05軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,以藥劑濃度的對數(shù)值和抑制率的生物幾率值進(jìn)行回歸分析,建立回歸方程,求出抑制中濃度(EC50)、95%置信限等數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單劑抗菌活性

通過測定梨火疫病菌菌液在不同濃度藥劑中的OD600,求出了梨火疫病菌對不同藥劑的敏感基線和EC50,明確了不同單劑藥劑對梨火疫病菌的抗菌活性,具體結(jié)果見表3。結(jié)果顯示,不同供試藥劑對梨火疫病菌的抗菌活性差異很大。四環(huán)素的抗菌活性最強(qiáng),EC50僅為0.41 μg/mL,其次為噻霉酮和堆囊粘菌素,EC50分別為7.21 μg/mL和7.20 μg/mL。中生菌素和吩嗪-1-羧酸的EC50為10.75 μg/mL和46.41 μg/mL,春雷霉素和噻唑鋅的EC50為50.74 μg/mL和72.15 μg/mL,這4種化合物的抗菌活性中等。另外3種吩嗪類化合物Compound 2、2-羥基-吩嗪-1-羧酸、2-羥基吩嗪抗菌活性較弱,EC50均在1 000 μg/mL以上。

2.2 復(fù)配藥劑抗菌活性

通過單劑活性測定，篩選到了吩嗪-1-羧酸具有較好的抗菌活性，該化合物已實(shí)現(xiàn)商業(yè)生產(chǎn)。本研究將其與活性接近的中生菌素和春雷霉素進(jìn)行了復(fù)配，以確定增效作用大小。復(fù)配藥劑的測定結(jié)果見表4。結(jié)果顯示，相對于單劑，吩嗪-1-羧酸與中生菌素復(fù)配有一定的相加作用，以吩嗪-1-羧酸∶中生菌素=9∶1作用較為明顯，增效系數(shù)為1.28，其他配比的增效系數(shù)較低。吩嗪-1-羧酸與春雷菌素3個(gè)配比的增效系數(shù)均在1.0以下，顯示兩者有比較弱的相加作用。

表3 不同單劑藥劑對梨火疫病菌的抗菌活性Table 3 Antagonistic activities of different single agents against Erwinia amylovora

續(xù)表4 Table 4(Continued)

3 結(jié)論與討論

梨火疫病是我國及世界上重要的檢疫性細(xì)菌病害,藥劑防治仍是重要的防控措施之一,研究和開發(fā)新的高效防治藥劑對于解決防治藥劑種類少、降低抗藥性風(fēng)險(xiǎn)等問題意義重大。吩嗪類化合物是一類由多種細(xì)菌產(chǎn)生的含多個(gè)氮原子的雜環(huán)化合物,有獨(dú)特的光學(xué)性質(zhì)和氧化還原特性,在化學(xué)、化工、物理等領(lǐng)域有多年的研究基礎(chǔ),在醫(yī)藥、農(nóng)藥、電池、導(dǎo)體、發(fā)光材料等領(lǐng)域也有廣泛的應(yīng)用價(jià)值[17]。

堆囊粘菌素(myxin)是抗生素溶桿菌LysobacterantibioticusOH13產(chǎn)生的一個(gè)吩嗪類次生代謝產(chǎn)物,作為獸醫(yī)藥和抗真菌藥物已有多年的歷史,在癌癥治療中也有一定的應(yīng)用價(jià)值[18-19]。Compound 2是該菌株產(chǎn)生的另一個(gè)主要的吩嗪類化合物。myxin不穩(wěn)定,可轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的Compound 2[12-13]。本研究測定了這兩個(gè)化合物對梨火疫病菌的抗菌活性,顯示myxin (EC50=7.20 μg/mL)的活性和噻霉酮相當(dāng),遠(yuǎn)高于Compound 2 (EC50=1 079.88 μg/mL)的活性,因此myxin在抑制梨火疫病菌方面有進(jìn)一步的利用價(jià)值,這一結(jié)果和我們前期采用抑菌圈測定的結(jié)果是一致的[11]。因?yàn)閙yxin的化學(xué)結(jié)構(gòu)與Compound 2的結(jié)構(gòu)差別僅是5號位置的N被氧化形成N-O共軛電子基團(tuán)(圖1),所以這一基團(tuán)對于化合物保持梨火疫病菌抗菌活性來說是必需的,未來可通過衍生化反應(yīng)進(jìn)行化合物的修飾改造,以保持myxin的活性并增強(qiáng)化合物的穩(wěn)定性。

吩嗪-1-羧酸(PCA)是一種廣泛存在于假單胞菌和鏈霉菌等微生物中的次級代謝產(chǎn)物,對多種植物病原真菌或細(xì)菌具有較好的抗菌活性,同時(shí)還有醫(yī)用殺菌、抗腫瘤等活性,應(yīng)用比較廣泛[20]。國內(nèi)以PCA為有效成分開發(fā)的農(nóng)藥產(chǎn)品被命名為申嗪霉素,已獲得農(nóng)藥登記,用于防治小麥赤霉病、稻瘟病、稻紋枯病、黃瓜霜霉病、辣椒疫病等真菌或卵菌病害。本研究用綠針假單胞菌TC3產(chǎn)生的PCA來測定對梨火疫病菌的抗菌活性,其單體化合物EC50為46.41 μg/mL,該活性比目前登記的中生菌素要弱,與春雷霉素相當(dāng),比噻唑鋅稍好,因此也有一定的研究和應(yīng)用價(jià)值。將PCA與中生菌素進(jìn)行復(fù)配,發(fā)現(xiàn)9∶1的配比有一定相加作用(SR=1.28),但尚未達(dá)到增效的作用,推測兩者的作用機(jī)制有相近之處。2-羥基吩嗪-1-羧酸(2-OHPCA)和2-羥基吩嗪(2-OHPHZ)也是假單胞菌產(chǎn)生的主要吩嗪類化合物,本研究顯示其抗梨火疫病菌作用很弱(EC50高于1 000 μg/mL),從化學(xué)結(jié)構(gòu)上可以看出,吩嗪基團(tuán)2號位上的羥基基團(tuán)對于梨火疫病菌抗菌活性來說是不利的(圖1),該結(jié)果為未來開展化合物的結(jié)構(gòu)改造以提高抗菌活性提供了參考和依據(jù)。

中生菌素、春雷霉素、噻唑鋅、噻霉酮等農(nóng)藥是目前登記防治梨火疫病的藥劑,室內(nèi)抗菌活性也有報(bào)道。如梁慧敏等[7]通過最低抑制濃度和抑菌圈比較的方法測定了30種藥劑對梨火疫病菌的抗菌活性,發(fā)現(xiàn)噻霉酮、壬菌銅、乙蒜素、假單胞菌等效果較好,不同藥劑之間、同一藥劑不同劑型之間抑菌效果差異較大。熱孜亞·麥麥提等[21]通過濾紙片-抑菌圈法測定了噻霉酮藥劑對梨火疫病菌50個(gè)菌株的抗菌活性,發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)、不同寄主和年份的梨火疫病菌菌株對噻霉酮的敏感性、抗性水平都存在一定差異,噻霉酮對供試菌株的EC50范圍為12.40～813.13 μg/mL,均值為(304.61±133.45)μg/mL。相比于前人結(jié)果,本研究測定的藥劑活性大小有所差異,可能的原因有很多,一是所用藥劑產(chǎn)品不同,本研究使用的藥劑多為純度較高的抗生素標(biāo)準(zhǔn)品,與前人使用的農(nóng)藥制劑不同,藥劑的物理狀態(tài)、抗菌性能有差異;二是梨火疫病菌菌株不同,不同菌株對同一藥劑的敏感性存在差異;三是測定方法不同,本研究使用病原菌培養(yǎng)液的OD600反映菌體濃度大小,進(jìn)而反映不同藥劑的抑制作用大小,前人使用抑菌圈大小來評價(jià)藥劑抑制效果,兩種方法得到的EC50必然有差異。但總的來說,這些研究結(jié)果均顯示了中生菌素、噻霉酮等藥劑的EC50較低,為梨火疫病的防治提供了一定的理論依據(jù)。

本研究測定了5個(gè)吩嗪類化合物對梨火疫病菌的抗菌活性,明確了堆囊粘菌素、吩嗪-1-羧酸等化合物的活性較好,但仍有很多問題尚待研究,如該化合物對不同地區(qū)、時(shí)期的梨火疫病菌是否有相似的抗菌活性尚需研究,化合物的復(fù)配篩選范圍有待進(jìn)一步擴(kuò)大,化合物的制劑產(chǎn)品在田間是否有較好的防治效果也需進(jìn)一步研究。本研究結(jié)果為擴(kuò)充梨火疫病防治藥劑種類、開發(fā)利用吩嗪類化合物提供了參考。