張栩浩,羅流河,王珊珊,胡 杰,李曉雪*,張宏宇*

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝與城市昆蟲研究所,湖北洪山實(shí)驗(yàn)室,中澳園藝與城市有害生物聯(lián)合研究中心,武漢 430070;2.湖北省十堰市丹江口市習(xí)家店鎮(zhèn)農(nóng)技中心,十堰 442706)

實(shí)蠅Tephritidae是一類重要的檢疫性害蟲,雌成蟲通過產(chǎn)卵針在果實(shí)內(nèi)產(chǎn)卵,幼蟲孵化后潛伏在果皮下取食果肉,引起落果和果實(shí)腐爛,使果實(shí)失去商品價(jià)值。防治措施不當(dāng)時(shí),實(shí)蠅種群數(shù)量在幾個(gè)月內(nèi)迅速增長,嚴(yán)重影響果實(shí)的產(chǎn)量和品質(zhì),造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1-4]。目前生產(chǎn)上防控措施主要依賴化學(xué)農(nóng)藥防治和性誘劑誘殺[5-6]?；瘜W(xué)防治見效快,同時(shí)也易引發(fā)害蟲抗藥性(resistance)、再猖獗(resurgence)和殘留(residue)的“3R問題”;性信息素引誘效果好,專一性強(qiáng),但性誘劑只對(duì)雄蟲有效,而未引誘到的雄蟲可與多頭雌蟲交配,造成防治效果減弱。此外,有報(bào)道表明橘小實(shí)蠅性誘劑甲基丁香酚(methyl eugenol,ME)對(duì)生態(tài)平衡存在安全隱患,且對(duì)人類有致癌性,不適宜長期田間使用,而以ME為模板合成的衍生物不僅引誘效果差且工藝復(fù)雜[7-8]。因此,研究開發(fā)新型高效環(huán)保的實(shí)蠅綠色防治技術(shù)迫在眉睫。

微生物在昆蟲協(xié)調(diào)生長、取食、免疫等方面有著非常重要的作用[9-13]。例如黑腹果蠅Drosophilamelanogaster幼蟲在取食無菌食物的情況下,生長較為緩慢。補(bǔ)充少量酵母作為營養(yǎng)強(qiáng)化劑后,幼蟲的生長發(fā)育顯著加快[14]。酵母的代謝能產(chǎn)生多種氨基酸、甾醇、B族維生素和脂肪酸,也能進(jìn)行一些解毒和簡單的消化反應(yīng)[15]。由于這些特性,許多昆蟲在生長過程中會(huì)攝取酵母菌作為食物,例如切葉蟻會(huì)用葉子繁殖酵母菌,然后取食酵母菌和酵母菌的代謝產(chǎn)物[16]。酵母菌也可以幫助白蟻Termites消化半纖維素和木聚糖[17]。而多種酵母菌被報(bào)道具有引誘昆蟲取食的作用。例如克魯維畢赤酵母Pichiakluyeri代謝產(chǎn)物氣味對(duì)昆士蘭果實(shí)蠅Bactroceratryoni有一定的引誘活性[18];Kuraishiacapsulata和Lachanceathermotolerans對(duì)橄欖實(shí)蠅Bactroceraoleae具有較強(qiáng)的引誘活性[19]。雌雄實(shí)蠅會(huì)尋找及補(bǔ)充對(duì)自身有益的微生物。然而我國田間和果園環(huán)境中是否存在具有引誘活性的酵母菌有待研究。

橘小實(shí)蠅Bactroceradorsalis和南亞果實(shí)蠅Zeugodacustau在我國南方地區(qū)分布廣泛且危害巨大[20]。如2008年橘小實(shí)蠅對(duì)廣東省國民經(jīng)濟(jì)各部門造成的總損失達(dá)20.77億元,其中直接經(jīng)濟(jì)損失為11.95億元,占經(jīng)濟(jì)總損失的57.50%,占農(nóng)業(yè)總產(chǎn)出的6.057‰[21]。本研究通過在實(shí)蠅為害的南方果園中采集蟲果及寄主葉片上的環(huán)境酵母菌,經(jīng)過分離培養(yǎng)純化,單菌落鑒定以及活化菌株后,通過田間生物測定來篩選對(duì)兩種實(shí)蠅具有高效引誘活性的菌株,以期為實(shí)蠅綠色防控高效引誘劑研制提供菌種資源。

1 材料與方法

1.1 蟲果及環(huán)境酵母菌采集

從海南、廣東、廣西、江西、浙江、湖北等地實(shí)蠅發(fā)生為害的果園采集被害果實(shí)及其同株寄主葉片樣品。采集樣品時(shí),優(yōu)先采集果實(shí)內(nèi)仍有幼蟲的落果。采集果實(shí)樣品后,再于同一株植物上采集葉片樣品。采樣地點(diǎn)見表1。

1.2 酵母菌的分離培養(yǎng)

將果實(shí)表面消毒后,用無菌手術(shù)刀將幼蟲附近的果肉切出約0.50 g,置于2 mL無菌離心管中,加入500 μL無菌水和2粒無菌鋼珠,于全自動(dòng)快速研磨儀上70 Hz研磨20 s后,10 000 r/min短暫離心5 s,取100 μL上清液涂布在滅菌YPD (yeast extract peptone dextrose medium)培養(yǎng)基平板上,于黑暗條件下27℃恒溫培養(yǎng)72 h至出現(xiàn)較多菌落后,挑取單菌落接種于1 000 μL YPD液體培養(yǎng)基中,于27℃恒溫,120 r/min振蕩培養(yǎng)48 h后得到供試菌株發(fā)酵液。

表1 受害蟲果及葉片樣品采樣地點(diǎn)Table 1 Sampling locations for collecting damaged fruit and leaf samples

葉片樣品用無菌手術(shù)剪剪成小段后,放入玻璃錐形瓶中,每10 g葉片加入100 mL無菌水,室溫下以150 r/min振蕩24 h,得到葉片樣品原液。再以前述方法涂板,培養(yǎng)成供試菌株發(fā)酵液。

1.3 酵母菌鑒定

取5 μL菌株樣品加入PCR裂解緩沖液中(Lysis Buffer for Microorganism),90℃裂解并變性15 min,離心后取上清液作為PCR模板,使用引物NL1(5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′)和 NL4(5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′)[22]對(duì)酵母的26S rDNA的D1/D2區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增。將PCR產(chǎn)物送武漢昆泰銳生物公司進(jìn)行一代測序,獲得的序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中運(yùn)用BLAST進(jìn)行序列比對(duì)。

1.4 供試菌株對(duì)實(shí)蠅引誘活性的生物測定

供試蟲源:本研究所用橘小實(shí)蠅、南亞果實(shí)蠅均為本實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)種群,已連續(xù)室內(nèi)傳代幾十代。飼養(yǎng)環(huán)境光周期L∥D=16 h∥8 h,溫度(25±4)℃,相對(duì)濕度(70±10)%。

引誘效果測定:以滅菌YPD培養(yǎng)基為陰性對(duì)照,以商品圓酵母引誘劑(美國IDEALS CRAFTWORK CO,LTD公司)為陽性對(duì)照,不同菌株的發(fā)酵液作為處理,分別裝在規(guī)格為直徑100 mm,高215 mm的近圓筒引誘罐(漳州英格爾科技開發(fā)公司)中,每個(gè)菌株加入100 mL,設(shè)置3個(gè)重復(fù),陽性對(duì)照以推薦劑量使用(100 mL/顆,約4.6 g/顆)。每天上午09:00在模擬田間環(huán)境約160 m2的半開放網(wǎng)室中,隨機(jī)布置裝有發(fā)酵液的誘捕罐,每次測試9個(gè)菌株并分別釋放橘小實(shí)蠅、南亞果實(shí)蠅各400頭,雌雄比1∶1。次日上午08:00收集誘捕罐。按照種類、性別分別統(tǒng)計(jì)引誘到的實(shí)蠅數(shù)量。

1.5 高引誘活性菌株的篩選

取初篩引誘效果較好的菌株進(jìn)行高引誘活性菌株篩選,因半開放網(wǎng)室面積有限,為減少不同處理之間間距過近產(chǎn)生干擾,故分為兩組進(jìn)行試驗(yàn)。每天在模擬田間環(huán)境的半開放網(wǎng)室中測定一組菌株引誘效果。每組重復(fù)5次。每天上午09:00前隨機(jī)布置誘餌并按照雌雄比1∶1的比例分別釋放400頭橘小實(shí)蠅、南亞果實(shí)蠅。次日上午08:00收集誘捕器,并于09:00前布置下一次試驗(yàn)。然后按照實(shí)蠅種類、性別分別統(tǒng)計(jì)引誘瓶內(nèi)的實(shí)蠅數(shù)量。測定完成后,每組選出引誘活性較好的3株菌株,合計(jì)6株菌株。按上述方法再次測定引誘活性。

1.6 數(shù)據(jù)處理方法

酵母菌菌種數(shù)據(jù)處理參考蘇宇喬等[23]的方法。

Simpson多樣性指數(shù)(Simpson’s index of diversity,C)計(jì)算公式如下:

其中C表示Simpson多樣性指數(shù),i為樣品內(nèi)菌種數(shù)量,Ni為樣品內(nèi)該菌種的菌株數(shù)量,N為樣品所含菌株數(shù)量。C越大,說明該樣品的菌種豐富度和均勻度越大,多樣性越好。

為了評(píng)價(jià)單個(gè)菌種在樣品中的分布情況,采用了Berger—Park優(yōu)勢度指數(shù)(D),其計(jì)算公式如下:

其中D表示優(yōu)勢度指數(shù),Nmax表示該物種所有優(yōu)勢種群數(shù)量,NT為該地區(qū)全部種群數(shù)量。D越大,說明該菌種在該地區(qū)分布越廣,優(yōu)勢度越大。

實(shí)蠅引誘數(shù)據(jù)處理:按照實(shí)蠅種類、性別分別統(tǒng)計(jì)引誘瓶內(nèi)的實(shí)蠅數(shù)量。按照下列公式計(jì)算相對(duì)引誘指數(shù)和雌蟲引誘率。

數(shù)據(jù)通過Microsoft Office Excel軟件整理與分類,通過R4.1.2以及其中的tidyverse、agricolae、RColorBrewer程序包進(jìn)行方差分析及多重比較并繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同地區(qū)蟲果及葉片樣品中酵母菌群落組成

從浙江、江西、海南、湖北、廣西、廣東省中的7個(gè)地點(diǎn)共計(jì)采集并分離獲得357株酵母菌菌株,分屬于8個(gè)屬,25個(gè)種。25個(gè)菌種具體如表2所示。

表2 所采集菌株以及種屬鑒定結(jié)果Table 2 The collected strains and the results of the genus identification of the bacteria

在菌株屬水平上而言,不同地區(qū)的菌株屬的多樣性區(qū)別較大(圖1),其中湖北省武漢市樣品和廣西貴港市樣品菌株分布最廣,包含6個(gè)屬。湖北武漢市樣品中有假絲酵母屬Candida、畢赤酵母屬Pichia、有孢漢遜酵母屬Hanseniaspora、有孢圓酵母屬Torulaspora、子囊酵母屬Galactomyces和威克漢姆酵母屬Wickerhamomyces;廣西貴港市樣品中有Pichia、Hanseniaspora、釀酒酵母屬Saccharomyces、Starmerella、Galactomyces、Wickerhamomyces;最少的廣東中山市樣品僅含Pichia。

圖1 酵母菌屬水平分布Fig.1 The distribution of yeast on genus level

采集到的所有酵母中,屬水平上，Pichia酵母的分布最廣,在所有7個(gè)采樣地區(qū)中均能發(fā)現(xiàn),在浙江臺(tái)州、江西贛州、廣東廣州、廣東中山4個(gè)采樣地樣品中Pichia優(yōu)勢度最高,分別占比61.7%、88.9%、68.3%和100%;Hanseniaspora在除廣東中山市樣品以外的6個(gè)樣品中均有分布,該屬酵母在海南三亞和廣西貴港采樣點(diǎn)樣品中分別占比61.9%和53.2%。Saccharomyces僅在廣西貴港樣品中發(fā)現(xiàn),占比2.1%;Torulaspora僅在湖北武漢樣品中發(fā)現(xiàn),占比49.4%,高于該地區(qū)樣品中其他酵母,說明該屬酵母可能是武漢市的優(yōu)勢酵母。

不同采樣點(diǎn)中,海南三亞的樣品Simpson多樣性指數(shù)最高,為0.85,H.guilliermondii的優(yōu)勢度指數(shù)最高,為0.26;其次是廣東廣州,Simpson多樣性指數(shù)為0.73,P.kluyveri的優(yōu)勢度指數(shù)最高,為0.45;廣西貴港與浙江臺(tái)州樣品的Simpson多樣性指數(shù)均為0.72,廣西貴港樣品中優(yōu)勢度最高的菌種為H.opuntiae,優(yōu)勢度指數(shù)為0.49,浙江臺(tái)州樣品中優(yōu)勢度最高的菌種為P.kudriavzevii,優(yōu)勢度指數(shù)為0.32;湖北武漢的樣品Simpson多樣性指數(shù)為0.70,T.globosa優(yōu)勢度指數(shù)最高,為0.49;廣東中山樣品的Simpson多樣性指數(shù)為0.46,優(yōu)勢菌種為P.kudriavzevii,優(yōu)勢度指數(shù)為0.68;江西贛州樣品的Simpson多樣性指數(shù)為0.20,優(yōu)勢菌種為P.kudriavzevii,優(yōu)勢度指數(shù)為0.89(圖2,表3)。

圖2 酵母菌種水平分布Fig.2 The distribution of yeast on species level

在采集的所有酵母菌中,優(yōu)勢種是H.opuntiae,優(yōu)勢度指數(shù)為0.22;其次為P.kudriavzevii,優(yōu)勢度指數(shù)0.21。其中蟲果分離的酵母菌優(yōu)勢種是P.kudriavzevii,優(yōu)勢度指數(shù)為0.29;其次為H.opuntiae,優(yōu)勢度指數(shù)0.17;葉片分離的酵母菌優(yōu)勢種是H.opuntiae,優(yōu)勢度指數(shù)為0.30;其次為P.kluyveri,優(yōu)勢度指數(shù)為0.18。

2.2 酵母菌各菌株發(fā)酵液對(duì)南亞果實(shí)蠅的引誘活性

357株酵母菌發(fā)酵液對(duì)南亞果實(shí)蠅的相對(duì)引誘指數(shù)及雌蟲引誘率結(jié)果表明,對(duì)南亞果實(shí)蠅相對(duì)引誘指數(shù)大于等于1的酵母菌菌株有22株;相對(duì)引誘指數(shù)0.5～1之間的有33株;相對(duì)引誘指數(shù)低于0.5的有302株,其中有127株菌株相對(duì)引誘指數(shù)低于0.1。挑選出的12株引誘活性較高的酵母菌如表4所示。

表3 不同采樣點(diǎn)的Simpson多樣性指數(shù)Table 3 Simpson’s diversity index of different sampling site

表4 對(duì)南亞果實(shí)蠅引誘活性較高的酵母菌相對(duì)引誘指數(shù)和雌蟲引誘率1)Table 4 Relative lure index and female lure rate of yeast with high lure activity against Zeugodacus tau

2.3 酵母菌菌株發(fā)酵液對(duì)橘小實(shí)蠅的引誘活性

357株酵母菌發(fā)酵液對(duì)橘小實(shí)蠅的相對(duì)引誘指數(shù)方差分析可知,對(duì)橘小實(shí)蠅相對(duì)引誘指數(shù)大于等于1的菌株有142株;相對(duì)引誘指數(shù)在0.5～1之間的菌株有53株;相對(duì)引誘指數(shù)低于0.5,即引誘活性低于陽性對(duì)照的50%的菌株共有162株;還有52株菌株相對(duì)引誘指數(shù)低于0.1。挑選出的12株引誘活性較高的酵母菌如表5所示。

表5 對(duì)橘小實(shí)蠅引誘活性較高的酵母菌相對(duì)引誘指數(shù)和雌蟲引誘率Table 5 Relative lure index and female lure rate of yeast with high lure activity against Bactrocera dorsalis

2.4 對(duì)南亞果實(shí)蠅高引誘活性的酵母菌菌株發(fā)酵液引誘活性復(fù)測結(jié)果

將篩選出的12株對(duì)南亞果實(shí)蠅具有較好引誘活性的菌株分兩組進(jìn)一步進(jìn)行競爭性生物測定,結(jié)果表明,第一組較好引誘活性菌株中,ZJGJA31菌株的引誘活性最好,引誘數(shù)量為(10.6±1.7)頭/誘捕器,其次為ZJGJA08菌株(8.1±0.9)頭/誘捕器、GXGJA42菌株(7.1±0.9)頭/誘捕器。第二組較好引誘活性菌株中,HBMTA13菌株引誘活性最好,引誘數(shù)量為(6.8±1.1)頭/誘捕器,其次為HIYTA36菌株(4.7±1.2)頭/誘捕器、ZJGJA01菌株(4.3±0.5)頭/誘捕器(表6)。

表6 高引誘活性菌株對(duì)南亞果實(shí)蠅的引誘效果Table 6 Effect of the strains with high lure activity to Zeugodacus tau

2.5 對(duì)橘小實(shí)蠅高引誘活性的酵母菌菌株發(fā)酵液引誘活性復(fù)測結(jié)果

將篩選出的12株對(duì)橘小實(shí)蠅具有較好引誘活性的菌株分兩組進(jìn)行競爭性生物測定,進(jìn)一步篩選結(jié)果表明,第一組中,ZJGJA31菌株對(duì)橘小實(shí)蠅的引誘活性最好,引誘數(shù)量為(9.1±1.1)頭/誘捕器,其次為ZJGJA09菌株(8.3±0.7)頭/誘捕器、GXGJA01菌株(7.6±0.8)頭/誘捕器;第二組中,HBMTA13菌株顯著好于其他菌株,引誘數(shù)量為(23.0±2.9)頭/誘捕器。其次是GXGJA43菌株(10.6±2.0)頭/誘捕器、HIYTA36菌株(10.4±2.8)頭/誘捕器(表7)。

表7 高引誘活性菌株對(duì)橘小實(shí)蠅的引誘效果Table 7 Effect of the strains with high lure activity to Bactrocera dorsalis

3 結(jié)論與討論

本研究通過分離實(shí)蠅為害的蟲果、葉片樣品中的酵母菌菌株,共分離出357株酵母菌,歸屬于25個(gè)種。相比于其他研究[24-26],我們獲得了較豐富的菌株資源,且從海南、廣東、廣西、江西、浙江、湖北多個(gè)省市的柑橘、番石榴、楊桃等多個(gè)寄主植物取樣具有較大的廣泛性,單克隆菌落通過分子鑒定結(jié)果有較高的可靠性。

除江西贛州、廣東中山樣品外,其余樣品的Simpson多樣性指數(shù)較高,均大于0.70,表明實(shí)蠅生存的環(huán)境中具有較多的酵母菌。這種多樣性可能與實(shí)蠅在野外取食過程中被動(dòng)擴(kuò)散了酵母菌有關(guān),有些微生物通過散發(fā)氣味、誘導(dǎo)植物發(fā)生畸變等措施引誘昆蟲取食植物,昆蟲取食植物的時(shí)候攜帶上自己的菌體或者孢子,從而達(dá)到擴(kuò)散傳播的目的[27]?？赡苷沁@種關(guān)系使得一些微生物對(duì)昆蟲具有一定的吸引能力,這與其他學(xué)者的報(bào)道相似[28]。從菌株屬水平的分布來看,Pichia酵母和Hanseniaspora酵母在我國浙江、江西、海南、湖北、廣西、廣東均可發(fā)現(xiàn)。各屬酵母菌基本上在兩個(gè)地點(diǎn)以上的樣品中出現(xiàn),說明酵母菌在不同地區(qū)的擴(kuò)散范圍較廣,實(shí)蠅的擴(kuò)散與酵母菌的傳播之間可能存在協(xié)同進(jìn)化或其他關(guān)聯(lián),需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

大部分分離菌株對(duì)實(shí)蠅具有一定引誘能力,但引誘能力差異較大。通過田間初篩,我們從357株酵母菌中篩選獲得12株較高引誘能力的菌株,進(jìn)一步篩選獲得對(duì)南亞果實(shí)蠅和橘小實(shí)蠅引誘效果均較好的2株酵母菌P.kluyveriZJGJA31和T.globosaHBMTA13,分別屬于畢赤酵母屬和有孢圓酵母屬。酵母菌可能存在實(shí)蠅發(fā)育所必需的物質(zhì),這些物質(zhì)可能是引誘實(shí)蠅前來取食的關(guān)鍵因素。例如酵母菌或酵母菌的揮發(fā)物能夠促進(jìn)雌性實(shí)蠅發(fā)育及產(chǎn)卵[18]。P.kluyveri,Yamadazymasp.,T.delbrueckii,H.opuntiae對(duì)橘小實(shí)蠅幼蟲生長發(fā)育有促進(jìn)作用,可能作為食物來源而吸引實(shí)蠅[29]。采集到的菌株對(duì)橘小實(shí)蠅的引誘能力比對(duì)南亞果實(shí)蠅的引誘能力更強(qiáng)一些。這可能是由于大多數(shù)菌株的來源都是橘小實(shí)蠅寄主有關(guān),但同時(shí)也說明南亞果實(shí)蠅也會(huì)被來自于非寄主植物的酵母菌所吸引,為研制出對(duì)橘小實(shí)蠅和南亞果實(shí)蠅通用的酵母菌源引誘劑提供了可能。從雌蟲引誘率來看,對(duì)實(shí)蠅引誘能力強(qiáng)的菌株,其引誘到實(shí)蠅中雌蟲的占比不一定高。后期選擇菌株開發(fā)為引誘劑時(shí),在引誘能力相近的情況下,應(yīng)當(dāng)優(yōu)先選擇雌蟲引誘率較高的菌株,提高防治效果。此外本試驗(yàn)未對(duì)實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)種群環(huán)境酵母菌與野外采集的酵母菌進(jìn)行對(duì)比,需進(jìn)一步確認(rèn)酵母菌來自寄主環(huán)境還是實(shí)蠅本身。

本研究篩選獲得的實(shí)蠅高引誘性酵母菌株具有良好的廣譜適用性和潛在的開發(fā)價(jià)值,為后續(xù)開發(fā)實(shí)蠅高效餌劑提供了必要的菌種資源,在后續(xù)研究中將進(jìn)一步進(jìn)行活化,進(jìn)行大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng),研制最佳劑型,最終投入實(shí)際生產(chǎn)中,為實(shí)蠅綠色高效防控奠定資源和技術(shù)基礎(chǔ)。