梁永軒,郭建洋,王 浩,張毅波,周 瓊,張桂芬,呂志創(chuàng),劉萬學*

(1.中國農業(yè)科學院植物保護研究所,植物病蟲害生物學國家重點實驗室,北京 100193;2.湖南師范大學生命科學學院,長沙 410081)

番茄潛葉蛾Tutaabsoluta(又名Phthorimaeaabsoluta)，隸屬于鱗翅目Lepidoptera麥蛾科Gelechiidae，起源于南美洲秘魯，于2006年由原產地入侵歐洲的西班牙后，迅速傳播到歐洲中部地區(qū)、地中海沿岸等非洲國家和亞洲的部分國家[1-3]。截至2017年，該害蟲已入侵80多個國家和地區(qū)，成為世界番茄重要入侵害蟲，番茄受害面積約占全球番茄種植面積的一半以上，每年直接經濟損失約60億美元。對全球番茄產業(yè)造成了嚴重影響[4]。我國番茄種植面積位居世界第一，是全球番茄產量最大的國家，占全球總產量的32.6%[5]。番茄潛葉蛾自侵入我國西北和西南的多個鄰國后[6-7]，于2017年8月抵達我國新疆伊犁為害當地露地番茄，次年3月，又在云南臨滄發(fā)現(xiàn)其為害保護地番茄[8-9]。風險評估表明，該蟲在我國大部分番茄種植區(qū)都可以存活和定殖，綜合風險評估R值為2.64，屬于極高風險性農業(yè)有害入侵生物，對我國番茄等作物的潛在威脅極大[6]。

番茄潛葉蛾最喜寄主為番茄、茄子[10]等茄科植物，以幼蟲在葉片內取食為害，留下窗紙樣、不規(guī)則的潛道或潛斑，還能直接蛀入果實內部[10-11]，導致使用化學農藥難以起到理想的防控效果。而研究表明，除茄科外，該蟲還為害或取食包括豆科、錦葵科、莧科、旋花科、藜科、菊科、十字花科以及禾本科在內的11個科近50種植物[4,8,12]，生存與繁殖能力很強[1,4]。因此，明確其生殖生物學特性并開展早期的預測預報，對于制定有效的防控策略極為重要。

雌性昆蟲的生殖系統(tǒng)具有產生和貯存卵子、完成受精和產卵等功能。卵子發(fā)生、成熟與受精后產出體外[13]。卵子發(fā)生主要通過卵母細胞吸取大量的營養(yǎng)物質，這些物質既有本身合成的，也有從外界攝取的，這些物質沉積在卵內為胚胎發(fā)育提供營養(yǎng)[14]。通過分析卵巢發(fā)育、卵子發(fā)生可以為準確預測預報害蟲種群動態(tài)、確定害蟲防治適期等提供參考，在害蟲發(fā)生高峰期前采取有效措施，以提高防治效果[15-16]。因此，明確番茄潛葉蛾雌成蟲的生殖系統(tǒng)結構，探明該蟲的卵巢發(fā)育和卵子發(fā)生過程，對于野外種群發(fā)生期和發(fā)生量的預測預報等具有重要的指導意義[17-18]，而目前未見有針對番茄潛葉蛾的此類研究。對此，本研究分析了雌成蟲的生殖系統(tǒng)結構與組成，明確了成蟲發(fā)育過程中卵巢的形態(tài)變化，補充營養(yǎng)(20%葡萄糖溶液)、交配與否等對其卵巢發(fā)育、卵子發(fā)生過程的影響，以期為該蟲的種群預測預報和防控策略提供支撐。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

番茄潛葉蛾于2019年7月采自云南省玉溪市紅塔區(qū)溫室大棚的‘大粉’番茄苗。溫室條件：溫度(26±1)℃，相對濕度(60±5)%，自然光照。

1.2 成蟲的取樣及處理

幼蟲化蛹后雌、雄分裝于1.5 mL透氣離心管中繼續(xù)生長發(fā)育，離心管置于人工氣候箱，飼養(yǎng)條件為：溫度(25±1)℃，相對濕度(60±5)%，L∥D=16 h∥8 h，取每天晚上(20：00-22：00)羽化雌成蟲用于試驗，初羽化成蟲轉移到50 mL的特制離心管。分別設置交配+清水、交配+20%葡萄糖溶液、未交配+清水和未交配+20%葡萄糖溶液4個處理，其中交配處理選與雌成蟲同一天羽化的雄成蟲按1∶1配對，觀察到雌雄交配的作為有效處理組。成蟲一羽化立即用脫脂棉球蘸取清水或20%葡萄糖溶液并包裹番茄葉片葉柄，放入離心管中。各處理離心管置于人工氣候箱中，每天下午16：00補充清水或20%葡萄糖溶液。

1.3 雌成蟲生殖系統(tǒng)的解剖與觀察

分別隨機選取初羽化雌成蟲、1～6日齡取食20%葡萄糖溶液的交配或未交配雌成蟲解剖并觀察卵巢結構。首先將雌蟲在-20°C冰箱中冷凍處理10～15 min，然后將暈厥的成蟲置于滴有磷酸鹽緩沖液(PBS)的載玻片上，于體視顯微鏡(型號：Stemi 508，ZEISS)下去除體壁僅留下腹內組織，去除消化道、腹神經索、氣管等組織，保留生殖系統(tǒng)與脂肪體。

根據脂肪體數量與顏色、卵黃沉積水平、卵子發(fā)生狀況、卵巢管發(fā)育水平等[19-21]，并參考張萬娜等對棉鈴蟲Helicoverpaarmigera[21]、劉寧等對蘋果蠹蛾Cydiapomonella[22]的卵巢分級方法，對番茄潛葉蛾的卵巢發(fā)育狀況進行分級，以評價其發(fā)育程度。最后去除脂肪體，采用熒光體視顯微鏡(型號：SZX 16，Olympus)觀察和拍攝生殖系統(tǒng)圖片。

1.4 不同處理對雌成蟲卵子發(fā)生的影響

按1.2小節(jié)設置處理。分別選取6頭初羽化，以及每種處理羽化24、48、72、96 h的雌成蟲在體視顯微鏡(型號：Stemi 508，ZEISS)下解剖，并記錄卵巢內外的卵子數。

此外，以未交配+清水條件下羽化96 h的雌成蟲為試蟲，進一步設置2種處理，即分別繼續(xù)提供清水或補充20%葡萄糖溶液，于羽化120、144 h時再取6～8頭進行解剖，并記錄卵子數。

1.5 數據處理與統(tǒng)計分析

采用SPSS Statistics 20軟件進行數據分析。用雙因素方差分析(Two-way ANOVA analysis,LSD test)檢驗羽化后相同時間，不同處理對番茄潛葉蛾卵子發(fā)生數量影響的顯著性；用單因素方差分析(One-way ANOVA analysis)和最小顯著差數法(LSD test)檢驗羽化后不同時間之間，卵子動態(tài)變化的差異顯著性；未交配+清水條件下羽化后96 h繼續(xù)提供清水或補充20%葡萄糖溶液2種處理對卵子發(fā)生數量影響的顯著性采用t測驗。

2 結果與分析

2.1 雌成蟲生殖系統(tǒng)結構與卵巢發(fā)育分級

對不同日齡雌成蟲生殖系統(tǒng)的觀察結果表明，其生殖系統(tǒng)主要包括：1對卵巢、1對側輸卵管(圖1e：A)、1根中輸卵管(圖1e：B)、1對附腺(圖1e：C)、1個交配囊(圖1e：D)、1個陰道支囊(圖1e：E)、1個受精囊(圖1e：F)及其受精囊腺(圖1e：G)。卵巢整體呈乳黃色，左右對稱排列。每側的卵巢管與同側的側輸卵管相接，側輸卵管匯合成一條中輸卵管，中輸卵管末端開口于生殖腔，其側向分支形成的管道末端附著有受精囊、交配囊等(圖1e)。大多數雌成蟲卵巢兩側的卵巢管數目相等，均為4根(圖1)；僅個別成蟲兩側的卵巢管數不等，出現(xiàn)一側為4根，另一側為5根的現(xiàn)象，占總計觀察數量的1.5%(圖1f)。

根據脂肪體的數量與顏色、卵黃沉積水平、卵子發(fā)生狀況、卵巢管發(fā)育水平等情況，將卵巢發(fā)育劃分為5個級別[21-22]。Ⅰ級：卵黃沉積前期。為初羽化時的卵巢，此時卵巢內卵子偶有卵黃沉積，基本為未成熟卵子，總卵子數少；卵巢管細而短，卵巢管及輸卵管乳白色，輸卵管及中輸卵管較細且明顯。卵巢周圍脂肪體乳黃色，量多而飽滿，充滿腹腔(圖1a)。Ⅱ級：卵黃沉積期。卵巢管端部可見未成熟卵子，成熟卵子開始出現(xiàn)，在卵巢管基部成堆，卵巢管膨大，總卵子數較少，中輸卵管較細，側輸卵管內充滿卵子而膨大；脂肪體乳黃色，量多(圖1b)。Ⅲ級：成熟待產期。卵子數量迅速增多，排列整齊，成熟卵在卵巢管基部成堆，由于卵量的增加和卵的膨大，卵巢管膨脹，卵巢體積明顯增大；側輸卵管內充滿卵子，中輸卵管內亦開始出現(xiàn)成熟卵子；卵巢周圍脂肪體黃色，量仍較多(圖1c)。Ⅳ級：產卵盛期。卵子量繼續(xù)增多，達到卵巢最大抱卵量，卵巢管膨大、變長，卵巢達到“飽滿”的狀態(tài)；成熟卵子充滿卵巢端部、側輸卵管、中輸卵管，排列緊密；脂肪體減少，呈黃色(圖1d)。Ⅴ級(產卵末期)：卵巢管內成熟卵子和未成熟卵子數量明顯減少；卵巢管明顯變短，卵巢體積減?。宦殉仓車倔w剩余量少(圖1e)。

2.2 不同處理條件下雌成蟲的卵子發(fā)生動態(tài)

未交配+清水條件下，成蟲初羽化(0 h)至羽化后24 h，卵巢內成熟卵子逐漸增加，24～72 h，成熟卵子、總卵子數迅速增加，未成熟卵子數增長平緩，72 h時各類卵子數均達到高峰；72～96 h，觀察到部分卵子有重吸收現(xiàn)象，羽化后96 h，成熟卵子(F=11.50，P=0.006 9)、未成熟卵子(F=28.12，P=0.000 3)及總卵子數(F=33.54，P=0.000 2)相比72 h均顯著減少(圖2a)。

未交配+20%葡萄糖溶液條件下，0～72 h，卵巢內成熟卵子、總卵子數持續(xù)增加，而未成熟卵子數在0～48 h持續(xù)減少，48～72 h略有增加。在72～96 h，成熟卵子數仍略有增加(圖2b)。成熟卵子和總卵子數均于96 h時達到峰值，數量分別為(96.3±6.9)粒和(242.7±10.4)粒(表1)。

圖1 番茄潛葉蛾卵巢不同發(fā)育程度的形態(tài)和級別劃分Fig.1 Morphology and grading criteria of the ovaries of Tuta absoluta at different developmental stages

圖2 不同交配狀態(tài)及補充營養(yǎng)處理的番茄潛葉蛾雌成蟲卵子發(fā)生動態(tài)Fig.2 Oogenesis dynamics of Tuta absoluta female adults under different mating conditions and nutritional supplements

表1 不同交配狀態(tài)及補充營養(yǎng)處理的番茄潛葉蛾雌成蟲的卵子數量比較1)Table 1 Comparison of eggs number of Tuta absoluta female adults under different mating conditions and nutritional supplements

續(xù)表1 Table 1(Continued)

交配+清水條件下，成蟲羽化后0～96 h，成熟卵子和總卵子數呈較快的增加趨勢，而未成熟卵子數則持續(xù)減少(圖2c)。雌蟲與雄蟲交配后，在羽化后逐漸將成熟卵子產到體外，至96 h時，成熟卵子、總卵子及產卵數均達最大值，分別為(136.2±7.9)、(231.2±5.0)和(118.2±8.6)粒(表1)；而未成熟卵子數減少到最小值。

交配+20%葡萄糖溶液條件下，0～96 h，成熟卵子、總卵子和產卵數變化趨勢與交配+清水處理基本一致，于96 h達最大值，分別為(159.3±7.3)、(254.0±9.7) 粒和(138.7±7.4)粒(表1)；而未成熟卵子數在0～24 h相對穩(wěn)定，24～48 h之間減少，于96 h減少到最小值(圖2d)。

在未交配+清水條件下雌蟲發(fā)生卵子重吸收現(xiàn)象(96 h)后，若繼續(xù)提供清水，則直到羽化后120 h，卵巢內成熟卵子、未成熟卵子、總卵子數變化相對穩(wěn)定；144 h后均減少到最小值，分別為(45.3±6.0)、(99.3±12.0)粒和(144.7±13.7)粒(表2)。而當卵子重吸收后，給雌蟲持續(xù)補充取食20%葡萄糖溶液，則羽化120 h時，各類卵子的數量均顯著增加，到144 h時略有減少(圖3)。

圖3 未交配+清水處理下番茄潛葉蛾雌成蟲卵重吸收后提供清水或補充葡萄糖后的卵子發(fā)生動態(tài)Fig.3 Ovogenesis dynamics of Tuta absoluta female adults after oosorption under unmated + water treatment after water supply or 20% glucose solution supplementation

2.3 補充營養(yǎng)及交配與否對卵子發(fā)生的影響

取食20%葡萄糖溶液對雌蟲卵子發(fā)生有明顯的促進作用。羽化后24 h，未交配雌蟲形成的成熟卵子(F=21.61，P=0.000 2)、未成熟卵子(F=4.92，P=0.038 3)、總卵子數(F=9.73，P=0.005 4)，及交配雌蟲的成熟卵子(F=19.94，P=0.000 2)、總卵子數(F=6.84，P=0.016 6)均顯著高于清水對照組；羽化后72 h，交配雌蟲的未成熟卵子數(F=5.33，P=0.031 8)顯著高于清水組；而96 h，未交配雌蟲的成熟卵子(F=22.59，P=0.000 1)、未成熟卵子(F=17.91，P=0.000 4)、總卵子數(F=49.59，P<0.000 1)，及交配雌蟲的成熟卵子數(F=5.61，P=0.028 1)均高于清水組(表1)。

在未交配且僅取食清水的條件下，發(fā)生卵子重吸收(96 h)后給雌蟲補充20%葡萄糖溶液，于120 h時成熟卵子(F=11.40，P=0.007 1)、未成熟卵子(F=5.92，P=0.035 2)和總卵子數(F=20.12，P=0.001 2)均顯著增加；120～144 h各類卵子的數量相對穩(wěn)定。另外，發(fā)生卵子重吸收后雌蟲補充取食20%葡萄糖溶液與繼續(xù)取食清水相比，120 h時成熟卵子(t=-3.88，P=0.003 1)、未成熟卵子(t=-3.23，P=0.009 0)和總卵子數(t=-6.04，P=0.000 1)，及144 h時的成熟卵子(t=-3.26，P=0.008 6)、未成熟卵子(t=-2.24，P=0.049 0)和總卵子數(t=-3.79，P=0.003 5)均顯著多于繼續(xù)取食清水的同日齡雌蟲(表2)。而未交配取食20%葡萄糖溶液的雌蟲卵巢內成熟卵子的數量在羽化后72～96 h仍有增加的趨勢；羽化后96 h，取食20%葡萄糖溶液雌蟲卵巢內成熟卵子(F=22.59，P=0.000 1)、未成熟卵子(F=17.91，P=0.000 4)、總卵子(F=49.59，P<0.000 1)的數量也均顯著多于取食清水的對照組(表1)。

表2 未交配+清水處理下番茄潛葉蛾雌成蟲卵重吸收后提供清水或補充葡萄糖后的卵子數量比較1)Table 2 Comparison of eggs number of Tuta absoluta female adults after oosorption under unmated + water treatment after water supply or 20% glucose solution supplementation

從交配與否對卵子發(fā)生的影響來看，羽化后96 h，交配雌蟲取食清水形成的成熟卵子(F=77.88，P<0.000 1)、總卵子數(F=37.48，P<0.000 1)和取食20%葡萄糖溶液時的成熟卵子(F=41.47，P<0.000 1)均顯著多于未交配雌蟲相應的對照組。交配雌蟲羽化后24～48 h開始產卵，在96 h時，交配雌蟲取食清水、20%葡萄糖溶液產卵數分別已達(118.2±8.6)、(138.7±7.4)粒(表1)；而未交配雌蟲取食清水96 h后補充取食20%葡萄糖溶液，在羽化后120、144 h才有少量產卵，數量分別為(2.7±1.3)粒和(5.3±1.9)粒；未交配持續(xù)取食清水的雌蟲在144 h才開始產卵，數量為(5.8±2.4)粒(表2)。

3 結論與討論

昆蟲物種卵巢結構相似，主要由一對卵巢、中輸卵管、側輸卵管等組成，但昆蟲雌蟲卵巢內卵巢管數量差異很大，如鞘翅目的蓮草直胸跳甲Agasicleshygrophila每側卵巢管數多為12～16根[22]，異色瓢蟲Harmoniaaxyridis每側卵巢管數為25～33根[24]，而膜翅目的紅頸常室繭蜂Peristenusspretus的卵巢主要由6～10對卵巢管組成[25]。卵巢管含有不同數量、不同排列方式的卵子，前人根據卵巢管中卵子的滋養(yǎng)細胞有無和排列方式，將卵巢管分為無滋式(panoistic type)、端滋式(telotrophic type)和多滋式(polytrophic type)等3種模式[26]。本研究發(fā)現(xiàn)，番茄潛葉蛾卵巢管的數目基本為4對，與棉鈴蟲、蘋果蠹蛾、甜菜夜蛾Spodopteraexigua等鱗翅目昆蟲相似[27,20-22]；體視鏡下可見卵巢管內卵母細胞與滋養(yǎng)細胞交替出現(xiàn)，卵室內一個卵母細胞可伴隨著多個滋養(yǎng)細胞，卵巢管類型與鱗翅目昆蟲的相符，為多滋式[21]。雖然觀察發(fā)現(xiàn)個別雌蟲卵巢兩側的卵巢管數不等，但這一現(xiàn)象可能與雌蟲個體大小或其在幼蟲期所攝取營養(yǎng)量多寡有關，在其他昆蟲中也存在類似現(xiàn)象，如美洲斑潛蠅Liriomyzasativae兩側卵巢管總數多為13～15根，且左右兩側卵巢管數通常不等[28]；孟氏隱唇瓢蟲Cryptolaemusmontrouzieri每側卵巢分別含11～14根卵巢管，兩側卵巢管數量也多不相等[29]。

卵巢發(fā)育級別在害蟲預報中是一項重要指標，可以預測害蟲的發(fā)生期和發(fā)生量。在鱗翅目的重要農業(yè)害蟲如玉米螟、棉鈴蟲、蘋果蠹蛾、草地貪夜蛾Spodopterafrugiperda等卵巢發(fā)育的研究中，常將卵巢發(fā)育分為5個級別[19,21-22,30]。本研究在以往卵巢發(fā)育分級理論的基礎上，根據番茄潛葉蛾卵巢自身特點，將其雌成蟲的卵巢分為卵黃沉積前期(Ⅰ級)、卵黃沉積期(Ⅱ級)、成熟待產期(Ⅲ級)、產卵盛期(Ⅳ級)和產卵末期(Ⅴ級)5個級別(圖1)，并對各發(fā)育時期卵巢的脂肪體數量與顏色、卵黃沉積、卵子發(fā)育及卵巢管發(fā)育情況等加以描述，可為快速、準確判斷其卵巢的發(fā)育級別提供依據。

基于初羽化雌蟲卵巢中成熟卵的數量可將昆蟲分為卵熟型(proovigenic)和卵育型(synovigenic)兩種類型。卵熟型指雌蟲羽化時卵巢中的卵子已全部成熟，成蟲階段不需要再獲取用于卵熟的營養(yǎng)物質[31]。而卵育型是指雌蟲羽化時卵巢中沒有或只有部分成熟卵，雌蟲需要繼續(xù)取食用于滿足卵子成熟及持續(xù)產卵的營養(yǎng)[32]，如軒景麗等研究發(fā)現(xiàn)美洲斑潛蠅初羽化雌成蟲體內無卵子，且饑餓條件下幾乎不能形成成熟卵子[28]。本研究顯示，番茄潛葉蛾成蟲初羽化時，卵巢未發(fā)育成熟，卵巢內僅有未成熟卵；成蟲僅取食清水時成熟卵子、總卵子數也可達到較高水平，不需要通過攝入外界營養(yǎng)用于卵子發(fā)生、成熟與維持生命，屬于卵育型昆蟲。

雖然番茄潛葉蛾的卵子發(fā)生和卵子成熟無需依賴外界營養(yǎng)，但取食20%葡萄糖溶液對其卵子發(fā)生有明顯的促進作用，且即便缺乏額外營養(yǎng)的成蟲在發(fā)生卵子重吸收后更換為取食20%葡萄糖溶液，與繼續(xù)取食清水的個體相比，可觀察到其腹內有更多的脂肪體?？赡苁且驗槠咸烟侵苯犹峁┝司S持生命的能量，減少了雌蟲本身的資本營養(yǎng)如脂類物質的消耗，從而使雌蟲將資本營養(yǎng)優(yōu)先用于卵子發(fā)生和卵子成熟，且暫不需要重吸收卵子以轉化為維持生命的能量[33-34]。因此，在實驗室養(yǎng)殖中可通過補充葡萄糖來促進其種群增殖。但葡萄糖是否還直接參與了該蟲卵子發(fā)生所需脂類物質等的合成還有待明確。李棟等對番茄潛葉蛾的研究結果顯示，在實驗室條件下，與雄蟲兩兩配對的雌蟲在25°C和30°C時，壽命平均約9.24 d和7.87 d[35]。而本次試驗中時間梯度到144 h，此時雌蟲仍存活且腹內還剩有脂肪體，當羽化時間更長，雌蟲資本營養(yǎng)完全消耗且仍存活時，葡萄糖的補充能否合成用于卵子發(fā)生的脂類物質從而使雌蟲可繼續(xù)形成卵子值得進一步探究。

研究結果顯示，交配處理組，番茄潛葉蛾雌成蟲羽化后24～48 h開始大量產卵，而未交配時最早在120 h才見有少量產卵。且未交配+清水處理組，72 h時雌成蟲卵巢內成熟卵數量(抱卵量)達到高峰，96 h時由于部分卵子發(fā)生了重吸收而顯著減少?？赡芘c鱗翅目昆蟲的生存策略有關，雌蟲羽化時將營養(yǎng)優(yōu)先用于繁衍，形成一定數量的成熟卵子，交配受精后將可成熟的卵子大量產出；而未受精卵不能正常孵化。卵子的重吸收現(xiàn)象被認為是昆蟲在面臨環(huán)境脅迫時，為了繼續(xù)存活以便在脅迫解除時能繼續(xù)繁衍后代的一種生存策略[32]。番茄潛葉蛾雌成蟲也存在卵子重吸收現(xiàn)象。因此，雌蟲短時間內沒有選擇把卵子產出，而是將其轉化為維持生命的備用營養(yǎng)物質并保存于體內，根據實際需求，如一段時間出現(xiàn)資源缺失或不足或缺乏合適的產卵場所、無法交配等情況時，通過對其卵子的重吸收來繼續(xù)存活以便將來完成有效繁衍。類似的現(xiàn)象在其他物種的生殖發(fā)育研究中也有報道，如潛蠅姬小蜂Diglyphusisaea、印巴黃蚜小蜂Aphytismelinus等[33-34]。可以明確的是，雌蟲羽化后越早獲得交配機會，其卵子發(fā)生越早、成熟更快且產卵累計量更大。因此，在田間及時采取有效的防控措施以減少雌雄蟲交配的機會尤為重要，如誘捕法、迷向法等措施的應用[36-38]。