李 歡,朱海霞

(青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院,青海省農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部西寧作物有害生物科學(xué)觀(guān)測(cè)實(shí)驗(yàn)站,西寧 810016)

雜草在農(nóng)田中與農(nóng)作物爭(zhēng)奪養(yǎng)分、水分、陽(yáng)光和空間,大大降低了農(nóng)作物的產(chǎn)量和品質(zhì)[1]。據(jù)估計(jì),由于雜草的競(jìng)爭(zhēng),農(nóng)作物產(chǎn)量損失約為20%～35%[2]。在中國(guó),雜草造成的損失估計(jì)達(dá)數(shù)十億美元[3]。目前的雜草防治途徑主要是利用化學(xué)除草劑,由于化學(xué)除草劑的大量施用已造成環(huán)境污染、雜草產(chǎn)生抗藥性、農(nóng)藥殘留量大、毒害有益昆蟲(chóng)等負(fù)面影響[4-5]。隨著社會(huì)文明的發(fā)展和公眾健康意識(shí)的提高,開(kāi)發(fā)廣譜、高效、低毒的新型微生物除草劑和生物除草技術(shù)已成為大勢(shì)所趨。

鏈格孢屬真菌具有寄主范圍廣,傳播途徑多,侵染能力強(qiáng)等特點(diǎn)。全球已有超過(guò)500種鏈格孢的記錄,該菌能引起多種經(jīng)濟(jì)植物病害,如銀杏葉斑病[6]、楊樹(shù)葉枯病[7]、梨黑斑病[8]、核桃枯葉病[9]、鐵皮石斛枯梢病[10]、瓜果嫁接苗棕斑病[11]、煙草赤星病[12]、馬鈴薯早疫病[13]、白菜黑斑病[14]等。在雜草生物防治方面,鏈格孢也表現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景,已報(bào)道有10多種鏈格孢用于雜草防治[15]。Lawrie等[16-17]研究表明，鏈格孢Alternariaalternata可作為防除反枝莧Amaranthusretroflexus的生防菌,吳兆圓等[18]從感病的馬唐Digitariasanguinalis植株上分離到具有除草活性的鏈格孢屬真菌A.perpunctulataNBERC_H56,其發(fā)酵液對(duì)馬唐生長(zhǎng)有著顯著的抑制作用。王禹博等[19]將鏈格孢A.alternataSC-018發(fā)酵液進(jìn)行環(huán)境生物安全評(píng)估,發(fā)現(xiàn)可將其應(yīng)用在水稻田野慈姑等雜草的防除中。萬(wàn)佐璽等[20]和常纓等[21]的研究表明,寄生于紫莖澤蘭Ageratinaadenophora的鏈格孢產(chǎn)生的毒素有廣譜除草活性,具有開(kāi)發(fā)為防除紫莖澤蘭及其他雜草的生物源除草劑的潛力。Kausar等[22]的研究表明,A.brassicicola和A.gaisen的培養(yǎng)濾液對(duì)銀膠菊Partheniumhysterophorus有抑制作用。隨著研究不斷深入,鏈格孢作為雜草生防菌的地位逐漸提升,對(duì)農(nóng)田雜草防除起到積極作用。

本研究以自然罹病的老鸛草GeraniumwilfordiiMaxim.葉片上分離得到的鏈格孢菌株HY-063作為研究對(duì)象,并通過(guò)形態(tài)特征和分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合的方法對(duì)菌株進(jìn)行分離鑒定,采用柯赫氏法則驗(yàn)證其致病性,離體、活體接種法測(cè)定其對(duì)青海省常見(jiàn)闊葉雜草的防除效果,作物活體接種法明確該菌株對(duì)常見(jiàn)作物的安全性,為將該菌應(yīng)用于更廣泛的闊葉雜草生物防治奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病原菌的分離純化

2021年8月5日從青海省湟源縣采集自然感病的老鸛草葉片,按地理位置分類(lèi)編號(hào),裝入自封袋。

用常規(guī)組織分離法和單孢分離法進(jìn)行分離[23-24],雜草病樣用清水洗凈,剪取5 mm2病健交界處組織,經(jīng)表面消毒后接種在PDA培養(yǎng)基上于25℃下培育5～7 d,單孢純化后置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 病原菌鑒定

1.2.1形態(tài)學(xué)鑒定

將菌株HY-063置于PDA平板上于25℃培養(yǎng)箱中L∥D=12 h∥12 h光暗交替培養(yǎng),觀(guān)察菌落生長(zhǎng)速率、菌落外形及色澤變化,光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察其菌絲和孢子形態(tài)。參照《中國(guó)真菌志鏈格孢屬》[25]及《Alternaria,an identification manual》[26]的描述對(duì)該菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)分類(lèi)與鑒定。

1.2.2分子鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建

采用CATB法[25]提取菌株的基因組DNA。分別用通用引物ITS1和ITS4[28]、EF1-728F和 EF1-986R[29]、Alt-for和 Alt-rev[30](表1)進(jìn)行 PCR擴(kuò)增,引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系均為25 μL:正反向引物(10 μmol/L)各0.5 μL,DNA 模板 0.5 μL,10×PCR buffer 2.5 μL,Taq酶0.2 μL,ddH2O補(bǔ)齊。PCR反應(yīng)程序設(shè)置如下:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性45 s,55℃退火45 s,72℃延伸1 min,30 個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min,4℃保溫。擴(kuò)增完成后進(jìn)行電泳檢測(cè),用SanPrep柱DNA J凝膠回收試劑盒(SK8131,上海生工)回收純化的產(chǎn)物,并送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序,測(cè)序所得到的核苷酸序列與 GenBank中序列進(jìn)行 BLAST 比對(duì)分析,利用 Clustal X 1.8 和MEGA 7.0對(duì)序列進(jìn)行比較分析,采用鄰接法(neighbor-joining,NJ)對(duì)rDNA-ITS、EF-1α和Alta1序列進(jìn)行聚類(lèi)分析,構(gòu)建多基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[31]。并用自展法(bootstrap method)進(jìn)行檢驗(yàn),重復(fù)次數(shù)1 000次,以分析該菌與同屬不同種菌株間的親緣關(guān)系[32]。

表1 本研究所用的引物Table 1 Primers used in this study

1.2.3柯赫氏法則驗(yàn)證

從試驗(yàn)田采集新鮮、健康的老鸛草葉片用75%乙醇表面消毒5 min,無(wú)菌水沖洗3次,晾干。菌株連續(xù)活化3代,PDA平板上培養(yǎng)5 d。活化后取直徑為 0.8 cm 的菌餅倒置接種至老鸛草葉片上。以只接種無(wú)菌PDA瓊脂塊作為對(duì)照組,每處理重復(fù)3次,接種的老鸛草放置于(25±1)℃,L∥D=12 h∥12 h的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng),7 d后觀(guān)察葉片癥狀。按組織分離方法從接種后的發(fā)病組織中再次分離病原菌,兩次分離的菌株在形態(tài)上一致則可以確定為病原菌。

1.3 生防菌株HY-063對(duì)幾種雜草的致病力測(cè)定

1.3.1菌絲塊的致病性測(cè)定

從青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院試驗(yàn)田采集健康新鮮的酸模葉蓼PersicarialapathifoliaL.、藜ChenopodiumalbumLinnaeus、冬葵Malvaverticillatavar.crispa、密花香薷ElsholtziadensaBenth.、豬殃殃GaliumspuriumL.、反枝莧AmaranthusretroflexusL.的葉片,用無(wú)菌水沖洗3次后自然晾干,然后放置于墊有無(wú)菌濾紙的培養(yǎng)皿中(d=9 cm),每皿3～4片,無(wú)菌水浸濕濾紙?zhí)峁駶?rùn)的環(huán)境。從培養(yǎng)7 d的菌落邊緣打取菌絲塊(d=8 mm)接種到葉片正面,以接種無(wú)菌PDA培養(yǎng)基塊為對(duì)照,每處理設(shè)置3次重復(fù),置于(25±1)℃,L∥D=12 h∥12 h的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng),觀(guān)察葉片發(fā)病情況。

1.3.2發(fā)酵濾液的致病性測(cè)定

菌絲塊接種到PDB培養(yǎng)液(250 mL/瓶)中,每瓶5塊,在25℃、180 r/min的轉(zhuǎn)速搖動(dòng)培養(yǎng)120 h，用4層滅菌紗布過(guò)濾后得到發(fā)酵濾液,用噴霧接種法連續(xù)3 d接種到正常生長(zhǎng)的4～7葉期的盆栽雜草植株上,接種量25 mL/盆。接種后的雜草植株用塑料袋套袋保濕培養(yǎng)24 h后,放置于25～30℃、L∥D=12 h∥12 h人工氣候箱中,每處理重復(fù)3次,以接種無(wú)菌PDB培養(yǎng)液的植株作為對(duì)照,7 d 后觀(guān)察接種雜草的發(fā)病情況,計(jì)算發(fā)病率和鮮重防效。

1.4 生防菌株HY-063對(duì)作物的安全性

將5種青海主栽作物蠶豆Viciafaba、豌豆Pisumsativum、青稞Hordeumvulgare、小麥Triticumaestivum和油菜Brassicanapus分別種植于d=12 cm的花盆中,置于室內(nèi)培養(yǎng)。HY-063發(fā)酵液稀釋后,按上述1.3.2方法接種于 3～6 葉期的作物植株上。每處理重復(fù)3次,以接種無(wú)菌PDB培養(yǎng)液的作物作為對(duì)照,7 d 后調(diào)查發(fā)病情況。作物的安全性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)為:NS 表示植株無(wú)癥狀(無(wú)病斑,植株正常生長(zhǎng));LS表示有輕微影響(葉子上散布著零星病斑,生長(zhǎng)發(fā)育稍受控制);MS表示中等感病(1/5～1/4的葉面積出現(xiàn)病斑,生長(zhǎng)受抑制);SS 代表嚴(yán)重感病(植株大量枯死,生長(zhǎng)發(fā)育受?chē)?yán)重控制)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel和SPSS 25.0對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,并使用單因素方差分析(ANOVA)和最小顯著性差異法(LSD)比較差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學(xué)鑒定

HY-063菌落在PDA平板上初期為白色,后期逐漸發(fā)展為橄欖色或深綠色絲絨狀,邊緣整齊。氣生菌絲密集。菌絲無(wú)色有隔膜。分生孢子呈棕褐色或黑褐色,橢圓形、卵形、棒狀或倒梨形,有2～5個(gè)橫隔,0～3個(gè)縱隔,分隔處略有縊縮,喙為圓柱形或圓錐形(圖1)。根據(jù)致病菌的培養(yǎng)特征和形態(tài)特點(diǎn),該致病菌初步確認(rèn)為鏈格孢Alternariasp.

圖1 菌株HY-063的形態(tài)特征Fig.1 Morphological characteristics of strain HY-063

2.2 分子生物學(xué)鑒定結(jié)果及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

對(duì)菌株HY-063的rDNA-ITS、EF-1α、Alta1基因序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增,獲得了3個(gè)長(zhǎng)度依次為533、264 bp和477 bp的基因片段。根據(jù)病原菌rDNA-ITS、EF-1α、Alta1基因序列,以Ulocladiumconsortiale為外群構(gòu)建菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),發(fā)現(xiàn)HY-063與Alternariaalternata在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上聚在一起,且支持率為99%,通過(guò)這3個(gè)基因序列可以準(zhǔn)確地將鏈格孢與其他物種分離出來(lái),總體上表現(xiàn)出良好的保守性。根據(jù)HY-063的3個(gè)基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)合形態(tài)特征,將菌株HY-063鑒定為鏈格孢A.alternata。

2.3 柯赫氏法則驗(yàn)證結(jié)果

利用柯赫氏法則,對(duì)菌株HY-063回接老鸛草進(jìn)行致病性驗(yàn)證,試驗(yàn)結(jié)果顯示,接種菌株3 d后,老鸛草葉片開(kāi)始出現(xiàn)病狀,葉片接種位置出現(xiàn)穿透現(xiàn)象;5 d后病斑逐漸擴(kuò)大向外延伸,開(kāi)始出現(xiàn)褐色病斑;7 d后葉片黑褐色腐爛,部分病斑擴(kuò)大連成片,引起葉片枯死(圖3)。從發(fā)病的葉片上再次分離的病原菌與原接種菌株菌落形態(tài)完全相同,驗(yàn)證了該菌株的致病性。

2.4 對(duì)離體葉片的致病力

如圖4所示,采用HY-063菌絲塊接種離體葉片后,藜、密花香薷、冬葵、酸模葉蓼葉片均有大量白色菌絲產(chǎn)生,菌絲侵染產(chǎn)生大小不一的褐色病斑,病斑四周呈現(xiàn)黃褐色,且伴有失綠癥狀,7 d后4種雜草葉片95%發(fā)黑腐爛。豬殃殃葉片先是有大量菌絲生成,隨后接種部位出現(xiàn)萎蔫。反枝莧葉片先出現(xiàn)病斑,之后病斑逐漸擴(kuò)大,最終40%的葉片發(fā)黑發(fā)黃枯死。HY-063菌絲塊對(duì)不同雜草離體致病性強(qiáng)弱表現(xiàn)為:藜>密花香薷>冬葵>酸模葉蓼>反枝莧>豬殃殃。

圖2 基于rDNA-ITS,EF-1α和Alt a 1基因序列聯(lián)合構(gòu)建的菌株HY-063 NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 NJ phylogenetic tree of HY-063 and relative strains based on the combined rDNA-ITS,EF-1α and Alt a 1 gene sequences

圖3菌株HY-063對(duì)老鸛草的致病性驗(yàn)證Fig.3 Pathogenicity test of strain HY-063 to Geranium wilfordii

2.5 對(duì)盆栽苗的致病性

如圖5所示,噴施HY-063發(fā)酵濾液后7 d,6種雜草均出現(xiàn)不同程度的癥狀。藜出現(xiàn)萎蔫、逐步褪綠變黃,最后整株枯死;密花香薷出現(xiàn)大面積病斑,葉片有卷曲且干枯;冬葵、酸模葉蓼葉片出現(xiàn)少量病斑,后病斑逐漸蔓延;豬殃殃葉片卷曲,莖葉枯死后植株全部萎蔫;反枝莧植株葉緣部位卷曲且干枯,部分植株開(kāi)始枯萎。7 d后雜草無(wú)恢復(fù)跡象。根據(jù)發(fā)病率、鮮重防效的結(jié)果(表2)分析,藜、密花香薷、豬殃殃發(fā)病率高達(dá)90%以上,鮮重防效達(dá)80%以上。試驗(yàn)結(jié)果表明,該菌株發(fā)酵濾液對(duì)豬殃殃、藜和密花香薷具有較好的防除效果。

2.6 作物安全性

HY-063發(fā)酵濾液對(duì)蠶豆、豌豆、小麥、青稞相對(duì)安全,試驗(yàn)作物與空白對(duì)照相比長(zhǎng)勢(shì)及株高沒(méi)有受到任何影響,表現(xiàn)為無(wú)反應(yīng)(NS);油菜癥狀為輕微反應(yīng)(LS),部分葉片上有少許褐色病斑,后期呈現(xiàn)發(fā)黃萎蔫病狀,油菜株高抑制率為3.6%,感病率為4%(表3),后期病情不擴(kuò)展。

表2 菌株HY-063發(fā)酵濾液對(duì)不同雜草的致病性1)Table 2 Pathogenicity of strain HY-063 to different weeds

圖4 菌株HY-063對(duì)不同雜草離體葉片致病性(接種7 d)Fig.4 Pathogenicity of strain HY-063 against detached leaves of different weeds (seven days after inoculation)

圖5 菌株HY-063對(duì)盆栽雜草的致病性(接種后7 d)Fig.5 Pathogenicity of strain HY-063 against potted weeds (7 d after inoculation)

表3 供試作物對(duì)菌株HY-063的敏感性1)Table 3 Susceptibility of test crops to strain HY-063

圖6 菌株HY-063對(duì)作物的安全性(接種后7 d)Fig.6 Safety of strain HY-063 to crops (7 d after inoculation)

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)從自然發(fā)病的老鸛草葉片分離得到菌株HY-063,經(jīng)形態(tài)學(xué)觀(guān)察結(jié)合分子生物學(xué)鑒定,將該菌株確定為鏈格孢A.alternata。將HY-063 噴施于闊葉雜草藜、密花香薷、豬殃殃、冬葵、酸模葉蓼和反枝莧后,可導(dǎo)致6種雜草葉片發(fā)黃枯萎甚至整株枯死,接種于5種主栽作物后,除油菜有輕微發(fā)黃萎蔫的癥狀,蠶豆、豌豆、青稞和小麥4種作物無(wú)不良反應(yīng)。

近年來(lái)隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展,核糖體DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(rDNA-ITS)序列、翻譯延伸因子(EF-1α)基因序列、抗原相關(guān)蛋白基因(Alta1)序列、磷酸脫氨酶(gpd)、肌動(dòng)蛋白基因(ACT)、鈣調(diào)蛋白基因(CAL)、組蛋白基因(HIS)等核苷酸序列分析技術(shù)在真菌分類(lèi)上已廣泛應(yīng)用,這些基因?qū)︽湼矜邔倥c其相近屬及種間界定等發(fā)揮了一定作用。如于華榮等[33]利用EF-lα和rDNA-ITS基因序列分析通遼市高粱葉斑病的病原菌為交鏈孢A.alternata。王春明等[34]使用EF-lα、rDNA-ITS和Alta1基因序列相結(jié)合的分析技術(shù),確認(rèn)了二月蘭Orychophragmusviolaceus葉斑病病原菌為甘藍(lán)鏈格孢A.brassicicola,李凱旋[35]利用序列rDNA-ITS、GDP和TEF將紫藤Wisteriasinensis葉斑病的病原菌鑒定為A.alternata。本研究通過(guò)rDNA-ITS、EF-1α和Alta1三基因序列結(jié)合形態(tài)特點(diǎn),對(duì)分離自老鸛草的HY-063菌株的種類(lèi)鑒定及系統(tǒng)發(fā)育問(wèn)題展開(kāi)了研究,更易于在分子水平上了解A.alternata菌種的遺傳特征與進(jìn)化狀況。

大量研究表明,能夠分泌除草活性毒素的植物病原真菌主要集中在鏈格孢屬,來(lái)源于不同罹病植物的鏈格孢可產(chǎn)生多種毒素成分,應(yīng)用于雜草防治研究。從紫莖澤蘭Ageratinaadenophora上分離獲得的鏈格孢能產(chǎn)生致病毒素,代謝產(chǎn)物中分離到的細(xì)交鏈格孢菌酮酸(簡(jiǎn)稱(chēng)TeA毒素)通過(guò)抑制紫莖澤蘭葉片光系統(tǒng)Ⅱ的電子傳遞從而對(duì)其產(chǎn)生毒害作用[36-37]。此外,ALL-毒素對(duì)龍葵Solanumnigrum、曼陀羅Daturastramonium和紫莖澤蘭都有很好的防除效果[20]。百日鏈格孢Alternariazinniae產(chǎn)生的除草活性物對(duì)蒼耳Xanthiumstrumarium、紫莖澤蘭、加拿大一枝黃花Solidagocanadensis、小蓬草Erigeroncanadensis等菊科雜草及農(nóng)田、園林和草坪雜草均顯示具有一定的致病活性[38]。Zhao等[39]從A.alternataZHJG5菌株中分離出二苯a-吡喃酮衍生物,研究發(fā)現(xiàn)其可開(kāi)發(fā)為新農(nóng)藥先導(dǎo)化合物。本試驗(yàn)在探索菌株HY-063的除草活性時(shí),首先采用菌餅接種法確定了該菌株具備除草活性,進(jìn)一步以菌株發(fā)酵濾液接種活體盆栽植株,評(píng)價(jià)了該菌株對(duì)藜、豬殃殃和密花香薷等6種雜草的除草作用,確定了菌株HY-063活性物質(zhì)存在于代謝產(chǎn)物中,下一步將對(duì)活性物質(zhì)進(jìn)行系統(tǒng)鑒定。

本文從致病性、作物安全性以及形態(tài)分子鑒定方面展開(kāi)了基礎(chǔ)研究,表明鏈格孢菌株HY-063具有開(kāi)發(fā)成為豆科(蠶豆、豌豆)和禾本科(青稞、小麥)作物田防除闊葉雜草微生物除草劑的潛力。有必要將該菌株的除草機(jī)理、田間驗(yàn)證、劑型研制等進(jìn)行更深入系統(tǒng)的研究,為天然除草劑的研究開(kāi)發(fā)提供備選資源。