衣麗淑,許景升,徐 進,馮 潔,曲忠峰,田海月,張 昊,3*,陳萬權*

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學植物保護學院,蘭州 730070;2.中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所,植物病蟲害生物學國家重點實驗室,北京 100193;3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部國家植物保護甘谷觀測實驗站,天水 741000;4.山東省平度市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局,平度 266700;5.青島市農(nóng)業(yè)技術推廣中心,青島 266000)

鐮刀菌引起的小麥赤霉病(FHB)是一種毀滅性的病害,不僅影響小麥產(chǎn)量,還可產(chǎn)生多種真菌毒素污染麥粒,對人畜健康構(gòu)成威脅。由于缺乏抗性品種,化學防治成為防控赤霉病的主要手段。

在小麥抽穗揚花期施用苯并咪唑類(methyl benzimidazole carbamates,MBCs)殺菌劑,對防治小麥赤霉病取得了有目共睹的效果[1-3]。研究發(fā)現(xiàn)苯并咪唑類殺菌劑通過與病原真菌的β-微管蛋白結(jié)合影響微管的裝配,從而抑制病原菌的菌絲生長[4-7]。病原菌對苯并咪唑類殺菌劑的抗性是由β-微管蛋白基因的點突變引起氨基酸序列改變,使微管蛋白的構(gòu)象發(fā)生變化,殺菌劑與病原菌結(jié)合力降低所致。先前的研究表明,β-微管蛋白第6、50、167、198、200位和240位的氨基酸改變可引起病原菌對MBC的抗性[8-11]。在禾谷鐮刀菌復合種(FGSC)基因組中,有兩個同源的β-微管蛋白基因(Tub1 andTub2)。研究表明,赤霉病菌的抗藥菌株和敏感菌株具有相同的Tub1序列[1]。禾谷鐮刀菌復合種對苯并咪唑類的抗性主要是由于Tub2 (FGSG06611)突變,而不是Tub1 (FGSG09530)突變[12]。迄今為止,在具有苯并咪唑類抗性田間分離株中至少檢測到5種不同的Tub2基因突變類型:F167Y、E198L、E198Q、E198K和F200Y[2,12-14]。并且Tub2基因的不同密碼子突變和相同密碼子的不同替換均可導致對多菌靈不同的抗性水平。F167Y、E198Q和F200Y點突變導致菌株對多菌靈中度抗性,而E198L和E198K的點突變可導致菌株對多菌靈高度抗性[12,14]。在田間抗多菌靈赤霉菌中,F167Y、E198Q和F200Y是最常見的突變類型,前兩種的突變頻率可高達95%[15]。

自1972年將多菌靈用于防治小麥赤霉病,該殺菌劑在我國用于赤霉病的防治已有40多年的歷史[16]。由于其作用位點專一且?；詮?容易產(chǎn)生抗藥性,抗苯并咪唑類殺菌劑的菌株已在多種病原真菌中檢測出來[5,10,17-23]。我國從1985年起,就對禾谷鐮刀菌復合種的抗性問題進行持續(xù)監(jiān)測[24]。1992年首次在浙江省檢測到田間抗多菌靈的禾谷鐮刀菌菌株[25],隨后在長江中下游麥區(qū)的江蘇、安徽和上海地區(qū)不斷發(fā)現(xiàn)抗性菌株,隨著抗性群體的不斷擴大,多菌靈對江浙滬地區(qū)赤霉病的防治效果顯著下降[1-2,26]。張雁南等[27]和Zhang等[28]監(jiān)測了1985年-2008年江蘇省禾谷鐮刀菌復合種對多菌靈的抗性頻率,發(fā)現(xiàn)抗藥菌株頻率與赤霉病嚴重程度密切相關。在赤霉病暴發(fā)嚴重時農(nóng)民施用更多的多菌靈,增加了藥劑的選擇壓力,導致隨后幾年的抗性頻率升高。據(jù)報道,當抗性菌株占赤霉病菌群體10%時,多菌靈防治病害效果將下降37.5%[15]。Zhang等發(fā)現(xiàn)抗多菌靈菌株產(chǎn)生的毒素含量顯著高于敏感菌株[28],意味著在已經(jīng)產(chǎn)生抗性群體的地區(qū),多菌靈不僅不能有效防治病害,還會刺激病原菌在麥粒中的毒素產(chǎn)量。因此,監(jiān)測赤霉病菌對多菌靈的抗藥性頻率,對于防治赤霉病藥劑的選擇具有重要指導意義。

傳統(tǒng)的殺菌劑抗性檢測主要采用菌落直徑法,通過將田間分離得到的病原菌置于含藥培養(yǎng)基上,根據(jù)殺菌劑對菌絲生長的抑制作用鑒定是否為抗性菌株。該方法工作量大、耗時長,且在病原菌培養(yǎng)過程中易受雜菌污染,使結(jié)果發(fā)生偏差?；趩魏塑账岫鄳B(tài)性,分子生物學快速發(fā)展,已在植物病原菌對殺菌劑的抗性檢測方面廣泛應用。Luo等[29]應用PIRA-PCR技術檢測抗多菌靈的F167Y、F200Y菌株。Liu等[2]設計了等位基因特異性聚合酶鏈反應引物快速檢測含有F167Y、E198Q和F200Y突變的抗性菌株。Hou等[30]用環(huán)切PCR方法特異性檢測F167Y突變型的菌株。Duan等[31-32]建立了采用環(huán)介導等溫擴增技術(LAMP)快速檢測F167Y和F200Y突變型的菌株。Zhang等[33]建立了基于單核苷酸多態(tài)性位點確定基因型的方法,快速檢測赤霉病菌抗性菌株的不同突變類型。以上分子檢測方法比傳統(tǒng)菌絲生長抑制法具有快速、特異、準確的優(yōu)勢。

2018年我國小麥赤霉病大流行,發(fā)生面積超過666萬hm2,多菌靈仍然是部分麥區(qū)主要防控用藥之一。本研究采用分子檢測法,對2018年我國主要麥區(qū)赤霉病菌群體進行了多菌靈抗性突變位點檢測,明確各小麥產(chǎn)區(qū)赤霉病菌抗性頻率,為殺菌劑合理選用,延緩抗性,有效防治赤霉病提供重要依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試菌株于2018年采自黃淮麥區(qū)(河北、河南、山東和陜西)、長江中下游麥區(qū)(湖北、安徽和江蘇)以及西南麥區(qū)(四川)共8個省份,107個采樣點(表1),進行單孢分離純化[34],并根據(jù)Xin等[35]報道的快速提取植物組織中DNA的方法,提取赤霉病菌的基因組DNA,并用引物Fg16F和Fg16R[36]擴增基因組DNA(表2),根據(jù)擴增條帶大小區(qū)分Fusariumasiaticum和F.graminearum,其中F.asiaticum擴增片段大小為500 bp,F.graminearum擴增片段大小為400 bp,共獲得1 464株禾谷鐮刀菌復合種菌株(表3)。

表1 本研究8個省份107個采樣點信息列表Table 1 The information of 107 sampling sites in eight provinces in this study

表2 本研究使用的引物Table 2 Primers used in this study

1.2 試驗方法

1.2.1抗性菌株為F167Y、F200Y突變類型鑒定

采用Liu等[2]設計的PCR引物Tub2-F、167-RB及200-RB(表2)對鐮刀菌基因組DNA進行PCR擴增,其中F167Y、F200Y兩種突變類型的菌株擴增產(chǎn)物分別為398 bp和498 bp。PCR反應體系為20 μL,其中3個引物(10 μmol/L)各1 μL,2×TaqMix 10 μL,DNA模板 1 μL,雙重蒸餾水 6 μL。PCR反應程序:95℃預變性3 min;94℃變性30 s,57℃退火30 s,72℃延伸 45 s,35個循環(huán);72℃延伸5 min。

1.2.2抗性菌株為E198Q突變類型鑒定

采用引物Tub2-F和198-RB(表2)對鐮刀菌基因組DNA進行PCR擴增,產(chǎn)物片段大小為494 bp。PCR反應體系為20 μL,其中包含Tub2-F(10 μmol/L)1 μL,198-RB(10 μmol/L)1 μL,2×TaqMix 10 μL,DNA模板 1 μL,雙重蒸餾水 7 μL,PCR反應程序同1.2.1。

1.2.3凝膠電泳檢測條帶長度

將PCR擴增后的產(chǎn)物取5 μL于1.5%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測,EB染色后于凝膠成像系統(tǒng)檢測條帶大小。

2 結(jié)果與分析

2.1 多菌靈總體抗性頻率及抗性突變類型

1 464株菌株抗性檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)(表3),1 367株(93.37%)對多菌靈敏感,97株(6.63%)對多菌靈具有抗性;其中82株菌株(84.54%)突變類型為F167Y,11株(11.34%)為E198Q類型突變,4株(4.12%)為F200Y類型突變。

2.2 不同地區(qū)多菌靈抗性頻率及抗性突變類型

不同省份多菌靈抗性發(fā)生頻率不同,湖北、安徽、江蘇、河北、河南以及四川6個省份的多菌靈抗性頻率分別為0.34%、30.77%、40.83%、0.68%、2.52%、0.46%。山東、陜西兩省沒有發(fā)現(xiàn)多菌靈抗性菌株。其中,安徽多菌靈抗性菌株F167Y的點突變類型占85%,E198Q的點突變類型占15%。江蘇抗性菌株F167Y的點突變類型占86.96%,E198Q的點突變類型占7.25%,F200Y的點突變類型占5.8%。然而,河南與安徽和江蘇的結(jié)果相反,抗性菌株攜帶E198Q點突變頻率高于攜帶F167Y的點突變頻率。河北、湖北、四川3個省份均只發(fā)現(xiàn)含F(xiàn)167Y的點突變菌株(表3)。

表3 采樣地區(qū)、菌株數(shù)量及對多菌靈抗性菌株類型、抗性頻率Table 3 Sampling sites,number of isolates,types and resistance frequency of carbendazim-resistant isolates

3 討論

本研究對2018年采自我國主要麥區(qū)的1 464株小麥赤霉病菌菌株進行多菌靈抗性檢測,結(jié)果顯示:97株對多菌靈具有抗性,其總體抗性頻率為6.63%。自1992年首次檢測到多菌靈抗性菌株至今抗性頻率高達6.63%,說明病原菌對多菌靈抗性日益嚴重,抗性群體不斷擴大,將導致多菌靈防效降低甚至失效。通過比較8個省份多菌靈抗性發(fā)生頻率發(fā)現(xiàn),長江中下游麥區(qū)赤霉病菌抗性頻率明顯高于黃淮麥區(qū)的群體。原因可能與我國不同地區(qū)小麥生長季內(nèi)多菌靈的使用頻率不同有關。在江蘇、安徽等長江中下游麥區(qū)赤霉病流行頻率高,發(fā)生程度嚴重,常在小麥抽穗揚花期施用2～3次多菌靈等苯并咪唑類殺菌劑防控小麥赤霉病[3,14,3],而河北、河南等黃淮麥區(qū)其流行頻率較低且發(fā)生較輕,多菌靈的使用頻率較低。殺菌劑對病原菌種群施加選擇壓力,通常在一個季節(jié)使用殺菌劑越頻繁,檢測出抗殺菌劑菌株的頻率就越高[5]。

有研究報道F167Y是最常見的點突變類型[2,12]。本研究中優(yōu)勢點突變類型為F167Y,其次為E198Q和F200Y。其中F167Y和E198Q兩類突變頻率超過了95%,與2014年Liu 等報道的F167Y和E198Q為主要突變類型結(jié)論一致[15]。

本研究中安徽(30.77%)、江蘇(40.83%)、河南(2.52%)等省份的多菌靈抗性頻率,相比之前研究中安徽(8.2%)[14]、江蘇(15.3%)[37]、河南(1.2%)[38]的抗性頻率大幅度上升。Liu等[15]、戴大凱等[39]對河北、四川省多菌靈抗性檢測中未發(fā)現(xiàn)抗性菌株,而本試驗中檢測到頻率較低的抗性突變菌株。這與近幾年赤霉病的連續(xù)發(fā)生以及多菌靈持續(xù)用于防治赤霉病有關。這些結(jié)果表明，在多菌靈的選擇壓力下,抗多菌靈群體發(fā)展迅速。2010年和2012年我國小麥赤霉病大流行時,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)江蘇、安徽由于赤霉病菌抗性問題,多菌靈防效下降。近年來,管理部門在江淮地區(qū)推薦采用戊唑醇等殺菌劑替代多菌靈用于赤霉病防治,多菌靈在這些區(qū)域的使用量已經(jīng)大大降低。但我們的研究表明,江淮地區(qū)多菌靈抗性菌株頻率仍維持在較高水平。這可能是由于抗性菌株相比于敏感菌株具有更強的適合度[28],減少用藥量并不能在較短時間內(nèi)使抗性頻率下降。

4 結(jié)論

長江中下游麥區(qū)的安徽、江蘇兩省多菌靈抗性菌株普遍存在,黃淮及西南麥區(qū)也出現(xiàn)了較低頻率的抗性菌株。為防止抗性群體的進一步發(fā)展,致使多菌靈防治赤霉病失效,建議在多菌靈抗性嚴重的江蘇、安徽等地,選擇不同作用機理的殺菌劑如戊唑醇、氰烯菌酯替代多菌靈,在抗性頻率較低以及沒有檢測到抗性菌株的地區(qū),采用混配、復配藥劑、不同作用機理的殺菌劑交替輪換使用來防治小麥赤霉病。