楊武霞，劉寶山，吳玉紅，李潤杰，王夢曉，王愛迪△

免疫性血小板減少癥（primary immune thrombocytopenia，ITP）是以無明確誘因的孤立性外周血血小板減少為主要特點(diǎn)的一種常見的自身免疫性疾病，臨床表現(xiàn)為不同程度的出血，輕者可見皮膚黏膜出血，嚴(yán)重者可見內(nèi)臟及顱內(nèi)出血［1］。體液免疫失調(diào)和細(xì)胞免疫失調(diào)為ITP的主要發(fā)病機(jī)制。細(xì)胞免疫失調(diào)主要指T細(xì)胞功能異常，包括調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cells，Treg）數(shù)量減少和效應(yīng)性T細(xì)胞（effector T cells，Teff）數(shù)量增多等。樹突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）作為功能強(qiáng)大的抗原提呈細(xì)胞，在受到抗原刺激后可逐漸成熟，進(jìn)而激活T細(xì)胞，使初始T細(xì)胞增殖活化并分化為Treg和Teff，引起免疫功能紊亂，導(dǎo)致ITP的發(fā)生［2］。本研究旨在通過DC荷載血小板抗原與CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)，體外模擬ITP發(fā)病過程中T細(xì)胞被DC激活的情況，探討犀角地黃湯合方對DC激活的T細(xì)胞增殖分化的影響。

1 材料與方法

1.1 動物SPF級SD雄性大鼠10只，8周齡，體質(zhì)量（200±20）g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，動物許可證號：SCXK（京）2021-0011。飼養(yǎng)于易生源基因科技（天津）有限公司動物中心清潔級動物房，溫度20～26℃。適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，自由進(jìn)食和飲水。

1.2 研究對象選取2021年9月—2022年1月于天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院血液科住院的初診ITP患者8例，年齡18～50歲，診斷符合《成人原發(fā)免疫性血小板減少癥診斷與治療專家共識》（2016年版），且不伴有妊娠、糖尿病、高血壓、結(jié)核病和其他（如系統(tǒng)性紅斑狼瘡和強(qiáng)直性脊柱炎等）自身免疫性疾??；同期選取天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院健康志愿者15例，年齡18～50歲，排除妊娠、高血壓、糖尿病、結(jié)核病和其他自身免疫性疾病，且肝腎功能及血常規(guī)均正常。本研究符合醫(yī)學(xué)倫理要求并通過天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn)（IRB2020-KY-189），所有入選者均對研究知情同意。

1.3 主要試劑與儀器犀角地黃湯合方顆粒劑購自天津紅日康仁堂藥業(yè)，人全血單個核細(xì)胞分離液購自天津瀚洋生物制品有限責(zé)任公司，CD14免疫磁珠購自德國美天旎生物技術(shù)有限公司，重組人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GMCSF）、重組人白細(xì)胞介素（IL）-4及羧基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺酯（CFSE）均購自北京索萊寶生物工程有限公司，脂多糖（LPS）購自德國默克公司，PD-1抗體、CD4抗體、CD25抗體、叉頭框蛋白P3（FoxP3）抗體購自BD Bioscience公司；白細(xì)胞介素（IL）-2、干擾素-γ（IFN-γ）、IL-17、IL-10、轉(zhuǎn)化因子-β（TGF-β）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒均購自北京索萊寶生物工程有限公司。Transwell小室購自美國康寧公司、CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱Micro CL21R、常溫低速離心機(jī)、Presco 21Muitifuge XIR離心機(jī)均購自美國Thermo Fisher Scientific公司，超凈工作臺購自蘇州蘇凈儀器自控設(shè)備有限公司，Cytation 3型多功能酶標(biāo)儀購自美國Bio-Tek公司，流式細(xì)胞儀（FCM）購自安捷倫科技有限公司。

1.4 研究方法

1.4.1 犀角地黃湯合方含藥血清制備采用隨機(jī)數(shù)字表法將10只SD大鼠分為含藥血清組和空白血清組，每組5只。犀角地黃湯合方成人臨床常用量為水牛角30 g（先煎）、生地24 g、白芍12 g、丹皮9 g、當(dāng)歸6 g、黃芪30 g、旱蓮草15 g及女貞子15 g，根據(jù)《中藥藥理研究方法學(xué)》［3］按人與動物體表面積換算公式等效計(jì)量法確定大鼠用量為2 g/（kg·d），濃縮藥物含量至2 g/mL，4℃冰箱保存。給藥方法：含藥血清組給予犀角地黃湯合方灌胃，空白血清組給予等量蒸餾水灌胃，每日2次，連續(xù)灌胃3 d。末次給藥1 h后腹主動脈取血，靜置2 h后700×g離心10 min取上層血清，除菌滅活后放置于-20℃冰箱，備用。

1.4.2 CD14+T細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞獲取收取ITP患者和健康志愿者外周血50 mL，將血液等濃度稀釋后緩慢加入到人單個核細(xì)胞分離液上層，700×g離心20 min，液體分為4層，吸取第2層環(huán)狀乳白色層，磷酸緩沖鹽溶液（PBS）洗滌后得到外周血單個核細(xì)胞，計(jì)數(shù)，每1×107個細(xì)胞加入20 μL CD14+免疫磁珠，4℃孵育15 min后將細(xì)胞懸液通過磁力架上的細(xì)胞分選柱，得到CD14+T細(xì)胞。同樣的方法收集得到CD4+T細(xì)胞。

1.4.3 荷載血小板抗原的DC細(xì)胞培養(yǎng)將ITP患者自體血小板與CD14+T細(xì)胞以數(shù)量100∶1的比例加入到含10%胎牛血清及1%雙抗的1640培養(yǎng)基中重懸，并加入終濃度為5×104ng/L的IL-4及1×105ng/L的GM-CSF，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，再加入1×103μg/L的LPS繼續(xù)培養(yǎng)2 d，誘導(dǎo)成為荷載血小板抗原的成熟DC細(xì)胞。

1.4.4 CFSE標(biāo)記CD4+T細(xì)胞在進(jìn)行共培養(yǎng)檢測T細(xì)胞增殖能力前，將CD4+T先進(jìn)行CFSE染色，用PBS調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個/mL，并加入2×CFSE工作液，輕輕混勻。37℃避光孵育10 min，加入10 mL 37℃預(yù)熱的完全培養(yǎng)基，室溫顛倒混勻，終止標(biāo)記反應(yīng)。1 000 r/min離心5 min后棄上清液，再加入5 mL全培養(yǎng)基洗滌1次后與荷載血小板抗原的DC細(xì)胞構(gòu)建共培養(yǎng)體系。

1.4.5 建立DC與CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)體系并分組干預(yù)將荷載血小板抗原的DC與CD4+T細(xì)胞按照數(shù)量1∶10的比例培養(yǎng)于Transwell小室，DC接種于下室（1×105個/孔），CD4+T細(xì)胞接種于上室（1×106個/孔）。將共培養(yǎng)細(xì)胞分為對照組、模型組和犀角地黃湯合方低、中、高劑量組，對照組為荷載血小板抗原的DC與健康志愿者CD4+T細(xì)胞，模型組和犀角地黃湯合方低、中、高劑量組為荷載血小板抗原的DC與ITP患者的CD4+T細(xì)胞，其中對照組和模型組加入大鼠空白血清，犀角地黃湯合方低、中、高劑量組分別加入體積分?jǐn)?shù)5%、10%、20%大鼠含藥血清，干預(yù)72 h。

1.4.6 FCM檢測經(jīng)CFSE標(biāo)記的CD4+T細(xì)胞的增殖情況干預(yù)結(jié)束后，收集各組上室中的CD4+T細(xì)胞，并調(diào)整為6×105個/mL，PBS洗滌2次，流式細(xì)胞儀FL1通道檢測CD4+T細(xì)胞增殖情況。

1.4.7 FCM檢測CD4+T細(xì)胞中Treg和Teff的比例干預(yù)結(jié)束后，收集各組上室中的CD4+T細(xì)胞，并調(diào)整為6×105個/mL，PBS洗 滌2次，以CD4+CD25+FoxP3+標(biāo) 記Treg細(xì) 胞，CD4+CD25-標(biāo)記Teff，常溫避光反應(yīng)20 min后PBS洗滌2次，流式細(xì)胞術(shù)檢測CD4+T細(xì)胞中CD4+CD25+FoxP3+及CD4+CD25-表達(dá)率。

1.4.8 FCM檢測CD4+T表面PD-1表達(dá)量干預(yù)結(jié)束后，收集各組上室中的CD4+T細(xì)胞，并調(diào)整細(xì)胞濃度為6×105個/mL，PBS洗滌2次，加入PD-1抗體，常溫避光反應(yīng)20 min后PBS洗滌2次，流式細(xì)胞術(shù)檢測PD-1的表達(dá)量。

1.4.9 ELISA檢測共培養(yǎng)上清液中細(xì)胞因子的含量 干預(yù)完成后，收集共培養(yǎng)細(xì)胞上清液，按照ELISA檢測試劑盒說明書操作，檢測細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ、IL-17、IL-10、TGF-β的含量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用±s表示，多組間用單因素方差分析，方差齊者用單因素方差分析，組間多重比較用LSD-t法，方差不齊用Welch法，多重比較用Dunnett T3法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 倒置顯微鏡下DC和CD4+T細(xì)胞形態(tài)人外周血單個核細(xì)胞誘導(dǎo)的DC細(xì)胞培養(yǎng)到第7天時細(xì)胞成熟，大部分細(xì)胞懸浮生長，倒置顯微鏡下可見細(xì)胞邊緣有明顯的樹突樣突起；從外周血中分離出的CD4+T細(xì)胞亦懸浮生長，鏡下可見細(xì)胞呈圓形，體積較小，見圖1。

2.2 各組CD4+T細(xì)胞增殖情況比較對照組、模型組及犀角地黃湯合方低、中、高劑量組CD4+T細(xì)胞增殖比例分別為（單位：%）84.34±0.63、94.34±0.24、88.24±0.34、87.27±0.60、86.05±0.58（n=3，F(xiàn)=172.709，P＜0.05）；與對照組比較，其他各組CD4+T淋巴細(xì)胞增殖比例升高（P＜0.05）；與模型組比較，犀角地黃湯合方低、中、高劑量組CD4+T淋巴細(xì)胞增殖比例依次降低（P＜0.05），見圖2。

2.3 各組CD4+T細(xì)胞中Treg和Teff比例比較與對照組比較，各組Treg比例降低，Teff比例升高（P＜0.05）；與模型組比較，犀角地黃湯合方低、中、高劑量組Treg細(xì)胞比例升高，Teff比例依次降低（P＜0.05），見圖3、表1。

2.4 各組CD4+T細(xì)胞表面PD-1表達(dá)量比較對照組、模型組及犀角地黃湯合方低、中、高劑量組CD4+T細(xì)胞PD-1的表達(dá)量分別為（單位：%）：9.03±0.45、4.83±0.60、5.35±0.94、5.94±0.48、8.37±0.18（n=3，F(xiàn)=1 616.023，P＜0.05），與對照組比較，各組CD4+T細(xì)胞上PD-1的表達(dá)量減少（P＜0.05）；與模型組比較，犀角地黃湯合方低、中、高劑量組CD4+T細(xì)胞上PD-1表達(dá)量依次升高（P＜0.05），見圖4。

Fig.1 DC and CD4+T cells and co-culture morphology of DC and CD4+T cells under inverted microscope圖1倒置顯微鏡下DC、CD4+T細(xì)胞及DC與CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)形態(tài)

Fig.2 Effects of XJDHHF on DC-induced CD4+T cell proliferation圖2 DC誘導(dǎo)后各組CD4+T細(xì)胞增殖的水平

Fig.3 The proportion of Treg and Teff in CD4+T cells in each group圖3各組CD4+T細(xì)胞中Treg、Teff的比例

Tab.1 The proportion of Treg and Teff cells in CD4+T cells in each group表1各組細(xì)胞中Treg和Teff細(xì)胞所占CD4+T細(xì)胞的比例（n=3，%，±s）

Tab.1 The proportion of Treg and Teff cells in CD4+T cells in each group表1各組細(xì)胞中Treg和Teff細(xì)胞所占CD4+T細(xì)胞的比例（n=3，%，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與模型組比較，c與低劑量比較，d與中劑量比較，P＜0.05。

組別對照組模型組犀角地黃湯合方低劑量組犀角地黃湯合方中劑量組犀角地黃湯合方高劑量組F Treg 8.82±0.11 3.46±1.11a 4.09±0.13ab 5.23±0.95abc 6.47±0.45abc 747.550＊＊Teff 67.75±1.20 82.54±0.66a 79.50±0.69ab 76.57±0.97abc 72.02±1.70abcd 83.971＊＊

2.5 各組CD4+T細(xì)胞下游效應(yīng)因子分泌水平比較與對照組比較，各組的促炎因子IL-2、IFN-γ、IL-17水平升高，抑炎因子IL-10、TGF-β水平降低，但高劑量組IFN-γ和IL-10與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與模型組比較，犀角地黃湯合方低、中、高劑量組促炎因子IL-2水平降低，抑炎因子IL-10、TGF-β水平升高（P＜0.05）；低、中、高劑量組IFN-γ、IL-17依次降低，但低劑量組IFN-γ、IL-17與模型組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；TGF-β水平依次升高（P＜0.05），見表2。

3 討論

目前，ITP的一線治療方案包括輸注糖皮質(zhì)激素、免疫球蛋白、血小板生成素（TPO）受體激動劑、脾切除術(shù)及免疫抑制劑等［4］。盡管這些治療方案在短期內(nèi)對ITP具有一定效果，但其不良反應(yīng)較大，長期緩解率較低。ITP在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中被稱為“紫癜病”［5］。根據(jù)其“熱”、“虛”、“瘀”的病因病機(jī)，劉寶山教授采用“益氣養(yǎng)陰、涼血化瘀”的治療法則，擬定以犀角地黃湯（水牛角代、生地黃、白芍、丹皮）為主方，加用當(dāng)歸補(bǔ)血湯（當(dāng)歸、黃芪）和二至丸（女貞子、旱蓮草）治療本病，臨床效果顯著［6］。

Fig.4 Expression levels of PD-1 on CD4+T cells in each group圖4各組CD4+T細(xì)胞表面PD-1表達(dá)量

Tab.2 The amount of downstream effectors secreted by CD4+T cells in each group表2各組CD4+T細(xì)胞下游效應(yīng)因子分泌的量 （n=3，ng/L，±s）

Tab.2 The amount of downstream effectors secreted by CD4+T cells in each group表2各組CD4+T細(xì)胞下游效應(yīng)因子分泌的量 （n=3，ng/L，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與模型組比較，c與犀角地黃湯合方低劑量比較，d與犀角地黃湯合方中劑量比較，P＜0.05。

組別對照組模型組犀角地黃湯合方低劑量組犀角地黃湯合方中劑量組犀角地黃湯合方高劑量組F IL-2 15.77±3.46 137.56±7.19a 51.71±3.30ab 27.98±0.51abc 27.52±1.53abc 476.357＊＊150.24±10.71 809.56±41.18a 685.93±7.45a 467.41±21.54abc 381.29±56.48bcd 915.451＊＊IFN-γ IL-17 118.80±3.27 520.29±9.96a 515.86±3.51a 456.48±5.25abc 327.08±6.59abcd 2 226.488＊＊IL-10 47.22±2.54 16.45±3.70a 27.76±3.05ab 31.81±2.43ab 41.54±4.39bc 39.683＊＊TGF-β 609.51±9.39 200.84±3.69a 213.98±1.91ab 311.57±3.60abc 481.23±7.04abcd 2 810.404＊＊

既往觀點(diǎn)認(rèn)為，ITP的發(fā)病機(jī)制主要是體液免疫失調(diào)導(dǎo)致的血小板過度破壞和血小板生成受抑。近年來，越來越多的研究聚焦于細(xì)胞免疫失調(diào)，其中CD4+T細(xì)胞穩(wěn)態(tài)失調(diào)在ITP的病理生理過程中發(fā)揮重要作用［7］。CD4+T細(xì)胞穩(wěn)態(tài)失調(diào)表現(xiàn)為Treg數(shù)量和功能下降，以及Teff過度活化、增殖能力增強(qiáng)［8］。T細(xì)胞的激活需要DC參與并提供3種信號：第一信號是外源性抗原肽與DC表面主要組織相容性復(fù)合體（MHC）分子結(jié)合形成的MHC分子-抗原肽復(fù)合物，與T細(xì)胞表面受體（TCR）相互作用；第二信號是DC表面表達(dá)的協(xié)同共刺激分子CD80、CD86和人類白細(xì)胞DR抗原（HLA-DR）等與T細(xì)胞表面分子如CD28相互作用后產(chǎn)生共刺激信號；第三信號是DC分泌產(chǎn)生的細(xì)胞因子如IL-12、TNF-α、IL-6等，直接影響T細(xì)胞的分化方向。CD4+T細(xì)胞被DC激活后可以增殖分化為Treg細(xì)胞和Teff細(xì)胞［9-10］。Treg和Teff是初始T細(xì)胞被激活后增殖分化的兩種功能不同的T細(xì)胞亞群，其中Treg細(xì)胞是限制免疫和確保免疫耐受的重要檢查點(diǎn)，可通過分泌IL-10、TGF-β等細(xì)胞因子促進(jìn)CD4+T細(xì)胞不斷分化，或通過細(xì)胞間接觸抑制效應(yīng)性免疫細(xì)胞的活化和增殖，發(fā)揮免疫負(fù)調(diào)控作用，從而維持機(jī)體的免疫平衡［11］。Teff細(xì)胞是執(zhí)行免疫功能的主要細(xì)胞，當(dāng)Teff細(xì)胞分泌的炎性因子IL-2、IFN-γ、IL-17等過多時，可導(dǎo)致自身免疫或過敏性疾病的發(fā)生［12］。

本課題前期研究證實(shí)，犀角地黃湯合方可以修復(fù)Teff/Treg失衡，這可能與抑制磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號通路活化有關(guān)［6］。本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組CD4+T增殖比例明顯增加，Treg比例明顯降低，Teff比例明顯升高，且促炎因子IL-2、IL-17、IFN-γ水平較高，抑炎因子TGF-β、IL-10水平較低，表明血小板預(yù)載活化的DC細(xì)胞可以激活I(lǐng)TP患者CD4+T細(xì)胞過度增殖，導(dǎo)致ITP細(xì)胞模型發(fā)生過度免疫反應(yīng)。經(jīng)犀角地黃湯合方含藥血清干預(yù)后，與模型組比較，犀角地黃湯合方低中高劑量組CD4+T增殖比例下降，且Treg比例上升，Teff比例下降，IL-2、IL-17、IFN-γ等促炎因子水平下降，抑炎因子TGF-β和IL-10水平上升，提示犀角地黃湯合方含藥血清尤其是高劑量組可在體外抑制CD4+T的過度增殖，糾正ITP患者Teff和Treg的比例失衡，調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的分泌，維持機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)。

PD-1是一種共抑制性表面受體，可影響T細(xì)胞的分化，抑制炎癥介質(zhì)的釋放，促進(jìn)Treg細(xì)胞生成，在免疫應(yīng)答調(diào)控、免疫耐受的建立中發(fā)揮重要作用。PD-1主要通過與其配體PD-L1結(jié)合，促使TCR復(fù)合物中的信號分子去磷酸化，抑制TCR信號傳導(dǎo)，進(jìn)一步抑制T細(xì)胞增殖活化、并抑制炎性細(xì)胞因子分泌［13］。本研究顯示，與對照組比較，模型組PD-1的表達(dá)量明顯減少，提示ITP患者細(xì)胞模型存在免疫功能失調(diào)，經(jīng)犀角地黃湯合方含藥血清干預(yù)后，犀角地黃湯合方低、中、高劑量組PD-1表達(dá)量依次升高，提示犀角地黃湯合方尤其是高劑量組可以提高T細(xì)胞表面PD-1的表達(dá)，抑制TCR信號的傳導(dǎo)，進(jìn)而影響T細(xì)胞的增殖分化。

綜述所述，犀角地黃湯合方含藥血清可以在體外提高CD4+T細(xì)胞表面PD-1的表達(dá)，抑制T細(xì)胞的過度增殖活化，進(jìn)而影響T細(xì)胞的分化，促進(jìn)Treg細(xì)胞的生成，抑制Teff細(xì)胞的生成，使促炎因子IL-2、IL-17、IFN-γ分泌減少，抑炎因子TGF-β、IL-10分泌增多。有利于機(jī)體恢復(fù)免疫平衡穩(wěn)態(tài)，對ITP產(chǎn)生積極作用。