侯甜，秦雅芝，張妍，溫國(guó)琛，張嘯，董偉

糖尿病性骨質(zhì)疏松癥（diabetic osteoporosis，DOP）發(fā)病機(jī)制涉及糖基化終末產(chǎn)物增加及成骨細(xì)胞活性降低等［1］。高葡萄糖環(huán)境對(duì)成骨細(xì)胞增殖和分化的抑制作用可能是多種機(jī)制相互作用的結(jié)果［2］。唑來(lái)膦酸鹽（zoledronate，ZOL）是臨床使用中最有效和最長(zhǎng)效的雙膦酸鹽（biphosphonates，BPs）類藥物之一，可治療原發(fā)性或繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥［3］。然而，目前關(guān)于ZOL在高糖微環(huán)境下對(duì)成骨細(xì)胞分化的確切作用機(jī)制還需進(jìn)一步明確。研究顯示，ZOL能促進(jìn)小鼠前成骨細(xì)胞MC3T3-E1的骨鈣素表達(dá)，調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的分化［4］。p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated kinase，p38 MAPK）信號(hào)途徑是參與成骨細(xì)胞分化的關(guān)鍵途徑之一，可調(diào)節(jié)復(fù)雜的細(xì)胞程序［5］。在骨骼生成過(guò)程中，Wnt信號(hào)通路在各類細(xì)胞的成骨機(jī)制中同樣發(fā)揮著關(guān)鍵作用［6］。本研究旨在探討高糖微環(huán)境下ZOL在MC3T3-E1細(xì)胞分化過(guò)程中的影響及p38 MAPK通路的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料細(xì)胞MC3T3-E1購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物所。p38 MAPK通路抑制劑SB203580購(gòu)于Selleck公司；四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）、鬼筆環(huán)肽、4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色液均購(gòu)于Sigma-Aldrich公司；胎牛血清（FBS）、DMEM培養(yǎng)基購(gòu)于BI公司；BCA試劑盒、胰酶、碘化丙啶（PI）染色液、二甲基亞砜（DMSO）均購(gòu)于Beyotime公司；堿性磷酸酶（ALP）試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所；聚偏二氟乙烯（PVDF）膜購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司；茜素紅染色液購(gòu)于北京雷根生物技術(shù)有限公司；兔抗小鼠p38 MAPK一抗、p-p38 MAPK一抗購(gòu)于Cell Signaling公司；兔抗小鼠Wnt5a一抗購(gòu)于SCBT公司；兔抗小鼠骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（BMP2）一抗購(gòu)于GeneTex公司；兔抗小鼠Ⅰ型膠原蛋白（COLⅠ）一抗購(gòu)于Affinity公司；兔抗小鼠GAPDH、異硫氰酸熒光素（FITC）偶聯(lián)的山羊抗鼠二抗、四甲基羅丹明異硫氰酸鹽（TRITC）偶聯(lián)的山羊抗兔二抗均購(gòu)于Proteintech公司；羊抗兔二抗購(gòu)于KPL公司。CO2培養(yǎng)箱購(gòu)于上海博訊實(shí)業(yè)有限公司，熒光顯微鏡購(gòu)于OLYMPUS公司，超凈工作臺(tái)購(gòu)于青島海爾公司，全自動(dòng)酶標(biāo)儀購(gòu)于上海永創(chuàng)醫(yī)療器械有限公司。

1.2研究方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組將凍存的MC3T3-E1細(xì)胞在37℃水浴箱中復(fù)蘇，復(fù)蘇后的細(xì)胞培養(yǎng)在含10%FBS、1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基中，隔天換液，當(dāng)密度達(dá)80%~90%時(shí)，用胰酶消化，傳代培養(yǎng)。依處理方法的不同，將MC3T3-E1細(xì)胞分為低糖（LG）組、LG+ZOL組、高糖（HG）組、HG+ZOL組。在Western blot實(shí) 驗(yàn) 中 加 入 第5組：HG+ZOL+SB203580組。SB203580濃度為10 μmol/L，LG、HG分別為5.5 mmol/L和16.5 mmol/L的葡萄糖，ZOL為0.1 μmol/L。

1.2.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力將MC3T3-E1細(xì)胞消化完成后調(diào)整密度為4 000個(gè)/孔，將細(xì)胞懸液移至96孔板，每孔滴加100 μL細(xì)胞懸液。待細(xì)胞完全貼壁伸展后棄掉原培養(yǎng)基，按1.2.1實(shí)驗(yàn)分組對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞進(jìn)行處理。培養(yǎng)至24、48、72 h時(shí)，吸去上清液，PBS洗滌2遍，加入MTT（5 g/L）20 μL/孔，在37℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸去上清液，分別加入DMSO 150 μL/孔，震蕩15 min，使藍(lán)紫色結(jié)晶溶解。使用酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定細(xì)胞的吸光度（A）值。

1.2.3 細(xì)胞骨架熒光染色在6孔板中提前放置好細(xì)胞爬片，取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的MC3T3-E1細(xì)胞，將其消化為細(xì)胞懸液，細(xì)胞以2×104個(gè)/孔的密度接種在6孔板中，每孔滴加細(xì)胞懸液為1 mL。待細(xì)胞完全貼壁伸展后按1.2.1分組對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞進(jìn)行處理。24 h后棄去孔板內(nèi)液體，PBS洗2遍，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞，0.5%Triton X-100透化10 min，PBS再次洗滌，向孔板內(nèi)加入200 μL濃度為100 nmol/L的鬼筆環(huán)肽染液，覆蓋細(xì)胞爬片，避光孵育3 h，隨后用PI染液復(fù)染核5 min。熒光顯微鏡下采集照片并觀察細(xì)胞骨架，用Image J軟件分析細(xì)胞數(shù)目。

1.2.4 ALP活性定量檢測(cè)將MC3T3-E1細(xì)胞消化完成后收集細(xì)胞懸液，以1×104個(gè)/孔的細(xì)胞密度轉(zhuǎn)移至24孔板，每孔滴入500 μL細(xì)胞懸液。待細(xì)胞完全貼壁伸展后，按1.2.1分組處理，同時(shí)各組添加成骨誘導(dǎo)液連續(xù)誘導(dǎo)7 d，隔天換液。檢測(cè)過(guò)程按試劑盒說(shuō)明書(shū)中的操作步驟進(jìn)行，于520 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)孔板內(nèi)細(xì)胞的A值，根據(jù)說(shuō)明書(shū)計(jì)算ALP活性。

1.2.5 茜素紅染色檢測(cè)礦化結(jié)節(jié)生成情況將MC3T3-E1細(xì)胞消化完成后按1×104個(gè)/孔的接種密度將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至24孔板，每孔滴入500 μL細(xì)胞懸液。待細(xì)胞完全貼壁伸展后，按1.2.1分組處理，各組添加成骨誘導(dǎo)液連續(xù)誘導(dǎo)21 d，隔天換液，95%乙醇固定細(xì)胞30 min，茜素紅染液對(duì)結(jié)節(jié)染色5 min。Image J軟件分析茜素紅染色陽(yáng)性區(qū)域占總區(qū)域的百分比表示礦化結(jié)節(jié)生成情況。

1.2.6 免疫熒光法檢測(cè)MC3T3-E1細(xì)胞的Wnt5a、p38 MAPK表達(dá)在6孔板內(nèi)放置好細(xì)胞爬片，將MC3T3-E1細(xì)胞消化完成后，以4×104個(gè)/孔的密度接種，向6孔板中的爬片上滴加1 mL細(xì)胞懸液。待細(xì)胞完全貼壁伸展后按1.2.1分組更換培養(yǎng)基。24 h后棄去培養(yǎng)基，爬片上滴加4%多聚甲醛后固定30 min，10%山羊血清封閉30 min，棄液后向孔板內(nèi)各組爬片滴加抗體Wnt5a（1∶50）、p38 MAPK（1∶50），4℃孵育過(guò)夜。第2天向孔內(nèi)爬片加入FITC、TRITC標(biāo)記的二抗，37℃條件下孵育2 h，DAPI染核2 min。熒光顯微鏡下觀察各組Wnt5a、p38 MAPK的表達(dá)，Image J軟件分析各組細(xì)胞的平均熒光表達(dá)強(qiáng)度。

1.2.7 Western blot檢測(cè)Wnt5a、p38 MAPK、p-p38 MAPK、BMP2和COLⅠ蛋白表達(dá)MC3T3-E1細(xì)胞懸液移至6孔板中。按1.2.1分組更換培養(yǎng)基并添加成骨誘導(dǎo)液連續(xù)誘導(dǎo)7 d，隔天換液。用預(yù)冷的PBS沖洗后，裂解液提取各組細(xì)胞總蛋白，用BCA試劑盒測(cè)蛋白濃度，經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，將蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜上，封閉液封閉2 h，加入一抗Wnt5a（1∶1 000）、p38 MAPK（1∶1 000）、p-p38 MAPK（1∶1 000）、BMP2（1∶500）、COLⅠ（1∶500）、GAPDH（1∶2 000），放入4℃冰箱內(nèi)過(guò)夜。第2天加入羊抗兔二抗（1∶5 000），37℃條件下孵育1 h，洗膜后加入發(fā)光液顯影，數(shù)字成像系統(tǒng)檢測(cè)蛋白條帶，Image J軟件分析其灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 26.0軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MC3T3-E1細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)增殖水平的比較在細(xì)胞培養(yǎng)24、48、72 h后，LG組、LG+ZOL組、HG組、HG+ZOL組MC3T3-E1細(xì)胞增殖活性差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見(jiàn)圖1。

Fig.1 The proliferation levels of cells detected by MTT assay at different time points圖1 MTT法檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞的增殖水平

2.2 各組MC3T3-E1細(xì)胞骨架清晰程度及細(xì)胞數(shù)量比較染色結(jié)果顯示，與LG組相比，LG+ZOL組細(xì)胞骨架更為清晰，細(xì)胞數(shù)目增多，HG組細(xì)胞微絲排列紊亂，細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)不甚清晰且細(xì)胞數(shù)目少（P＜0.05）；與HG組相比，HG+ZOL組細(xì)胞骨架清晰程度有所提升，細(xì)胞內(nèi)部構(gòu)造更為清晰，細(xì)胞伸展良好且數(shù)目增多（P＜0.05），見(jiàn)圖2。

2.3 各組MC3T3-E1細(xì)胞ALP活性比較與LG組相比，LG+ZOL組ALP活性升高，HG組ALP活性降低（P＜0.05）；HG+ZOL組ALP活性較HG組升高（P＜0.05），見(jiàn)圖3。

2.4 各組MC3T3-E1細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)結(jié)果比較與LG組相比，LG+ZOL組礦化結(jié)節(jié)形成大而多，HG組礦化結(jié)節(jié)量少（P＜0.05）；與HG組相比，HG+ZOL組礦化結(jié)節(jié)增多（P＜0.05）。見(jiàn)圖4。

Fig.2 The cell cytoskeleton clarity of cells detected by phalloidin staining圖2鬼筆環(huán)肽染色檢測(cè)細(xì)胞骨架的清晰度及細(xì)胞數(shù)量

Fig.3 Comparison of the ALP activity between the four groups of cells圖3各組細(xì)胞ALP活性的比較

2.5 各組MC3T3-E1細(xì)胞Wnt5a、p38 MAPK表達(dá)結(jié)果 比 較與LG組 相 比，LG+ZOL組Wnt5a、p38 MAPK的熒光表達(dá)強(qiáng)度明顯增加，HG組Wnt5a、p38 MAPK的熒光表達(dá)強(qiáng)度明顯下降（P＜0.05）；與HG組相比，HG+ZOL組Wnt5a、p38 MAPK的熒光表達(dá)強(qiáng)度增加（P＜0.05），見(jiàn)圖5。

2.6 各組MC3T3-E1細(xì)胞中Wnt5a、p38 MAPK、pp38 MAPK、BMP2和COLⅠ蛋白表達(dá)水平的比較Western blot結(jié)果顯示，與LG組相比，LG+ZOL組Wnt5a、p38 MAPK、p-p38 MAPK、BMP2和COLⅠ蛋白表達(dá)明顯增加，HG組上述蛋白表達(dá)明顯下降（P＜0.05）；與HG組相比，HG+ZOL組上述蛋白表達(dá)增加（P＜0.05）；HG+ZOL+SB203580組MC3T3-E1細(xì)胞中上述蛋白表達(dá)與HG+ZOL組相比明顯減少（P＜0.05），見(jiàn)表1、圖6。

Fig.4 The generation of mineralized nodules of cells detected by alizarin red staining圖4茜素紅染色法檢測(cè)細(xì)胞的礦化結(jié)節(jié)的生成

3 討論

3.1 高糖抑制MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化目前，DOP的發(fā)病率不斷上升，其骨折風(fēng)險(xiǎn)隨著病程和血糖控制不佳而增加［7-8］。DOP的病因機(jī)制是多方面的，目前尚不清楚其確切的發(fā)病機(jī)制。COLⅠ被認(rèn)為是一種重要的結(jié)構(gòu)蛋白，與成骨分化密切相關(guān)［9］。有研究指出，高糖狀態(tài)下糖基化終末產(chǎn)物的形成可減少COLⅠ的形成并抑制MC3T3-E1細(xì)胞的成骨分化［10］。Doherty等［11］認(rèn)為，高糖狀態(tài)下會(huì)使得骨膜細(xì)胞的增殖能力以及成骨活性降低，導(dǎo)致骨形成減少，骨骼愈合能力嚴(yán)重受損。此外，MC3T3-E1細(xì)胞骨架除維持形態(tài)外，還可積極參與細(xì)胞的增殖、分化過(guò)程，進(jìn)而影響骨形成［12］。本研究結(jié)果顯示，相較于LG組，HG組細(xì)胞的骨架清晰度、ALP活性、礦化結(jié)節(jié)生成情況及成骨標(biāo)志物BMP2、COLⅠ蛋白表達(dá)水平均有所下降。以上結(jié)果表明，在高糖微環(huán)境下MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化能力被減弱。

3.2 低濃度ZOL促進(jìn)高糖微環(huán)境下MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化BPs是DOP患者的一線治療藥物［13］。目前，ZOL的相關(guān)報(bào)道多關(guān)于破骨細(xì)胞，其可有效抑制破骨細(xì)胞的分化，進(jìn)而抑制骨吸收［14-15］。同時(shí)，有研究指出ZOL濃度對(duì)于間充質(zhì)干細(xì)胞有著雙重作用，低濃度促進(jìn)其成骨分化，高濃度則抑制［16］。而國(guó)內(nèi)外關(guān)于低濃度ZOL對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞的成骨分化調(diào)節(jié)作用以及在高糖微環(huán)境下的相關(guān)機(jī)制仍未明確。在本研究中選用0.1 μmol/L ZOL對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果顯示LG+ZOL組較LG組，HG+ZOL組較HG組的細(xì)胞骨架清晰度、ALP活性、礦化結(jié)節(jié)生成情況及成骨相關(guān)蛋白BMP2、COLⅠ蛋白表達(dá)水平均顯著升高。由此提示低濃度的ZOL對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化有促進(jìn)作用，同時(shí)可有效改善高糖微環(huán)境下對(duì)其成骨分化的抑制。

3.3 ZOL通過(guò)p38 MAPK信號(hào)途徑影響高糖微環(huán)境下MC3T3-E1細(xì)胞的成骨分化作為MAPK家族中的一個(gè)重要成員，p38 MAPK信號(hào)途徑參與了不同細(xì)胞中各種細(xì)胞因子的成骨調(diào)節(jié)過(guò)程［17］。除了MAPK，Wnt家族在成骨方面也發(fā)揮著關(guān)鍵作用。Wnt5a是Wnt蛋白家族非經(jīng)典途徑中最具代表性的蛋白，其可通過(guò)Wnt/平面細(xì)胞極性或Wnt/Ca2+途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)其功能［18］。研究表明，靶向干預(yù)Wnt5a可能是改善代謝性骨骼疾?。ㄈ绻琴|(zhì)疏松癥）的可行策略［19］。因此，Wnt5a及其相關(guān)信號(hào)通路可能是骨相關(guān)疾病治療的重要作用靶點(diǎn)。但是，在高糖微環(huán)境下ZOL對(duì)于MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化的確切機(jī)制尚有待闡明。本研究在Western blot實(shí)驗(yàn)中增加了HG+ZOL+SB203580組。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HG+ZOL+SB203580組Wnt5a、p38 MAPK、p-p38 MAPK、BMP2和COLⅠ蛋白表達(dá)水平相比于HG+ZOL組下降，進(jìn)一步提示p38 MAPK通路可能參與了調(diào)節(jié)高糖微環(huán)境下ZOL對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞的成骨分化過(guò)程。而Wnt5a蛋白的變化進(jìn)一步提示p38 MAPK通路和Wnt途徑可能共同參與介導(dǎo)了MC3T3-E1細(xì)胞的成骨分化過(guò)程。

Fig.5 The fluorescence expression intensity of Wnt5a and p38 MAPK detected by immunofluorescence staining圖5免疫熒光染色檢測(cè)Wnt5a和p38 MAPK的熒光表達(dá)強(qiáng)度

Tab.1 Relative expression of Wnt5a,p38 MAPK,p-p38 MAPK,BMP2 and COLⅠproteins in cells表1細(xì)胞中Wnt5a、p38 MAPK、p-p38 MAPK、BMP2和COLⅠ蛋白表達(dá) （n=3，±s）

Tab.1 Relative expression of Wnt5a,p38 MAPK,p-p38 MAPK,BMP2 and COLⅠproteins in cells表1細(xì)胞中Wnt5a、p38 MAPK、p-p38 MAPK、BMP2和COLⅠ蛋白表達(dá) （n=3，±s）

＊＊P＜0.01；a與LG組比較，b與LG+ZOL組比較，c與HG組比較，d與HG+ZOL組比較，P＜0.05。

組別LG組LG+ZOL組HG組HG+ZOL組HG+ZOL+SB203580組F Wnt5a 1.00±0.00 1.33±0.08a 0.64±0.09ab 1.10±0.11bc 0.54±0.06abd 53.354＊＊p38 MAPK 1.00±0.00 1.38±0.18a 0.57±0.08ab 0.88±0.05bc 0.52±0.10abd 35.789＊＊p-p38 MAPK 1.00±0.00 1.81±0.25a 0.49±0.09ab 0.85±0.08bc 0.43±0.07abd 56.242＊＊BMP2 1.00±0.00 1.21±0.07a 0.64±0.05ab 1.14±0.09ac 0.35±0.05abcd 110.142＊＊COLⅠ1.00±0.00 1.25±0.08a 0.81±0.06ab 1.05±0.07bc 0.70±0.07abd 34.826＊＊

Fig.6 Relative expression of Wnt5a,p38 MAPK,p-p38 MAPK,BMP2 and COLⅠproteins in cells圖6細(xì)胞中Wnt5a、p38 MAPK、p-p38 MAPK、BMP2和COLⅠ蛋白表達(dá)

綜上所述，高糖可抑制MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化，在加入低濃度ZOL后可改善高糖的抑制作用，這可能與抑制p38 MAPK通路有關(guān)。同時(shí)，可考慮靶向干預(yù)Wnt5a，進(jìn)而通過(guò)p38 MAPK通路和Wnt途徑的聯(lián)合作用來(lái)調(diào)節(jié)MC3T3-E1細(xì)胞的成骨分化過(guò)程，可為藥物治療DOP提供一定的理論依據(jù)，詳細(xì)機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究。