陳明武，王開宇，楊波，鄭詩豪

腦膠質(zhì)瘤是人中樞神經(jīng)系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，具有生長快、侵襲力強、病死率高、致殘率高等特點［1］。盡管腦膠質(zhì)瘤的治療（手術(shù)切除、放療、化療等）取得了很大進展，但病死率和復(fù)發(fā)率仍較高［2］。因此，加強對腦膠質(zhì)瘤分子機制的認(rèn)識，對其診斷和治療具有重要意義。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA,lncRNA）在腦膠質(zhì)瘤中的作用已引起廣泛關(guān)注［3］。OPA相互作用蛋白5反義轉(zhuǎn)錄本1（OPA-interacting protein 5 antisense transcript 1，OIP5-AS1）是一種在包括腦膠質(zhì)瘤的惡性腫瘤進展中發(fā)揮關(guān)鍵作用的lncRNA［4］。據(jù)報道，OIP5-AS1在腦膠質(zhì)瘤組織中上調(diào)，與腫瘤的病理分級相關(guān)；沉默OIP5-AS1可抑制腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移［5-6］。然而，OIP5-AS1在腦膠質(zhì)瘤中的分子機制尚未闡明。微小RNA（microRNA,miRNA）通過與mRNA的3'-非翻譯區(qū)（3'-UTR）結(jié)合參與多種生物學(xué)過程［7］。其中miR-942-5p可在癌癥中充當(dāng)腫瘤啟動子或抑制子［8-9］。miR-942-5p在腦膠質(zhì)瘤中下調(diào)，與腫瘤的惡性表型有關(guān)［10］。通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，OIP5-AS1和miR-942-5p之間可能存在靶向關(guān)系；并且檢查點激酶1（checkpoint kinase 1，CHEK1）具有與miR-942-5p結(jié)合的位點。CHEK1在腦膠質(zhì)瘤中上調(diào)，與腫瘤的病理分級相關(guān)［11］；抑制其表達(dá)可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲［12-13］。本研究旨在探討OIP5-AS1在腦膠質(zhì)瘤發(fā)病中的作用以及OIP5-AS1/miR-942-5p/CHEK1軸在腫瘤形成中的潛在機制。

1 材料與方法

1.1 臨床樣本收集2019年10月—2021年10月在福建省立醫(yī)院神經(jīng)外科33例經(jīng)病理檢查確診并接受手術(shù)切除的膠質(zhì)瘤患者組織標(biāo)本?；颊咝g(shù)前未接受其他治療，排除其他惡性腫瘤、嚴(yán)重全身感染及其他嚴(yán)重全身性疾病等并發(fā)癥?；颊吣挲g25~60歲，平均（46.23±8.50）歲，其中男20例，女13例。根據(jù)WHO 2016年公布的中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤病理分類，低級別膠質(zhì)瘤（Ⅰ/Ⅱ級）14例，包括Ⅰ級6例、Ⅱ級8例，高級別膠質(zhì)瘤（Ⅲ/Ⅳ級）19例，包括Ⅲ級9例、Ⅳ級10例。非腫瘤性腦組織樣本取自33例顱腦損傷成人患者，這些患者接受了部分腦組織切除術(shù)以降低顱內(nèi)壓。所有樣品都保存在-80℃以供后續(xù)試驗。所有患者均簽署書面知情同意書。實驗方案經(jīng)福建省立醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（倫理號：K2019-09-039），符合赫爾辛基宣言。

1.2 細(xì)胞人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87、SHG-44、U251和H4均購自武漢普諾賽生命科技有限公司，貨號CL-0238、CL-0207、CL-0237、CL-0087；正常人星形膠質(zhì)細(xì)胞NHA購自合肥萬物生物科技有限公司，貨號QCLL-101299。所有細(xì)胞均在含有10%胎牛血清（FBS）、100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 主要試劑與儀器靶向OIP5-AS1的小分子干擾RNA（siRNA，OIP5-AS1 siRNA，干擾序列：5'-AACCUAAUCAGA?CAAGUCCTT-3'）、miR-942-5p mimic（5'-UCUUCUCU?GUUUUGGCCAUGUG-3'）和miR-942-5p inhibitor（5'-CA?CAUGGCCAAAACAGAGAAGA-3'）及其陰性對照［siRNA NC（5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'）、miR-NC（5'-UUU?GUACUACACAAAAGUACUG-3'）、inhibitor-NC（5'-CAGUA?CUUUUGUGUAGUACAAA-3'）］由上?；蛑扑幱邢薰竞铣伞Ｍ迷匆豢笴HEK1（ab32531，Abcam）；人源抗Argonaute2（Ago2）抗體（ab186733，Abcam）；MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒（C0009S，上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；膜聯(lián)蛋白V（Annexin-V）-異硫氰酸熒光素（FITC）/碘化丙啶（PI）細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（CA1020，北京Solarbio公司）；雙熒光素酶測定試劑盒（E1910，美國Promega公司）；Magna RIP RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀試劑盒（17-700，美國Millipore公司）。ABI Prism?7500型實時熒光定量PCR（qPCR）儀（美國Applied Biosystems公司）；iMark680多功能酶標(biāo)儀（美國Bio-Rad公司）；FACS Calibur流式細(xì)胞儀（美國BD Biosciences公司）；Nikon Eclipse Ti-S倒置顯微鏡（日本Nikon公司）。OIP5-AS1和CHEK1 3'-UTR的野生型（wt）和突變型（mut）雙熒光素酶報告載體委托廣州銳博生物技術(shù)有限公司構(gòu)建。

1.4 qPCR檢測組織和細(xì)胞中OIP5-AS1、miR-942-5p和CHEK1 mRNA表達(dá)采用TRIzol試劑盒提取組織和細(xì)胞的總RNA；引物序列由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（表1）。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA（2 μg）逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。隨后，使用SYBR Premix Ex TaqⅡ試劑盒擴增cDNA。miR-942-5p以U6為內(nèi)參基因，OIP5-AS1、CHEK1以GAPDH為內(nèi)參基因。采用2-ΔΔCt法計算靶基因的相對表達(dá)水平。

Tab.1 Primer sequences for qPCR表1 qPCR引物序列

1.5 Western blot檢測細(xì)胞中CHEK1蛋白表達(dá)采用RIPA裂解破壞細(xì)胞，并通過用二辛可寧酸（BCA）蛋白質(zhì)測定法測定蛋白質(zhì)濃度。然后，通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）實現(xiàn)蛋白質(zhì)分離，并將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。然后，將膜置于冰箱中，與一抗（CHEK1、GAPDH，稀釋比例1︰1 000）在4℃下孵育過夜。之后，加入二抗，室溫孵育1 h，然后進行化學(xué)發(fā)光（ECL）試劑顯影，Image J軟件分析蛋白條帶的灰度值，通過與內(nèi)參（GAPDH）的灰度比，計算CHEK1蛋白的相對表達(dá)。

1.6 細(xì)胞分組轉(zhuǎn)染實驗分為5組：對照（NC）組（未轉(zhuǎn)染細(xì)胞）、siRNA陰性對照（si-NC）組（轉(zhuǎn)染siRNA NC序列的細(xì)胞）、OIP5-AS1 siRNA（si-OIP5-AS1）組（轉(zhuǎn)染OIP5-AS1 siRNA的細(xì)胞）、si-OIP5-AS1+inhibitor陰性對照（si-OIP5-AS1+anti-NC）組（轉(zhuǎn)染OIP5-AS1 siRNA和inhibitor-NC的細(xì)胞）、si-OIP5-AS1+miR-942-5p抑制劑（si-OIP5-AS1+antimiR-942-5p）組（用OIP5-AS1 siRNA和miR-942-5p inhibitor轉(zhuǎn)染的細(xì)胞）。轉(zhuǎn)染前將U87細(xì)胞接種到6孔板中，并將細(xì)胞密度調(diào)整為2×105個/孔。培養(yǎng)16 h后，采用Lipofectamine 3000試劑進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染6 h后，將U87細(xì)胞在含有10%FBS的培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h。最后，收獲細(xì)胞并通過qPCR和Western blot檢 測 各 組 細(xì) 胞 中OIP5-AS1、miR-942-5p和CHEK1 mRNA和蛋白的表達(dá)水平，檢測步驟同1.4和1.5。

1.7 MTT法測定細(xì)胞增殖活性將轉(zhuǎn)染的U87細(xì)胞以2 000個/孔的密度接種到96孔板中，培養(yǎng)24、48、72 h。然后，在相應(yīng)的時間點向每個孔中加入20 μL MTT溶液（5 g/L）孵育4 h。隨后，去除孔中的溶液，加入150 μL二甲亞砜（DMSO）溶液以溶解甲臜產(chǎn)物，振蕩10 min后，使用酶標(biāo)儀在570 nm波長下測量每個孔的光密度（OD）值，評估細(xì)胞活力。

1.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡轉(zhuǎn)染48 h后，用胰蛋白酶消化轉(zhuǎn)染的U87細(xì)胞，PBS洗滌后重新懸浮在1×結(jié)合緩沖液中，調(diào)整至1×106個/mL。將200 μL細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到試管中，并與5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI混合在室溫下避光反應(yīng)15 min。最后，在1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡。

1.9 Transwell遷移和侵襲實驗對于侵襲分析，將轉(zhuǎn)染的U87細(xì)胞重懸于無血清培養(yǎng)基中，然后取100 μL懸液（3×105個細(xì)胞）接種在預(yù)涂有Matrigel（孔徑8 μm）的Transwell上室中。對于遷移分析，將轉(zhuǎn)染的U87細(xì)胞（3×105個/孔）接種在未 包被Matrigel的Transwell上 室。之后，將500 μL含 有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基添加到下室。37℃孵育24 h后，使用棉簽去除上室膜表面的基質(zhì)膠和細(xì)胞，下室膜表面的細(xì)胞用4%多聚甲醛固定，0.1%結(jié)晶紫染色30 min。最后，在倒置顯微鏡下拍照，并在Image J軟件下計數(shù)隨機讀取的5個顯微視野中穿膜細(xì)胞數(shù)，取平均值。

1.10 雙熒光素酶報告基因檢測使用StarBase v2.0數(shù)據(jù)庫（https://starbase.sysu.edu.cn/index.php）預(yù) 測OIP5-AS1和miR-942-5p之間以及CHEK1和miR-942-5p之間的結(jié)合位點。將U87細(xì)胞接種到24孔板中（1×105個/孔），并采用Lipofectamine 3000將50 nmol/L OIP5-AS1-wt（CHEK1-wt）或OIP5-AS1-mut（CHEK1-mut）與50 nmol/L miR-NC或miR-942-5p mimic共轉(zhuǎn)染至細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染后24 h收獲和裂解細(xì)胞，使用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)測量熒光素酶活性。螢火蟲熒光素酶活性被標(biāo)準(zhǔn)化為相應(yīng)的海腎熒光素酶活性。

1.11 miR-942-5p過表達(dá)或敲低對CHEK1表達(dá)的影響將U87細(xì)胞以2×105個/孔的密度接種到6孔板中，分為miR-NC組、miR-942-5p mimic組、inhibitor-NC組、miR-942-5p inhibitor組。采用Lipofectamine 3000將miR-942-5p mimic、miR-942-5p inhibitor及其陰性對照miR-NC、inhibitor-NC分別轉(zhuǎn)染至U87細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48 h后，收獲細(xì)胞并通過qPCR和Western blot檢測各組細(xì)胞中CHEK1的mRNA和蛋白表達(dá)。

1.12 RNA免疫沉淀（RNA immunoprecipitation，RIP）實驗使用Magna RIP RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀試劑盒進行RIP實驗。使用完全RIP裂解緩沖液裂解U87細(xì)胞，并將100 μL全細(xì)胞提取物與含有與人源抗Ago2抗體（1︰50）綴合的磁珠在4℃下孵育6~8 h。正常小鼠IgG抗體（1︰100）用作陰性對照。隨后，將樣品用洗滌緩沖液洗滌，并與蛋白酶K在55℃下孵育30 min，以從磁珠中分離RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物。然后，提取免疫沉淀的RNA并進行qPCR分析。

1.13 統(tǒng)計學(xué)方法 采用GraphPad Prism 8.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q檢驗；2組間比較采用t檢驗。采用Pearson法分析腦膠質(zhì)瘤組織中OIP5-AS1、miR-942-5p和CHEK1 mRNA表達(dá)水平的相關(guān)性。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人腦膠質(zhì)瘤組織中OIP5-AS1、miR-942-5p和CHEK1表達(dá)與正常組織相比，腦膠質(zhì)瘤組織中OIP5-AS1、CHEK1 mRNA水平顯著升高，miR-942-5p水平顯著降低（P＜0.05），見表2。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，腦膠質(zhì)瘤組織中OIP5-AS1與miR-942-5p的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)（r=-0.936，P＜0.01）；miR-942-5p與CHEK1 mRNA的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)（r=-0.931，P＜0.01），OIP5-AS1與CHEK1 mRNA的表達(dá)水平呈正相關(guān)（r=0.935，P＜0.01）。此外，OIP5-AS1、CHEK1 mRNA在高級別膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)明顯高于低級別組織（P＜0.01），而高級別膠質(zhì)瘤中的miR-942-5p水平明顯低于低級別組織（P＜0.01），見表3。

Tab.2 Comparison of expression levels of OIP5-AS1,miR-942-5p and CHEK1 mRNA between the two groups表2 2組研究對象中OIP5-AS1、miR-942-5p和CHEK1 mRNA表達(dá)水平比較 （n=33，±s）

Tab.2 Comparison of expression levels of OIP5-AS1,miR-942-5p and CHEK1 mRNA between the two groups表2 2組研究對象中OIP5-AS1、miR-942-5p和CHEK1 mRNA表達(dá)水平比較 （n=33，±s）

＊＊P＜0.01。

組織正常組織腦膠質(zhì)瘤組織t OIP5-AS1 1.02±0.13 2.35±0.48 15.364＊＊miR-942-5p 0.99±0.10 0.55±0.09 18.788＊＊CHEK1 1.00±0.12 2.78±0.45 21.956＊＊

Tab.3 Comparison of expression levels of OIP5-AS1,miR-942-5p and CHEK1 mRNA between gliomas of different pathological grades表3不同病理級別膠質(zhì)瘤中OIP5-AS1、miR-942-5p和CHEK1 mRNA表達(dá)水平比較 （±s）

Tab.3 Comparison of expression levels of OIP5-AS1,miR-942-5p and CHEK1 mRNA between gliomas of different pathological grades表3不同病理級別膠質(zhì)瘤中OIP5-AS1、miR-942-5p和CHEK1 mRNA表達(dá)水平比較 （±s）

＊＊P＜0.01。

腫瘤級別低級別膠質(zhì)瘤高級別膠質(zhì)瘤t n 14 19 OIP5-AS1 1.83±0.20 2.73±0.36 8.423＊＊miR-942-5p 0.71±0.10 0.43±0.08 8.938＊＊CHEK1 2.05±0.29 3.32±0.56 7.734＊＊

2.2 不同腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中OIP5-AS1、miR-942-5p和CHEK1表達(dá)與NHA細(xì)胞相比，腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞 系U87、SHG-44、U251和H4中OIP5-AS1、CHEK1 mRNA和CHEK1蛋白水平升高；miR-942-5p mRNA水平降低（P＜0.05）；其中，U87細(xì)胞中OIP5-AS1、CHEK1 mRNA和CHEK1蛋白水平較高，miR-942-5p mRNA水平較低，因此選擇U87細(xì)胞進行后續(xù)實驗；見圖1、表4。

Fig.1 Expression of CHEK1 protein in different glioma cells圖1不同腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中CHEK1蛋白表達(dá)

Tab.4 Comparison of OIP5-AS1,miR-942-5p and CHEK1 levels between different glioma cells表4不同腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中OIP5-AS1、miR-942-5p和CHEK1水平比較 （n=6，±s）

Tab.4 Comparison of OIP5-AS1,miR-942-5p and CHEK1 levels between different glioma cells表4不同腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中OIP5-AS1、miR-942-5p和CHEK1水平比較 （n=6，±s）

＊＊P＜0.01；a與NHA細(xì)胞比較，b與U87細(xì)胞比較，c與SHG-44細(xì)胞比較，d與U251細(xì)胞比較，P＜0.05。

細(xì)胞NHA U87 SHG-44 U251 H4 F OIP5-AS1 mRNA 1.01±0.11 3.26±0.40a 1.65±0.23ab 2.70±0.35abc 1.52±0.21abd 65.245＊＊miR-942-5p mRNA 1.02±0.09 0.29±0.05a 0.73±0.08ab 0.45±0.06abc 0.81±0.10abd 82.843＊＊CHEK1 mRNA 0.99±0.10 3.65±0.41a 2.30±0.27ab 1.49±0.23abc 1.81±0.25abc 84.278＊＊CHEK1蛋白0.24±0.04 0.87±0.09a 0.55±0.07ab 0.36±0.05abc 0.44±0.06abc 83.290＊＊

2.3 各 組U87細(xì) 胞 中OIP5-AS1、miR-942-5p和CHEK1表達(dá)與NC組相比，si-NC組OIP5-AS1、miR-942-5p、CHEK1 mRNA和CHEK1蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與NC組、si-NC組相比，si-OIP5-AS1組OIP5-AS1、CHEK1 mRNA和CHEK1蛋白水平降低，miR-942-5p水平升高（P＜0.05）；與si-OIP5-AS1組相比，si-OIP5-AS1+anti-NC組上述指標(biāo)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與si-OIP5-AS1組、si-OIP5-AS1+anti-NC組相比，si-OIP5-AS1+anti-miR-942-5p組CHEK1 mRNA和蛋白水平升高，miR-942-5p mRNA水平降低（P＜0.05）；見圖2、表5。

Fig.2 CHEK1 protein expression in U87 cells in each group圖2各組U87細(xì)胞中CHEK1蛋白表達(dá)

2.4 沉默OIP5-AS1降低U87細(xì)胞增殖活力轉(zhuǎn)染后24、48、72 h時，與NC組相比，si-NC組細(xì)胞活力差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與NC組、si-NC組相比，si-OIP5-AS1組細(xì)胞活力顯著降低（P＜0.05）；與si-OIP5-AS1組相比，si-OIP5-AS1+anti-NC組細(xì)胞活力差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與si-OIP5-AS1組、si-OIP5-AS1+anti-NC組 相 比，si-OIP5-AS1+anti-miR-942-5p組細(xì)胞活力顯著升高（P＜0.05）。見表6。

Tab.5 Comparison of OIP5-AS1,miR-942-5p and CHEK1 levels between the five groups of U87 cells表5各組U87細(xì)胞中OIP5-AS1、miR-942-5p和CHEK1水平比較 （n=6，±s）

Tab.5 Comparison of OIP5-AS1,miR-942-5p and CHEK1 levels between the five groups of U87 cells表5各組U87細(xì)胞中OIP5-AS1、miR-942-5p和CHEK1水平比較 （n=6，±s）

＊＊P＜0.01；a與NC比較，b與si-NC組比較，c與si-OIP5-AS1組比較，d與si-OIP5-AS1+anti-NC組比較，P＜0.05。

組別NC組si-NC組si-OIP5-AS1組si-OIP5-AS1+anti-NC組si-OIP5-AS1+anti-miR-942-5p組F OIP5-AS1 mRNA 0.99±0.10 1.02±0.11 0.28±0.05ab 0.26±0.04ab 0.30±0.05ab 165.157＊＊miR-942-5p mRNA 1.00±0.12 1.01±0.10 3.54±0.39ab 3.60±0.41ab 1.32±0.20cd 142.939＊＊組別NC組si-NC組si-OIP5-AS1組si-OIP5-AS1+anti-NC組si-OIP5-AS1+anti-miR-942-5p組F CHEK1 mRNA 1.00±0.11 0.98±0.09 0.39±0.05ab 0.36±0.06ab 0.87±0.09cd 88.736＊＊CHEK1蛋白0.82±0.09 0.84±0.10 0.32±0.05ab 0.30±0.04ab 0.72±0.08cd 75.734＊＊

2.5 沉默OIP5-AS1促進U87細(xì)胞凋亡與NC組相比，si-NC組細(xì)胞凋亡率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與NC組、si-NC組相比，si-OIP5-AS1組細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.05）；與si-OIP5-AS1組相比，si-OIP5-AS1+anti-NC組細(xì)胞凋亡率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與si-OIP5-AS1組、si-OIP5-AS1+anti-NC組相比，si-OIP5-AS1+anti-miR-942-5p組細(xì)胞凋亡率顯著降低（P＜0.05）。見圖3。

Tab.6 Comparison of the viability of U87 cells between the five groups表6各組U87細(xì)胞活力比較（n=6，±s）

Tab.6 Comparison of the viability of U87 cells between the five groups表6各組U87細(xì)胞活力比較（n=6，±s）

＊＊P＜0.01；a與NC比較，b與si-NC組比較，c與si-OIP5-AS1組比較，d與si-OIP5-AS1+anti-NC組比較，P＜0.05。

組別NC組si-NC組si-OIP5-AS1組si-OIP5-AS1+anti-NC組si-OIP5-AS1+anti-miR-942-5p組F細(xì)胞活力（OD570）24 h 0.36±0.05 0.38±0.06 0.23±0.04ab 0.21±0.03ab 0.34±0.05cd 16.568＊＊48 h 0.58±0.07 0.60±0.07 0.37±0.05ab 0.36±0.05ab 0.55±0.06cd 17.730＊＊72 h 0.95±0.11 0.94±0.12 0.56±0.07ab 0.58±0.06ab 0.89±0.10cd 25.820＊＊

2.6 沉默OIP5-AS1抑制U87細(xì)胞遷移和侵襲與NC組相比，si-NC組遷移和侵襲細(xì)胞的數(shù)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與NC組、si-NC組相比，si-OIP5-AS1組遷移和侵襲細(xì)胞的數(shù)量顯著降低（P＜0.05）；與si-OIP5-AS1組相比，si-OIP5-AS1+anti-NC組遷移和侵襲細(xì)胞的數(shù)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與si-OIP5-AS1組、si-OIP5-AS1+anti-NC組相比，si-OIP5-AS1+anti-miR-942-5p組遷移和侵襲細(xì)胞的數(shù)量顯著升高（P＜0.05），見表7、圖4。

Fig.3 Comparison of apoptosis levels of U87 cells in each group圖3各組U87細(xì)胞凋亡水平比較

Tab.7 Comparison of migration and invasion numbers of U87 cells between the five groups表7各組U87細(xì)胞遷移、侵襲的數(shù)量比較（n=6，個/視野，±s）

Tab.7 Comparison of migration and invasion numbers of U87 cells between the five groups表7各組U87細(xì)胞遷移、侵襲的數(shù)量比較（n=6，個/視野，±s）

＊＊P＜0.01；a與NC比較，b與si-NC組比較，c與si-OIP5-AS1組比較，d與si-OIP5-AS1+anti-NC組比較，P＜0.05。

組別NC組si-NC組si-OIP5-AS1組si-OIP5-AS1+anti-NC組si-OIP5-AS1+anti-miR-942-5p組F遷移細(xì)胞數(shù)143.20±18.57 150.36±20.14 62.81±9.56ab 59.44±7.12ab 127.13±15.08cd 52.220＊＊侵襲細(xì)胞數(shù)86.72±10.31 91.06±12.15 45.54±6.78ab 42.93±7.12ab 83.60±9.45cd 38.177＊＊

2.7 OIP5-AS1靶向miR-942-5p通過StarBase v2.0在線軟件對OIP5-AS1潛在結(jié)合的miRNA進行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)OIP5-AS1含有與miR-942-5p區(qū)域互補的結(jié)合序列，見圖5A。雙熒光素酶實驗結(jié)果顯示，與miR-NC組相比，miR-942-5p過表達(dá)可顯著降低含OIP5-AS1-wt報告載體細(xì)胞的熒光素酶活性（P＜0.01），對含OIP5-AS1-mut報告載體細(xì)胞的熒光素酶活性無明顯影響（P＞0.05），見圖5B。RIP檢測結(jié)果顯示，與對照組（IgG）相比，含有Ago2的復(fù)合物可顯著富集OIP5-AS1和miR-942-5p（P＜0.01），見圖5C。

2.8 miR-942-5p直接靶向癌基因CHEK1通過StarBase v2.0在線軟件預(yù)測miR-942-5p的潛在靶基因，發(fā)現(xiàn)miR-942-5p與CHEK1的3'-UTR存在結(jié)合位點，見圖6A。雙熒光素酶實驗結(jié)果顯示，與miRNC組相比，miR-942-5p過表達(dá)可顯著降低含CHEK1-wt報告載體細(xì)胞的熒光素酶活性（P＜0.01），對含CHEK1-mut報告載體細(xì)胞的熒光素酶活性無明顯影響（P＞0.05），見圖6B。qPCR和Western blot檢測miR-942-5p過表達(dá)和敲低對CHEK1表達(dá)的影響，結(jié)果顯示miR-942-5p過表達(dá)降低了CHEK1的mRNA和蛋白表達(dá)，而miR-942-5p敲低具有相反的效果（P＜0.01），見圖6C~E。

3 討論

3.1 OIP5-AS1、miR-942-5p和CHEK1在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)近年來，lncRNA正在成為腫瘤等疾病發(fā)生發(fā)展過程中的重要調(diào)節(jié)因子。越來越多的證據(jù)表明，lncRNA在腦膠質(zhì)瘤中存在異常表達(dá)，會影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)過程，如NEAT1［14］、SNHG7［15］和PVT1［16］等lncRNA的功能已被揭示。OIP5-AS1作為眾多基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子而受到關(guān)注。據(jù)報道，OIP5-AS1在多種腫瘤中過表達(dá)，與包括腦膠質(zhì)瘤［5-6］在內(nèi)的多種腫瘤患者的不良生存率相關(guān)；可調(diào)節(jié)和控制腫瘤生長并參與腫瘤進展，可能是多種腫瘤的有效生物標(biāo)志物和潛在治療靶點［17］。本研究中，OIP5-AS1在人腦膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞系中高表達(dá)，而miR-942-5p下調(diào)，CHEK1上調(diào)，與以往的研究結(jié)果一致［5，10-11］。此外，OIP5-AS1、miR-942-5p和CHEK1 mRNA的表達(dá)與膠質(zhì)瘤的病理分級有關(guān)。膠質(zhì)瘤患者病理分級越高，OIP5-AS1、CHEK1 mRNA表達(dá)水平越高，miR-942-5p表達(dá)水平越低，提示上述3個因子可能與腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。

Fig.4 Migration and invasion of U87 cells in each group(×200)圖4各組U87細(xì)胞遷移和侵襲情況（×200）

Fig.5 Interaction of OIP5-AS1 with miR-942-5p in glioma cells圖5 OIP5-AS1與腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中miR-942-5p的相互作用

Fig.6 miR-942-5p directly targets the oncogene CHEK1圖6 miR-942-5p直接靶向癌基因CHEK1

3.2 OIP5-AS1通過靶向miR-942-5p在膠質(zhì)瘤中發(fā)揮致癌作用lncRNA可充當(dāng)miRNA的分子海綿，在細(xì)胞的多個過程中發(fā)揮重要作用。有研究顯示，miR-942-5p在腦膠質(zhì)瘤中呈低表達(dá)，其低表達(dá)可誘導(dǎo)腦膠質(zhì)瘤的惡性表型［10］。本研究結(jié)果顯示，腦膠質(zhì)瘤組織中OIP5-AS1的表達(dá)水平與miR-942-5p的水平呈負(fù)相關(guān)。StarBase數(shù)據(jù)庫預(yù)測發(fā)現(xiàn)OIP5-AS1序列含有與miR-942-5p序列互補的結(jié)合位點，提示OIP5-AS1和miR-942-5p之間可能存在靶向關(guān)系。雙熒光素酶報告基因分析證實miR-942-5p是OIP5-AS1的靶標(biāo)。為進一步確定OIP5-AS1和miR-942-5p的結(jié)合關(guān)系，使用Ago2抗體在U87細(xì)胞中進行RIP測定以驗證OIP5-AS1和miR-942-5p是否可以與Ago2相互作用。結(jié)果顯示，OIP5-AS1和miR-942-5p均 可被Ago2富 集，表 明OIP5-AS1和miR-942-5p存在相互作用。為研究OIP5-AS1和miR-942-5p對腦膠質(zhì)瘤生長的調(diào)節(jié)作用，本研究選擇了U87細(xì)胞進行體外轉(zhuǎn)染。結(jié)果顯示，在U87細(xì)胞中使用siRNA沉默OIP5-AS1可上調(diào)miR-942-5p表達(dá)，有效抑制細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力，并促進細(xì)胞凋亡；而下調(diào)miR-942-5p表達(dá)促進了腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)功能，且減弱了OIP5-AS1沉默對細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，提示OIP5-AS1可能通過調(diào)節(jié)miR-942-5p在腦膠質(zhì)瘤的發(fā)病和進展中發(fā)揮作用。

3.3 CHEK1是miR-942-5p的潛在靶基因本研究發(fā)現(xiàn)，腦膠質(zhì)瘤組織中miR-942-5p與CHEK1 mRNA相對表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)。為進一步研究OIP5-AS1/miR-942-5p軸在調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤發(fā)生中的潛在分子機制，通過生物信息學(xué)分析預(yù)測癌基因CHEK1可能是miR-942-5p的下游靶基因；雙熒光素酶報告基因分析證實miR-942-5p可直接靶向CHEK1 mRNA的3'-UTR。然后，qPCR和Western blot分析顯示，miR-942-5p過表達(dá)后，U87細(xì)胞中CHEK1的mRNA和蛋白水平顯著降低，而下調(diào)miR-942-5p可增加U87細(xì)胞中CHEK1的表達(dá)水平，證實了CHEK1是miR-942-5p的直接靶標(biāo)。以上這些結(jié)果表明，miR-942-5p可能通過直接結(jié)合CHEK1的3'-UTR來抑制CHEK1的表達(dá)。此外，沉默OIP5-AS1能夠降低CHEK1的表達(dá)，同時上調(diào)miR-942-5p，抑制腫瘤細(xì)胞的惡性表型；而下調(diào)miR-942-5p可通過上調(diào)CHEK1表達(dá)，阻斷OIP5-AS1沉默對腫瘤細(xì)胞惡性表型的抑制作用，提示OIP5-AS1可通過調(diào)節(jié)miR-942-5p/CHEK1軸來促進腫瘤的發(fā)生。

綜上所述，沉默OIP5-AS1可能通過上調(diào)miR-942-5p抑制CHEK1表達(dá)，抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，并促進細(xì)胞凋亡。OIP5-AS1可通過充當(dāng)miR-942-5p的海綿來調(diào)節(jié)CHEK1表達(dá)，從而促進腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生和進展。本研究再次證實了OIP5-AS1可能是腦膠質(zhì)瘤治療的潛在靶點，加深了對其分子機制的認(rèn)識，但OIP5-AS1/miR-942-5p/CHEK1網(wǎng)絡(luò)在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞其他生物學(xué)功能中的調(diào)控機制仍有待深入研究。此外，OIP5-AS1的功能機制仍需通過體內(nèi)研究進一步驗證。