李艷，劉瓊，黃萱，劉麗江△

慢性腦低灌注由頸動脈狹窄、閉塞，動脈硬化等多種因素引起，表現(xiàn)為腦部的供血不足和血流降低，是造成血管性癡呆、阿爾茨海默病、認知障礙等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的主要原因［1-2］。海馬是機體學習記憶的關鍵部位，主要負責儲存信息，具有獨特的血管組成和分布，腦部缺血損傷常導致海馬組織神經(jīng)元結構和功能異常，過度凋亡等，從而誘發(fā)認知障礙［3-4］。蘆丁是一種來源較廣的黃酮類化合物，具有神經(jīng)保護、血管保護、細胞保護、抗氧化、抗癌等多種生理活性［5］。Javed等［6］研究發(fā)現(xiàn)，蘆丁可明顯提高鏈脲佐菌素誘導的阿爾茨海默病大鼠的認知能力，并對海馬組織具有一定的保護作用。但關于蘆丁的神經(jīng)保護作用機制及其對慢性腦低灌注大鼠海馬組織神經(jīng)元影響的報道較少。Ras同源基因家族成員A（Ras homolog gene family member A，RhoA）是Rho GTP酶家族成員，與細胞發(fā)育、細胞骨架調控等多種細胞生物學活動聯(lián)系密切，Rho相關卷曲螺旋蛋白激酶（Rho-associated coiled-coil protein kinase，ROCK）是RhoA重要的下游效應分子。Li等［7］研究結果顯示，抑制RhoA/ROCK通路可明顯改善糖尿病所致腦組織微血管病變、CA1區(qū)神經(jīng)元損傷及認知障礙。本研究以RhoA/ROCK通路為切入點，探究蘆丁對慢性腦低灌注大鼠的海馬組織神經(jīng)元及認知功能的影響及其可能機制，為臨床緩解慢性腦低灌注提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物雄性SPF級SD大鼠54只，10周齡，體質量260~280 g，購自江漢大學實驗動物中心，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（鄂）2019-0017。大鼠自由飲食、飲水，自然光照，動物房溫度保持在25℃左右，相對濕度保持在50%左右，保持動物房清潔，按時對鼠籠進行清潔。本研究經(jīng)江漢大學動物倫理委員會批準同意。

1.2 主要藥物、試劑及儀器蘆?。ㄘ浱朆20771，原料藥，純度≥99%）購自上海源葉生物科技有限公司；RhoA抑制劑Rhosin hydrochloride（貨號1281870-42-5）購自美國Glpbio公司；蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒（貨號G1121）、蛋白提取試劑盒（貨號BC3711）、DAB顯色試劑盒（貨號DA1015）、BCA蛋白濃度測定試劑盒（貨號PC0020）均購自北京索萊寶科技有限公司；原位缺口末端標記（TUNEL）細胞凋亡檢測試劑盒（貨號11684817910）購自瑞士Roche公司；兔源胱天蛋白酶-3（Caspase-3）、B淋巴細胞瘤-2相關X蛋白（Bax）、RhoA、ROCK1、ROCK2、GAPDH一抗及羊抗兔二抗均購自英國Abcam公司（貨 號依次為ab184787、ab32503、ab187027、ab125025、ab134181、ab9485、ab6721）；生物組織脫水機（型號DB-680C）購自孝感市德比電子科技有限公司；光學顯微鏡（型號DMD108）購自德國徠卡公司；透射電鏡（型號Talos）購自美國FEI公司；凝膠成像儀（型號Gelstudio touch）購自德國耶拿公司。

1.3 研究方法

1.3.1 動物模型制備及分組給藥慢性腦低灌注大鼠模型的構建參照文獻［8］，54只SD大鼠按照隨機數(shù)字表法分為假手術組（9只）和造模組（45只）。造模組所有大鼠均于術前12 h禁食，術前4 h禁水，將大鼠麻醉后以仰臥位固定，頸部備皮并消毒后于正中做約1 cm的縱向切口，暴露頸動脈，分離雙側頸動脈及迷走神經(jīng)，采用4號手術線結扎左側總頸動脈的近心端及遠心端，離斷血管，逐層縫合切口，1周后結扎右側總頸動脈并離斷血管，假手術組僅進行頸動脈分離，不進行結扎，1周后動物存活即為模型構建成功。造模過程中若出現(xiàn)大鼠死亡，及時選取備用大鼠進行造模處理，成功造模45只大鼠。假手術組未出現(xiàn)大鼠死亡。

將模型構建成功的大鼠按照隨機數(shù)字表法分為模型組、蘆丁低劑量組（20 mg/kg）、蘆丁中劑量組（40 mg/kg）、蘆丁高劑量組（80 mg/kg）［9］、RhoA抑制劑組（Rhosin hydrochloride，40 mg/kg）［10］，每組9只。蘆丁用二甲基亞砜溶解并用生理鹽水稀釋配制成2、4、8 g/L的溶液，以10 mL/kg的體積灌胃，蘆丁低、中、高劑量組大鼠分別按照20、40、80 mg/kg的劑量進行灌胃處理；RhoA抑制劑組大鼠腹腔注射40 mg/kg的Rhosin hydrochloride；假手術組及模型組大鼠灌胃等量生理鹽水稀釋的二甲基亞砜；每天給藥1次，持續(xù)4周。

1.3.2 大鼠認知功能和記憶能力測定采用Morris水迷宮實驗測定各組大鼠的認知功能和記憶能力［11］，包括定位巡航實驗和空間探索實驗。定位巡航實驗：將水溫為25℃左右的水池等分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ象限，將平臺置于第Ⅰ象限中央并低于水面2 cm，將大鼠在每天上下午從Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ象限區(qū)域放入水中，記錄其尋找并爬上平臺的時間為逃避潛伏期，該值越高表明認知功能越差，若大鼠在90 s內(nèi)仍未找到平臺，則引導其找到平臺，并記為90 s。每天訓練4次，潛伏期取4次的平均值，訓練持續(xù)4 d。空間探索實驗：第5天撤去平臺，記錄120 s內(nèi)大鼠穿越平臺次數(shù)，次數(shù)越少表明記憶能力越差。

1.3.3 大鼠海馬組織標本采集Morris水迷宮實驗結束后，按隨機數(shù)字表法抽取3只大鼠麻醉后進行生理鹽水及多聚甲醛-戊二醛灌注，待其四肢變硬后取海馬CA1區(qū)組織，用于海馬組織神經(jīng)元超微結構觀察；將剩余大鼠麻醉后處死，剪開大鼠頭頂部皮膚并依次切開肌肉、骨膜，暴露并分離顱骨，使腦組織充分暴露，用手術刀分離大鼠海馬CA1區(qū)組織，3只用于HE染色及TUNEL檢測，3只用于凋亡相關蛋白及RhoA/ROCK通路相關蛋白測定。

1.3.4 大鼠海馬組織HE染色觀察取1.3.3中海馬組織，置于4%多聚甲醛中固定48 h后采用生物組織脫水機進行組織脫水、透明及浸蠟處理，待浸蠟的組織塊凝固后切成4 μm的切片，貼附在載玻片上，采用HE染色試劑盒進行脫蠟、水化、蘇木素染色、分化液處理、返藍液返藍、伊紅染色、脫水、透明，風干后封片于顯微鏡下觀察并拍照分析。

1.3.5 大鼠海馬組織神經(jīng)元凋亡測定將1.3.4中切片用二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水、多聚甲醛固定、PBS沖洗后加入蛋白酶K進行細胞通透處理，PBS洗滌后放入濕盒中平衡約10 min，加入TUNEL反應液，黑暗環(huán)境中反應1 h，PBS洗滌后加入轉化劑，繼續(xù)反應30 min，PBS洗滌后加入DAB顯色液，顯微鏡下觀察到淺棕色背景后用去離子水沖洗4次，用蘇木素復染3 s后用自來水沖洗，經(jīng)過脫水、透明處理后進行封片，顯微鏡下觀察并拍照分析。神經(jīng)元凋亡率（%）=棕褐色細胞（陽性細胞）/視野總細胞×100%

1.3.6 大鼠海馬組織神經(jīng)元超微結構觀察取1.3.3中大鼠海馬組織，于2.5%戊二醛溶液中固定24 h，用PBS沖洗后于1%鋨酸溶液中固定1 h，經(jīng)過梯度乙醇-丙酮脫水、環(huán)氧樹脂包埋、超薄切片、醋酸鈾和檸檬酸鉛染色后于透射電鏡下觀察并拍照分析。

1.3.7 大鼠海馬組織凋亡相關蛋白及RhoA/ROCK通路蛋白表達檢測 取1.3.3中海馬組織，用剪刀剪碎后采用蛋白質提取試劑盒提取總蛋白質，采用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定其中蛋白質濃度，將各組待測蛋白樣品沸水浴10 min，變性完全后進行電泳實驗分離蛋白（5%濃縮膠、12%分離膠），采用濕轉法將蛋白轉移至聚偏氟乙烯膜上，用5%脫脂奶粉封閉2 h，根據(jù)分子質量截取蛋白條帶，加入兔源Caspase-3（1∶100）、Bax（1∶100）、RhoA（1∶200）、ROCK1（1∶100）、ROCK2（1∶100）、GAPDH（1∶200）一抗，4℃冰箱孵育過夜，洗去多余一抗后加入羊抗兔二抗，室溫孵育2 h，顯色曝光后凝膠成像儀中觀察并分析條帶灰度值。以GAPDH為內(nèi)參計算目的蛋白的相對表達量。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 22.0軟件進行實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析，計量資料用均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 蘆丁對大鼠認知功能和記憶能力的影響與假手術組相比，模型組大鼠逃避潛伏期延長，穿越平臺次數(shù)減少（均P＜0.05）；與模型組相比，蘆丁各劑量組及RhoA抑制劑組大鼠逃避潛伏期縮短，穿越平臺次數(shù)顯著增多（均P＜0.05），且蘆丁各劑量組呈劑量依賴效應；蘆丁高劑量組與RhoA抑制劑組的逃避潛伏期和穿越平臺次數(shù)比較，差異無統(tǒng)計學意義，見表1。

2.2 蘆丁對大鼠海馬組織神經(jīng)元結構的影響假手術組海馬CA1區(qū)組織神經(jīng)元排列整齊，染色清晰，未出現(xiàn)壞死情況；與假手術組相比，模型組神經(jīng)元數(shù)量減少，排列疏松且紊亂，出現(xiàn)細胞核固縮等神經(jīng)病理性改變；與模型組相比，蘆丁各劑量組及RhoA抑制劑組神經(jīng)元數(shù)量顯著增多，排列較為整齊，細胞核固縮等現(xiàn)象得到緩解；蘆丁高劑量組與RhoA抑制劑組神經(jīng)元結構類似。見圖1。

Tab.1 Comparison of incubation period and number of swimming across the platform of rats between the six groups表1各組大鼠逃避潛伏期和穿越平臺次數(shù)比較 （n=9，±s）

Tab.1 Comparison of incubation period and number of swimming across the platform of rats between the six groups表1各組大鼠逃避潛伏期和穿越平臺次數(shù)比較 （n=9，±s）

＊＊P＜0.01；a與假手術組相比，b與模型組相比，c與蘆丁低劑量組相比，d與蘆丁中劑量組相比，P＜0.05；表2、3同。

組別假手術組模型組蘆丁低劑量組蘆丁中劑量組蘆丁高劑量組RhoA抑制劑組F逃避潛伏期（s）第1天37.10±7.38 85.06±10.75a 72.55±9.02ab 62.83±8.74abc 45.44±9.17abcd 47.08±8.99abcd 36.835＊＊第2天36.12±6.59 83.94±10.52a 71.83±9.87ab 61.06±9.33abc 44.26±8.94abcd 46.52±7.99abcd 37.389＊＊第3天35.28±7.03 82.31±10.58a 70.50±9.68ab 59.22±8.36abc 43.81±8.07abcd 45.60±9.70abcd 35.664＊＊第4天34.15±7.11 81.85±11.94a 69.33±10.52ab 57.60±10.58abc 42.40±9.00abcd 44.28±8.94abcd 30.731＊＊穿越平臺次數(shù)（次）17.62±3.67 4.96±1.03a 6.53±1.35ab 9.18±2.15abc 13.12±2.65abcd 14.61±3.10abcd 34.785＊＊

2.3 蘆丁對大鼠海馬組織神經(jīng)元凋亡的影響與假手術組相比，模型組海馬組織神經(jīng)元凋亡率、凋亡相關蛋白Caspase-3、Bax表達顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，蘆丁各劑量組及RhoA抑制劑組大鼠海馬組織神經(jīng)元凋亡率、Caspase-3、Bax表達顯著降低（P＜0.05），且蘆丁各劑量組呈劑量依賴效應，蘆丁高劑量組與RhoA抑制劑組大鼠海馬組織神經(jīng)元凋亡率、Caspase-3、Bax表達比較差異無統(tǒng)計學意義。見表2，圖2、3。

Tab.2 Comparison of neuronal apoptosis rate and expression levels of apoptosis-related proteins Caspase-3 and Bax in hippocampal neurons of rats between the six groups表2各組大鼠海馬組織神經(jīng)元凋亡率和凋亡相關蛋白Caspase-3、Bax表達比較 （n=3，±s）

Tab.2 Comparison of neuronal apoptosis rate and expression levels of apoptosis-related proteins Caspase-3 and Bax in hippocampal neurons of rats between the six groups表2各組大鼠海馬組織神經(jīng)元凋亡率和凋亡相關蛋白Caspase-3、Bax表達比較 （n=3，±s）

組別假手術組模型組蘆丁低劑量組蘆丁中劑量組蘆丁高劑量組RhoA抑制劑組F凋亡率（%）2.84±0.59 30.25±5.31a 19.13±3.96ab 11.26±2.73abc 6.29±1.33abcd 5.87±1.24abcd 35.114＊＊凋亡相關蛋白Caspase-3 0.21±0.04 1.26±0.18a 0.90±0.13ab 0.61±0.10abc 0.41±0.06abcd 0.39±0.07abcd 39.040＊＊Bax 0.23±0.05 1.30±0.15a 0.97±0.14ab 0.66±0.12abc 0.40±0.10abcd 0.43±0.10abcd 36.955＊＊

Fig.2 Apoptosis of hippocampal neurons of rats in each group(TUNEL staining,×400)圖2各組大鼠海馬組織神經(jīng)元凋亡情況（TUNEL染色，×400）

Fig.3 Expression levels of apoptosis-related proteins(Caspase-3 and Bax)in hippocampal neurons of rats in each group圖3各組大鼠海馬組織神經(jīng)元凋亡相關蛋白（Caspase-3、Bax）表達情況

2.4 蘆丁對大鼠海馬組織神經(jīng)元超微結構的影響假手術組海馬組織神經(jīng)元超微結構、細胞器結構基本正常；模型組海馬組織神經(jīng)元超微結構、細胞器結構受損嚴重，細胞器數(shù)量減少，線粒體腫脹、畸形，甚至溶解消失。與模型組相比，蘆丁各劑量組及RhoA抑制劑組大鼠海馬組織神經(jīng)元超微結構、細胞器受損等均得到一定的恢復，且蘆丁各劑量組呈現(xiàn)一定的劑量依賴效應；蘆丁高劑量組與RhoA抑制劑組表現(xiàn)類似。見圖4。

2.5 蘆丁對大鼠海馬組織RhoA/ROCK通路蛋白表達的影響與假手術組相比，模型組海馬組織RhoA、ROCK1、ROCK2蛋白表達升高（P＜0.05）；與模型組相比，蘆丁各劑量組及RhoA抑制劑組海馬組織RhoA、ROCK1、ROCK2蛋白表達顯著降低（P＜0.05），且蘆丁各劑量組呈劑量依賴效應。蘆丁高劑量組與RhoA抑制劑組海馬組織RhoA、ROCK1、ROCK2蛋白表達比較差異無統(tǒng)計學意義。見表3、圖5。

Fig.4 Ultrastructural observation of hippocampal neurons of rats in each group(stained with Uranium acetate and lead citrate,×30 000)圖4各組大鼠海馬組織神經(jīng)元超微結構觀察（醋酸鈾和檸檬酸鉛染色，×30 000）

Tab.3 Comparison of RhoA,ROCK1 and ROCK2 protein expressions in hippocampus of rats between the six groups表3各組大鼠海馬組織RhoA、ROCK1、ROCK2蛋白表達比較 （n=3，±s）

Tab.3 Comparison of RhoA,ROCK1 and ROCK2 protein expressions in hippocampus of rats between the six groups表3各組大鼠海馬組織RhoA、ROCK1、ROCK2蛋白表達比較 （n=3，±s）

組別假手術組模型組蘆丁低劑量組蘆丁中劑量組蘆丁高劑量組RhoA抑制劑組F RhoA 0.11±0.03 1.08±0.12a 0.79±0.11ab 0.53±0.09abc 0.32±0.06abcd 0.30±0.05abcd 55.651＊＊ROCK1 0.21±0.05 1.28±0.14a 0.99±0.12ab 0.71±0.09abc 0.41±0.07abcd 0.43±0.07abcd 53.794＊＊ROCK2 0.17±0.03 1.34±0.20a 0.95±0.15ab 0.63±0.11abc 0.33±0.06abcd 0.36±0.07abcd 42.043＊＊

3 討論

Fig.5 Expression levels of RhoA,ROCK1 and ROCK2 proteins in hippocampus of rats in each group圖5各組大鼠海馬組織RhoA、ROCK1、ROCK2蛋白表達情況

慢性腦低灌注是老年人認知功能障礙的主要危險因素，腦組織長期處于低灌注狀態(tài)會引起腦內(nèi)大量神經(jīng)元功能受損，進而引起患者神經(jīng)變性及學習記憶障礙。既往研究常通過永久性結扎頸動脈構建慢性腦低灌注大鼠模型，可觀察到模型大鼠學習記憶能力降低、神經(jīng)元凋亡及結構改變等［12-13］。本研究通過結扎大鼠雙側頸動脈構建慢性腦低灌注大鼠模型，結果顯示，與假手術組相比，模型組大鼠逃避潛伏期明顯延長，穿越平臺次數(shù)明顯減少，HE染色結果顯示模型組大鼠海馬組織神經(jīng)元排列疏松且紊亂，出現(xiàn)細胞核固縮等神經(jīng)病理性改變，神經(jīng)元凋亡率和凋亡相關蛋白Caspase-3、Bax表達升高；電鏡結果顯示細胞器結構受損嚴重，細胞器數(shù)量減少，線粒體腫脹、畸形，甚至溶解消失，提示慢性腦低灌注可引起大鼠認知功能障礙及海馬組織神經(jīng)元損傷，表明慢性腦低灌注大鼠模型構建成功。

海馬區(qū)、腦部額葉皮層中的大量神經(jīng)元在維持認知、記憶功能等方面發(fā)揮重要作用，腦血流灌注不足使腦組織處于低氧低灌注狀態(tài)，會引起腦組織中大量神經(jīng)元受損，進而引起進展性或持久性認知障礙［14］。蘆丁是存在于多種植物中的天然黃酮類化合物，具有清除自由基、抗炎、調節(jié)免疫、神經(jīng)保護等多種生理藥理活性［15］。Kumar等［16］研究顯示蘆丁可減輕腦外傷所致大鼠腦皮層及海馬區(qū)神經(jīng)元損傷及凋亡情況，并改善大鼠認知功能障礙。石茜等［17］研究結果顯示，蘆丁可提高D-半乳糖所致衰老小鼠的記憶及認知功能，減少海馬組織神經(jīng)元凋亡數(shù)目，從而發(fā)揮其神經(jīng)保護功能。本研究結果顯示，與模型組相比，經(jīng)過蘆丁治療的慢性腦低灌注大鼠逃避潛伏期縮短，穿越平臺次數(shù)增加，海馬組織神經(jīng)元損傷得到緩解，神經(jīng)元凋亡率和凋亡相關蛋白Caspase-3、Bax表達降低，神經(jīng)元中細胞器受損情況得到緩解，且呈現(xiàn)一定的劑量效應關系，其中蘆丁高劑量組效果較好，表明蘆丁可改善慢性腦低灌注引起的認知功能障礙及神經(jīng)元損傷，但關于其作用機制仍不清晰。

RhoA/ROCK通路具有調控細胞增殖、分化、凋亡等作用，RhoA是Rho GTP酶家族的主要成員，ROCK1、ROCK2為RhoA的下游效應分子，RhoA/ROCK通路的激活可導致成纖維細胞肌動蛋白應力纖維的形成，導致軸突回縮及生長錐的塌陷，進而抑制神經(jīng)再生［18-19］。陸躍等［20］研究結果顯示抑制該通路的激活可促進腦缺血后神經(jīng)功能的恢復。激活RhoA/ROCK通路可導致血管狹窄，從而降低腦組織血流，加劇神經(jīng)元凋亡［21］。單海雷等［22］研究結果顯示抑制RhoA/ROCK通路可減輕腦缺血再灌注導致的神經(jīng)元凋亡和氧化應激，從而緩解大鼠神經(jīng)功能障礙。本研究結果顯示，模型組大鼠海馬組織RhoA、ROCK1、ROCK2蛋白表達顯著高于假手術組，提示RhoA/ROCK通路的激活可能參與了神經(jīng)元損傷過程；與模型組相比，蘆丁各劑量組大鼠海馬組織RhoA、ROCK1、ROCK2蛋白表達顯著降低，且蘆丁高劑量組效果與RhoA抑制劑效果相似，表明蘆丁可能通過抑制RhoA/ROCK通路發(fā)揮神經(jīng)元保護作用。

綜上所述，蘆丁對慢性腦低灌注引起的大鼠海馬組織損傷具有一定的保護作用，且可能是通過抑制RhoA/ROCK通路發(fā)揮作用。但蘆丁作用機制復雜，本研究僅采用通路抑制劑進行對比觀察，未設置相應通路激活劑，有待深入研究。