劉猛，姜玖良，付立躍，李俊俊，朱海濤△

膽管癌（CCA）是最常見的膽道惡性腫瘤，5年生存率低，治療方法有限［1-2］，主要包括手術、放化療、肝移植、中醫(yī)治療和靶向治療［3］。因多數CCA患者初診時已存在局部侵犯或遠處轉移，失去手術機會，越來越多的研究支持化療、聯合化療或靶向治療。研究發(fā)現，CCA患者存在表皮生長因子受體（EGFR）、血管內皮生長因子（VEGF）、人表皮生長因子受體2（HER2）、絲裂原活化蛋白激酶（MEK）等多種類型突變［4］。多納非尼是一種多靶點、多激酶抑制劑類小分子抗腫瘤藥物，可抑制多種受體激酶，包括VEGF受體、血小板衍生生長因子（PDGF）受體和Raf激酶等［5］，可用于治療肝癌［6］、甲狀腺癌［7］、結腸癌［8］等多種癌癥。Wnt/β-catenin信號通路在細胞增殖和分化等組織正常發(fā)育過程中起重要作用［9］，其異常激活與包括CCA在內的多種類型腫瘤發(fā)生和進展密切相關［10］。目前，多納非尼在CCA的研究較為少見。本研究旨在探究多納非尼對人CCA細胞生物學功能及Wnt/β-catenin信號通路的影響，為臨床應用多納非尼治療CCA提供一定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料人膽管癌TFK-1細胞株由南方醫(yī)科大學中心實驗室贈送。多納非尼（蘇州澤璟生物制藥股份有限公司）；胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶（以色列Biological Industries公司）；DAPI、二甲基亞砜（索萊寶公司）；4%多聚甲醛、結晶紫染色液、曲拉通X-100、凋亡試劑盒（碧云天公司）；CCK-8試劑（MCE公司）；Transwell小室（美國康寧公司）；Matrigel基質膠（美國BD公司）；Wnt、β-catenin、細胞周期蛋白-D1（Cyclin D1）、抗凋亡蛋白Bcl-2、促凋亡蛋白Bax、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）兔抗人一抗及羊抗兔二抗均購自于武漢三鷹公司；羊抗兔熒光二抗（廣州艾菲生物公司）；倒置顯微鏡（Carl Zeiss）；酶標儀、CO2細胞培養(yǎng)箱（美國賽默飛世爾科技公司）；流式細胞儀（美國貝克曼庫爾特有限公司）。

1.2 研究方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與分組TFK-1細胞用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，待細胞密度達到80%左右，加入胰蛋白酶消化后常規(guī)傳代培養(yǎng)。以二甲基亞砜為溶劑，將多納非尼配制成2、5及10 μmol/L溶液對細胞進行干預，分別為2、5、10 μmol/L多納非尼組；對照組加入等量的不含多納非尼的二甲基亞砜。

1.2.2 CCK-8法檢測細胞增殖抑制率將TFK-1細胞收集在離心管中，計數后接種于96孔板中，每孔5×103個細胞，細胞貼壁生長后給藥干預，48 h后移去培養(yǎng)液，加入CCK-8試劑和DMEM的混合液，避光1 h后酶標儀檢測450 nm光密度（OD）值，計算細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率（%）=（1-實驗孔OD值/對照孔OD值）×100%。

1.2.3 平板克隆實驗檢測細胞增殖情況多納非尼處理細胞后，于6孔板中每孔中加入1 500個TFK-1細胞，每3 d更換1次完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)10 d后取出。移除舊的培養(yǎng)基，PBS洗2次，用多聚甲醛室溫固定25 min，PBS洗2次，結晶紫染色液染30 min，移液器移除結晶紫，PBS洗凈，烘箱干燥，拍照記錄并用Image J軟件計算各組的克隆數。

1.2.4 流式細胞術檢測細胞凋亡 將細胞計數后按5×105個/孔接種于6孔板中，按照1.2.1將細胞分組處理，培養(yǎng)24 h后用不含EDTA的胰蛋白酶消化收集細胞，800 r/min離心5 min，收集貼壁細胞，制成0.5 mL單細胞懸液，先后加入Annexin V和PI各5 μL，室溫下避光染色10 min。然后使用流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.2.5 Transwell實驗檢測細胞遷移和侵襲能力 遷移實驗：取對數生長期的TFK-1細胞，用DMEM培養(yǎng)基稀釋使其細胞密度為5×105個/mL，取100 μL細胞懸液加進Transwell小室上室，下室加入800 μL含20%胎牛血清的完全培養(yǎng)基；1 h后用提前配制好的多納非尼替換下室培養(yǎng)基，放入細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后取出小室，室溫下多聚甲醛固定25 min，0.1%結晶紫溶液染色15 min，洗凈后用棉簽輕輕拭去上室未遷移的細胞，倒置顯微鏡下拍照。侵襲實驗：把Matrigel膠與無血清DMEM培養(yǎng)基按1∶8比例配制，加入60 μL基質膠鋪于上室中，上下晃動，無氣泡產生，4℃干燥過夜，于使用前放置于37℃中使基質膠凝固。后續(xù)操作同細胞遷移實驗。

1.2.6 蛋白質免疫印跡法檢測Wnt、β-catenin、Cyclin D1及Bcl-2、Bax蛋白表達 將TFK-1細胞按1.2.1分組處理，用RIPA裂解液冰上裂解15 min后，離心提取上清蛋白，并通過BCA蛋白質定量試劑盒測量濃度。聚丙烯酰胺凝膠電泳將蛋白質樣品分離，恒流濕轉法將蛋白轉至PVDF膜上，轉膜后BSA封閉液室溫封閉1 h，孵育一抗GAPDH（1∶5 000）、Wnt（1∶1 000）、β-catenin（1∶5 000）、Cyclin D1（1∶5 000）、Bcl-2（1∶2 000）、Bax（1∶5 000）于4℃過夜，PBS漂洗3遍，加入二抗（1∶5 000）常溫下孵育1 h，滴加高敏曝光液在成像系統中曝光，用Image J軟件對目的蛋白條帶進行灰度值分析，計算蛋白相對表達量。

1.2.7 免疫熒光實驗檢測β-catenin進入細胞核的變化 將TFK-1細胞分別按照對照組和2 μmol/L多納非尼組處理，制備細胞爬片，待細胞貼壁后取出用4%的多聚甲醛固定20 min，PBS浸洗玻片3次，每次3 min，0.2%Triton X-100通透5 min，PBS浸洗玻片3次，每次3 min，吸水紙吸干PBS，在玻片上滴加0.5%BSA室溫封閉30 min，滴加一抗放入濕盒，4℃孵育過夜后避光孵育熒光二抗1 h，PBS浸洗玻片3次后孵育DAPI 5 min，封片后熒光顯微鏡拍照。

1.3 統計學方法 采用SPSS 21.0軟件進行數據分析，計量資料用±s表示，2組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用Tukey-q檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 多納非尼對TFK-1細胞增殖能力的影響2、5、10 μmol/L多納非尼組細胞增殖抑制率（%）分別為3.86±0.73、16.87±1.89和81.12±1.02，組間差異有統計學意義（n=3，F=1 996.000，P＜0.01）。對照組及2、5、10 μmol/L多納非尼組克隆形成數（個/視野）分別為326.33±11.46、163.33±3.68、46.67±2.87和13.33±1.25，組間差異有統計學意義（n=3，F=1 033.000，P＜0.01），見圖1。

2.2 各組TFK-1細胞凋亡水平比較對照組和2、5、10 μmol/L多納非尼組的細胞凋亡率（%）分別為3.98±0.69、6.41±0.60、13.44±1.26和20.27±2.20。隨著多納非尼濃度升高，細胞凋亡率逐漸升高（n=3，F=59.550，P＜0.05），見圖2。

2.3 多納非尼抑制TFK-1細胞遷移和侵襲隨著多納非尼濃度升高，細胞遷移和侵襲數量逐漸減少（P＜0.05），見圖3、表1。

2.4 各組細胞β-catenin通路蛋白及凋亡相關蛋白表達水平的變化隨著多納非尼濃度的升高，Wnt、β-catenin、Cyclin D1、Bcl-2蛋白表達均逐漸下降，Bax蛋白表達逐漸增高（P＜0.05），見圖4、表2。

2.5 多納非尼抑制對β-catenin進入細胞核的影響與對照組［（70.67±4.92）個/視野］比較，2 μmol/L多納非尼組β-catenin進入細胞核的細胞數［（24.67±3.68）個/視野］減少（n=3，t=10.930，P＜0.05），見圖5。

3 討論

肝內CCA早期常無明顯癥狀，直至病灶進展增大引起膽道梗阻造成膽汁淤積、引流不暢等相應癥狀出現時已是晚期［11］，加之治療手段有限且療效并不理想，以致患者的存活率仍處于較低水平［12］。因此，探尋治療CCA的新型靶向藥物并研究其潛在的分子機制具有重要意義。

Fig.1 Colony formation assay results圖1各組克隆形成實驗結果

Fig.2 The cell apoptosis in four groups of TFK-1 cells detected by flow cytometry圖2 4組TFK-1細胞凋亡流式圖

Fig.3 Effects of donafenib on migration and invasion of TFK-1 cells(crystal violet staining,×200)圖3 4組TFK-1細胞遷移和侵襲能力變化（結晶紫染色，×200）

Tab.1 Comparison of the migration and invasion of TFK-1 cells between the four groups表1各組TFK-1細胞遷移和侵襲數量比較（個/視野，±s）

Tab.1 Comparison of the migration and invasion of TFK-1 cells between the four groups表1各組TFK-1細胞遷移和侵襲數量比較（個/視野，±s）

＊＊P＜0.01，a與對照組比較，b與2 μmol/L多納非尼組比較，c與5 μmol/L多納非尼組比較，P＜0.05；表2同。

組別對照組2 μmol/L多納非尼組5 μmol/L多納非尼組10 μmol/L多納非尼組F n3 3 3 3細胞遷移167.67±5.31 77.33±4.50a 40.67±2.87ab 27.67±2.49abc 507.400＊＊細胞侵襲216.67±4.64 116.33±3.40a 33.67±2.49ab 19.33±2.62abc 1 427.000＊＊

多納非尼是一種口服抗腫瘤藥物，可阻斷腫瘤血管生成，抑制腫瘤細胞增殖，發(fā)揮雙重抑制、多靶點阻斷的抗腫瘤作用［13］。Wnt/β-catenin通路是一個在胚胎發(fā)育和成人組織穩(wěn)態(tài)中起關鍵作用的蛋白質作用網絡，包括Wnt、卷曲蛋白（FZD）、β-catenin、低密度脂蛋白受體相關蛋白（LRP）5/6、Dsh、酪蛋白激酶?（CKl）、T細胞因子（TCF）/淋巴增強因子（LEF）和泛素蛋白（Ub）等，β-catenin是Wnt/β-catenin通路的調節(jié)中心，胞質中的β-catenin與TCF/LEF結合后進入細胞核成為轉錄激活劑，最終激活Wnt靶基因，如CMyc、CyclinD1、環(huán)氧合酶-2、c-Jun等，Wnt/β-catenin通路失調可導致包括腫瘤在內的各種嚴重疾?。?4］。在正常的肝臟中，Wnt/β-catenin通路大部分是無活性的，但在細胞更新、再生過程中或某些病理狀況下（如癌前病變和腫瘤）會被激活［15］。有研究表明，Wnt/β-catenin信號通路的激活在CCA的誘導和進展中起關鍵作用，在不同類型的惡性膽道腫瘤中，存在不同Wnt配體（包括Wnt2，Wnt3，Wnt5，Wnt7和Wnt10）的上調以及β-catenin蛋白的重新分布［16］。

Fig.4 Expression changes of β-catenin pathway protein and apoptosis related protein after treatment with donafenib detected by Western blot assay圖4 Western blot檢測多納非尼作用后β-catenin通路蛋白和凋亡相關蛋白表達變化

Tab.2 Comparison of expression levels of Wnt,β-catenin,Cyclin D1,Bax and Bcl-2 between the four groups表2各組Wnt、β-catenin、Cyclin D1、Bax、Bcl-2蛋白表達水平比較 （n=3，±s）

Tab.2 Comparison of expression levels of Wnt,β-catenin,Cyclin D1,Bax and Bcl-2 between the four groups表2各組Wnt、β-catenin、Cyclin D1、Bax、Bcl-2蛋白表達水平比較 （n=3，±s）

組別對照組2 μmol/L多納非尼組5 μmol/L多納非尼組10 μmol/L多納非尼組F Wnt 0.72±0.05 0.53±0.02a 0.33±0.04ab 0.17±0.04abc 514.400＊＊β-catenin 0.69±0.03 0.46±0.03a 0.34±0.02ab 0.18±0.01abc 438.000＊＊Cyclin D1 0.80±0.04 0.63±0.03a 0.34±0.02ab 0.31±0.02abc 594.300＊＊Bax 0.15±0.03 0.27±0.02a 0.42±0.01ab 0.90±0.03abc 990.800＊＊Bcl-2 0.53±0.02 0.32±0.02a 0.23±0.02ab 0.13±0.03abc 475.000＊＊

Fig.5 Changes in β-catenin entry into the nucleus after treatment with donafenib detected by immunofluorescence assay(immunofluorescence staining,×200)圖5免疫熒光檢測多納非尼處理后β-catenin進入細胞核的變化（免疫熒光染色，×200）

維持增殖信號、激活侵襲和遷移是腫瘤的兩大生物學能力［17］。本研究表明，多納非尼在體外抑制了人膽管癌TFK-1細胞的增殖、遷移和侵襲能力。細胞凋亡是細胞的一種基本生物學現象，其在細胞內環(huán)境的穩(wěn)定以及多個系統的發(fā)育中發(fā)揮重要作用，細胞凋亡失調被認為是癌癥發(fā)展的主要原因之一［18］。本研究發(fā)現，隨著多納非尼濃度的升高，人膽管癌TFK-1細胞的凋亡率逐漸升高，同時抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白表達逐漸降低，促凋亡蛋白Bax表達逐漸升高，提示多納非尼可促進TFK-1細胞凋亡。有研究表明藤黃酸能夠在膽管癌細胞中抑制Wnt/βcatenin信號通路和誘導細胞凋亡發(fā)揮抗腫瘤作用［9］。筆者推測多納非尼可能通過影響Wnt/β-catenin信號通路在CCA中發(fā)揮抗腫瘤作用。本研究顯示，多納非尼抑制了通路蛋白Wnt、β-catenin和Cyclin D1的表達，說明多納非尼能夠抑制Wnt/β-catenin信號通路的活化。Wnt/β-catenin信號通路被激活時，Wnt蛋白會結合FZD蛋白與LRP5/6蛋白組成的異源二聚體受體復合物，最終導致β-catenin在胞質中積累并轉運到細胞核［19］。本研究顯示，多納非尼能夠抑制β-catenin從胞質轉運到細胞核，進一步表明多納非尼能夠抑制Wnt/β-catenin信號通路的激活。

綜上所述，多納非尼可通過抑制Wnt/β-catenin信號通路的活化抑制人CCA TFK-1細胞的增殖、遷移及侵襲，并促進細胞凋亡，為多納非尼治療膽管癌提供一定的理論基礎和參考，但多納非尼影響Wnt/β-catenin信號通路的具體機制仍需進一步探索。此外，多納非尼在CCA中的作用還需要通過動物實驗研究進一步驗證。