羅單

惡性黑色素瘤 (malignant melanoma,MM) 是一種起源于黑色素細(xì)胞或黑色素細(xì)胞源性細(xì)胞的皮膚腫瘤［1］。盡管惡性黑色素瘤僅占所有皮膚腫瘤的小部分,但由于其不良的預(yù)后和較高的死亡率(占所有皮膚癌死亡人數(shù)的65%),目前已經(jīng)成為全世界最具侵害性和最易致命的皮膚癌之一,同時(shí)也是全球人類健康不容忽視的危害。達(dá)拉非尼是一種已經(jīng)被批準(zhǔn)使用于治療Ⅲ/Ⅳ期和轉(zhuǎn)移性惡性黑色素瘤的小分子靶向藥物,但是根據(jù)多項(xiàng)報(bào)道認(rèn)為,惡性黑色素瘤患者在服藥以后會(huì)較快出現(xiàn)耐藥性,因此對(duì)于臨床效果來(lái)說(shuō)是有一定限制的［2］。實(shí)際上,目前很多專家認(rèn)為耐藥性已經(jīng)成為了治療惡性黑色素瘤的主要挑戰(zhàn)之一,因此要找到耐藥機(jī)制。當(dāng)然,癌癥的耐藥機(jī)制是復(fù)雜多元化的,很多研究認(rèn)為主要原因就是機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞自噬與凋亡,以及遺傳的不穩(wěn)定性所導(dǎo)致的［3,4］。本研究從自噬角度出發(fā),對(duì)黑色素瘤來(lái)源的外泌體miR-23a 在黑色素瘤達(dá)拉非尼耐藥中的機(jī)制進(jìn)行分析和研究。

1 材料與方法

1.1 材料 購(gòu)買的細(xì)胞為美國(guó)American Type Culture Collection 的惡性黑色素瘤細(xì)胞系A(chǔ)375；所用主要實(shí)驗(yàn)試劑包含如下：美國(guó)Sigma-Aldrich 公司的達(dá)拉非尼,美國(guó)Cell Signaling Technology 生產(chǎn)的抗裂解PARP、抗LC3Ⅰ/Ⅱ和物種特異性二抗,美國(guó)LI-COR Biosciences公司生產(chǎn)的DMEM 培養(yǎng)基,美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司生產(chǎn)的胎牛血清和雙抗；所用主要儀器設(shè)備包含如下：美國(guó)Nikon 公司生產(chǎn)的PCM 2000 共聚焦顯微鏡,上海力申公司生產(chǎn)的臺(tái)式高速離心機(jī),美國(guó)BioTek 公司生產(chǎn)的酶標(biāo)儀,美國(guó)伯樂(lè)公司生產(chǎn)的蛋白電泳儀、SDS-PAGE 凝膠電泳儀,上海培清科技有限公司生產(chǎn)的化學(xué)發(fā)光儀。

1.2 方法

1.2.1 達(dá)拉非尼處理 選擇惡性黑色素瘤細(xì)胞系A(chǔ)375,再用(0、30、100、300 nM)濃度的達(dá)拉非尼對(duì)其進(jìn)行24 h 處理。

1.2.2 模擬物轉(zhuǎn)染 將miR-23a 模擬物轉(zhuǎn)染到達(dá)拉非尼耐藥性最強(qiáng)的A375 細(xì)胞株上,使其呈現(xiàn)miR-23a過(guò)表達(dá)。將A375 細(xì)胞株在6 孔培養(yǎng)板中接種,每個(gè)孔中為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞20 萬(wàn)個(gè),細(xì)胞生長(zhǎng)融合到60%左右就進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作,取其中A 管加入miR-23a mimics(miR-23a 組),然后按照細(xì)胞培養(yǎng)條件進(jìn)行培養(yǎng),取B 管加入15 μl 脂質(zhì)體Lipofectamine2000,按照細(xì)胞培養(yǎng)條件進(jìn)行培養(yǎng)。兩組均培養(yǎng)48 h 以后對(duì)細(xì)胞的上清液加以收集。

1.2.3 利用Western Blot 和qPCR 檢測(cè)處理前后A375 細(xì)胞中的LC3Ⅰ/Ⅱ、ROS、caspase-3、TNF-α、caspase-8 等表達(dá)水平 qPCR 檢測(cè)miR-23a 表達(dá),首先提取外周血單核血細(xì)胞中的總RNA,把組織樣本放在室溫環(huán)境下靜置5 min,然后放入A 組各管里面進(jìn)行震蕩混勻,在室溫下孵育20 min。在培養(yǎng)板的細(xì)胞中,分別均勻滴入上述轉(zhuǎn)染混合液,并慢慢搖勻,在37℃培養(yǎng)箱中孵育過(guò)夜。然后根據(jù)TaKaRa 公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說(shuō)明書進(jìn)行具體操作。

Western Blot 檢測(cè)LC3Ⅰ/Ⅱ、ROS、caspase-3、TNF-α、caspase-8 表達(dá)蛋白水平,嚴(yán)格按照操作說(shuō)明書進(jìn)行操作,并將印記膜接觸膠片,根據(jù)熒光強(qiáng)弱進(jìn)行不同的曝光,12 h 后洗片,然后用圖像分析軟件進(jìn)行灰度值的分析,以及參用內(nèi)參灰度值對(duì)蛋白相對(duì)含量進(jìn)行比較。

1.3 觀察指標(biāo) ①檢測(cè)和比較惡性黑色素瘤細(xì)胞內(nèi)被用不同濃度的達(dá)拉非尼處理前后LC3Ⅰ/Ⅱ表達(dá)的水平。②檢測(cè)和比較耐藥惡性黑色素瘤細(xì)胞內(nèi)被轉(zhuǎn)染前后miR-23a、ROS、caspase-3、TNF-α、caspase-8 表達(dá)的水平。③分析miR-23a 與耐藥相關(guān)通路上各個(gè)因子的相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,采用t檢驗(yàn)；相關(guān)性檢驗(yàn)采用Pearson 線性相關(guān)分析。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 達(dá)拉非尼處理前后A375 細(xì)胞系中LC3Ⅰ/Ⅱ的表達(dá) 將A375 細(xì)胞系用不同濃度的達(dá)拉非尼(0、30、100、300 nM) 處理,收集細(xì)胞。經(jīng)Western Blot檢測(cè)LC3Ⅰ/Ⅱ蛋白表達(dá)水平,并行qPCR 分析,發(fā)現(xiàn)LC3Ⅰ/Ⅱ水平隨達(dá)拉非尼濃度的升高而增加,說(shuō)明達(dá)拉非尼以劑量依賴性方式顯著激活了自噬信號(hào)。見圖1。

圖1 LC3Ⅰ/Ⅱ蛋白表達(dá)水平WB 圖

2.2 耐藥惡性黑色素瘤細(xì)胞內(nèi)被轉(zhuǎn)染前后miR-23a、ROS、caspase-3、TNF-α、caspase-8 表達(dá)水平 轉(zhuǎn)染后,miR-23a、ROS、caspase-3、TNF-α、caspase-8 的 表達(dá)水平均高于轉(zhuǎn)染前,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)。見表1。

表1 耐藥惡性黑色素瘤細(xì)胞內(nèi)被轉(zhuǎn)染前后miR-23a、ROS、caspase-3、TNF-α、caspase-8 表達(dá)水平比較()

表1 耐藥惡性黑色素瘤細(xì)胞內(nèi)被轉(zhuǎn)染前后miR-23a、ROS、caspase-3、TNF-α、caspase-8 表達(dá)水平比較()

注：與轉(zhuǎn)染前比較,aP＜0.05

2.3 miR-23a 與耐藥相關(guān)通路上各個(gè)因子的相關(guān)性分析 Pearson 線性相關(guān)分析結(jié)果顯示,miR-23a 表達(dá)水平與caspase-3、TNF-α、caspase-8、TGF-β、LC3Ⅰ/Ⅱ呈正相關(guān)(P＜0.05),與ROS 無(wú)相關(guān)性(P＞0.05)。見表2。

表2 miR-23a 與耐藥相關(guān)通路上各個(gè)因子的相關(guān)性分析

3 討論

黑色素瘤是一種具有高侵襲性及死亡率的惡性腫瘤,早期診斷并通過(guò)手術(shù)切除可以達(dá)到較好的臨床預(yù)后,而發(fā)生轉(zhuǎn)移的黑色素瘤由于缺乏有效的治療手段,生存率極低。我國(guó)較多患者都受到疾病意識(shí)、經(jīng)濟(jì)和醫(yī)療因素的影響導(dǎo)致診斷的時(shí)候已經(jīng)有不同程度的轉(zhuǎn)移,所以對(duì)黑色素瘤的早期識(shí)別,以及對(duì)有效的晚期治療途徑的尋找就顯得比較重要［5］。目前達(dá)拉非尼已經(jīng)被認(rèn)為是治療轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的一線化療藥物,50%～60%接受達(dá)拉非尼治療的患者可以顯著延長(zhǎng)無(wú)進(jìn)展生存期和總生存期。盡管,達(dá)拉非尼擁有如此良好的療效,但對(duì)于藥物的耐受限制了患者的長(zhǎng)期有效治療。外泌體是由多種類型細(xì)胞分泌的一種細(xì)胞外囊泡,通過(guò)其載體作用將內(nèi)容物從分泌細(xì)胞轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞間的通信交流。基于其獨(dú)特的生物特性和功能,外泌體已被應(yīng)用于黑色素瘤的診斷、治療和預(yù)后評(píng)價(jià)等方面［6］。達(dá)拉非尼是一種新型的治療黑色素瘤的有效藥物,可以通過(guò)阻止BRAF 基因突變縮小黑色素瘤。這類靶向藥物可以明顯延長(zhǎng)BRAF 基因突變的黑色素瘤患者的生存時(shí)間,然而大部分患者會(huì)產(chǎn)生一定的達(dá)拉非尼耐藥,而導(dǎo)致腫瘤繼續(xù)生長(zhǎng)。因此對(duì)外泌體調(diào)控黑色素瘤的發(fā)病機(jī)制與達(dá)拉非尼耐藥的研究更突顯其意義。miRNA-23a 是存在脊椎動(dòng)物的基因組中的一種抑癌因子,可參與基因轉(zhuǎn)錄后表達(dá)調(diào)控,從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲,其表達(dá)量在乳腺癌、小細(xì)胞性肺癌、肝細(xì)胞癌、膠質(zhì)瘤等多種惡性腫瘤的診斷及預(yù)后評(píng)估中具有重要的參考價(jià)值。已報(bào)道m(xù)iRNA-23a 在黑色素瘤中的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)中存在異常,而且已被證實(shí)可以通過(guò)外泌體分泌至腫瘤環(huán)境中,但其調(diào)節(jié)黑色素瘤進(jìn)展的具體機(jī)制相關(guān)研究很少。

黑色素瘤耐藥研究中,細(xì)胞凋亡和自噬研究歷來(lái)是焦點(diǎn)和重點(diǎn),其中細(xì)胞自噬可以降解細(xì)胞漿內(nèi)的許多物質(zhì),比如細(xì)胞質(zhì)、蛋白和一些大分子物質(zhì),將其傳遞到溶酶體,然后進(jìn)行降解。

整個(gè)清除過(guò)程主要是為了細(xì)胞穩(wěn)態(tài)得到保持,并使得細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷得到保護(hù),提高細(xì)胞的自噬活性關(guān)系到多種癌癥細(xì)胞的存活情況［7］。迄今為止,已經(jīng)能夠支持靶向療法耐藥中,自噬占據(jù)重要地位的證據(jù)有很多［8］。凋亡作為程序性細(xì)胞死亡形式之一可以有序、有效的清除受損細(xì)胞,而癌癥的發(fā)生大部分與細(xì)胞凋亡機(jī)制失去平衡有著明顯的關(guān)系,凋亡不僅僅是腫瘤發(fā)生和發(fā)展的標(biāo)志性事件,而且還與腫瘤對(duì)藥物的抵抗有著很大的關(guān)系［9］。LC3 合成前體LC3(pro-LC3),然后其末端被水解切割后失去多肽使得甘氨酸發(fā)生暴露,成為了LC3-Ⅰ。在細(xì)胞自噬的過(guò)程中,LC3-Ⅰ扮演著重要角色,其在ATG7、ATG12-ATG5-ATG16L 作用下結(jié)合磷脂酰乙醇胺組成了LC3-Ⅱ,其因?yàn)楸恍揎椧虼穗姾砂l(fā)生變化而形成更快的遷移率。本研究選擇惡性黑色素瘤細(xì)胞系A(chǔ)375,再用(0、30、100、300 nM)濃度的達(dá)拉非尼對(duì)其進(jìn)行24 h 處理,結(jié)果發(fā)現(xiàn)LC3Ⅰ/Ⅱ水平隨達(dá)拉非尼濃度的升高而增加；然后再用miR-23a 模擬物轉(zhuǎn)染對(duì)300 nM 的A375 細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染,利用Western Blot 和qPCR 檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后A375 細(xì)胞中的miR-23、LC3Ⅰ/Ⅱ、ROS、caspase-3、TNF-α、caspase-8 等表達(dá)水平。發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后,miR-23a、ROS、caspase-3、TNF-α、caspase-8 的表達(dá)水平均高于轉(zhuǎn)染前,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)。Pearson 線性相關(guān)分析結(jié)果顯示,miR-23a 表達(dá)水平與caspase-3、TNF-α、caspase-8、TGF-β、LC3Ⅰ/Ⅱ呈正相關(guān)(P＜0.05),與ROS 無(wú)相關(guān)性(P＞0.05)。在細(xì)胞凋亡通路中,細(xì)胞內(nèi)的Ca2+濃度升高后,氧化損傷會(huì)引起羥自由基等ROS、毒素、一氧化氮(NO)、生長(zhǎng)因素和激素刺激等［3］發(fā)生異常改變,并會(huì)對(duì)caspase-8發(fā)生激活后引起caspase 級(jí)聯(lián)反應(yīng),從而細(xì)胞凋亡開始,因此本研究結(jié)果提示了miR-23a 表達(dá)水平與caspase通路相關(guān),從而繼發(fā)了細(xì)胞凋亡通路,也可能是通過(guò)這一路徑,因?yàn)閷?dǎo)致了黑色素瘤達(dá)拉非尼的耐藥發(fā)生。

綜上所述,達(dá)拉非尼耐藥惡性黑色素瘤細(xì)胞A375,相比于處理前,其LC3Ⅰ/Ⅱ、ROS、caspase-3、TNF-α、caspase-8 表達(dá)顯著上調(diào)；達(dá)拉非尼耐藥惡性黑色素瘤細(xì)胞中的miR-23a 表達(dá)水平上調(diào)后,能夠促使耐藥細(xì)胞發(fā)生自噬而導(dǎo)致凋亡加速,這可能就是miR-23a 在黑色素瘤達(dá)拉非尼耐藥中發(fā)生影響的可能機(jī)制。