劉璐 匡榮 虞佳濤 李墨池 張勁松

糖尿病是全球性的慢性疾病,患者由于缺乏胰島素分泌減少或者產(chǎn)生耐受,導(dǎo)致血糖代謝紊亂,形成高血糖癥。目前,治療糖尿病主要方式是口服降糖藥和注射胰島素,而對于胰島素起效作用而言,分為長效、中效、短效和速效胰島素,市場上主要的胰島素產(chǎn)品有德谷胰島素、門冬胰島素,門冬胰島素是用生物技術(shù)將人胰島素氨基酸鏈B28 位的脯氨酸由天門冬氨酸替代而成的,具有降血糖作用,注射后15 min 起效,作用可持續(xù) 3～5 h。門冬胰島素的降血糖作用是通過其分子與肌肉和脂肪細(xì)胞上的胰島素受體結(jié)合后,促進(jìn)細(xì)胞對葡萄糖吸收利用,同時(shí)抑制肝臟葡萄糖的輸出來實(shí)現(xiàn)的。臨床數(shù)據(jù)表明,通過安全性藥理學(xué)、重復(fù)給藥毒性、遺傳毒性和生殖毒性的常規(guī)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),門冬胰島素對人體沒有特殊危險(xiǎn)。在體外試驗(yàn)中,包括與胰島素和胰島素樣生長因子-1 受體的結(jié)合,以及對細(xì)胞生長的影響,門冬胰島素的表現(xiàn)與人胰島素非常相似［1-6］。因此,門冬胰島素的有效性研究成為產(chǎn)品質(zhì)量控制的關(guān)鍵,主要體現(xiàn)在其生物活性/效價(jià)的控制,也有通過液相、超高液相方法測定門冬胰島素的含量方法,兩者結(jié)合精確度更高,本研究根據(jù)中國藥典對門冬胰島素測定方法進(jìn)行規(guī)范的驗(yàn)證,用門冬胰島素標(biāo)準(zhǔn)品,以小鼠為載體,建立門冬胰島素生物活性測定方法［7-10］,確保測定方法的可行性,為產(chǎn)品優(yōu)化提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 120 只雌性ICR 小鼠,無特定病原體(SPF)級,體重20～26 g,購自上海吉輝實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)有限公司,動(dòng)物生產(chǎn)許可證：SCXK(滬)2017-0012,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室：浙江省食品藥品檢驗(yàn)研究院,動(dòng)物使用許可證：SYXK(浙)2021-0016,所有動(dòng)物的使用均經(jīng)過實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用和管理委員會(huì)(IACUC)批準(zhǔn),IACUC 編號為2021-010。飼料為Co60 輻照實(shí)驗(yàn)鼠維持飼料,購自江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責(zé)任公司,生產(chǎn)許可證號：蘇飼證(2019)01008。動(dòng)物飼養(yǎng)期間,自由攝食和飲水。

1.2 藥物與試劑 門冬胰島素標(biāo)準(zhǔn)品(中國食品藥品檢定研究院,批號：410011-201902,效價(jià)：27.4 U/mg)。氯化鈉(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,批號：20200915),苯酚(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,批號：20200508),三氯乙酸(南京化學(xué)試劑股份有限公司,批號：181017238C),鹽酸(杭州天動(dòng)力化學(xué)品有限公司,批號：20201104),葡萄糖測定試劑盒 (德國德賽診斷系統(tǒng)有限公司,批號：29204)。

1.3 主要儀器 日立7180 型自動(dòng)生化分析儀(日本日立公司),ME2002E 型電子天平(METLER TOLEDO),XPR305 型天平(METLER TOLEDO),TD1200 型電子天平(寧波金諾天平儀器有限公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 供試液的制備 實(shí)驗(yàn)當(dāng)天取一定量的門冬胰島素標(biāo)準(zhǔn)品,用pH=2.5(含苯酚)的生理鹽水配成20 U/ml的母液,取母液用pH=2.5 的生理鹽水分別配制成0.08 U/ml、0.04 U/ml,0.1 U/ml、0.05 U/ml,0.125 U/ml、0.0625 U/ml 門冬胰島素溶液,相當(dāng)于80%,100%,125%效價(jià)水平高低濃度的待測溶液,標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度高低劑量濃度為0.1 U/ml、0.05 U/ml。

2.2 動(dòng)物分組及給藥 120 只小鼠,隨機(jī)分成A1 組、B1 組、C1 組、D1 組、A2 組、B2 組、C2 組、D2 組、A3 組、B3 組、C3 組、D3 組,每組10 只。四組為一批,分別用門冬胰島素標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行80%、100%、125%效價(jià)水平測定。組間平均體重差＜3 g,逐只編號,按ds1、ds2、dT1、dT2 順序分別自皮下注入標(biāo)準(zhǔn)品或供試品稀釋液,0.2 ml/鼠,每只間隔1 min,注射后40 min 按給藥順序分別自眼靜脈叢采血,采血后取0.06 ml 加至含0.36 ml 三氯乙酸的EP 管中,以2500 r/min 速率離心15 min,取上清液,用生化分析儀測定血糖值。按雙交叉設(shè)計(jì),第2 次給樣按dT2、dT1、ds2、ds1 順序進(jìn)行,并測定給樣后40 min 的血糖值。2 次間隔給藥時(shí)間4 h,照生物檢定統(tǒng)計(jì)法(通則1431)中量反應(yīng)平行線測定雙交叉設(shè)計(jì)法計(jì)算效價(jià)及實(shí)驗(yàn)誤差。按上述方法重復(fù)實(shí)驗(yàn)2 次,給藥方案見表1。依據(jù)中國藥典2020 版通則9401 生物制品生物活性/效價(jià)測定方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則,對實(shí)驗(yàn)相對準(zhǔn)確度、中間精密度、線性和范圍進(jìn)行評估。

表1 門冬胰島素給樣方案

2.3 樣品測定 根據(jù)建立的實(shí)驗(yàn)方法,分別測定3 批門冬胰島素標(biāo)準(zhǔn)品及3 批門冬胰島素供試品稀釋液生物效價(jià)。

2.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所得數(shù)據(jù)錄入BS2000生物檢定軟件中統(tǒng)計(jì),依據(jù)中國藥典2020 版(通則1431)中量反應(yīng)平行線測定雙交叉設(shè)計(jì)法,BS2000 中分別計(jì)算80%、100%、125%效價(jià)水平試驗(yàn)所測得的待測溶液生物活性和試驗(yàn)誤差。80%、125%效價(jià)水平試驗(yàn)可靠性測驗(yàn)結(jié)果判定要求為：回歸F檢驗(yàn)顯著(P＜0.05),偏離平行F檢驗(yàn)不顯著(P＞0.05)；100%效價(jià)水平試驗(yàn)可靠性測驗(yàn)結(jié)果判定要求為：回歸F檢驗(yàn)顯著(P＜0.05)；偏離平行、試品間F檢驗(yàn)不顯著(P＞0.05)?？尚畔蘼?FL)≤25%。相對準(zhǔn)確度：相對偏差：(RB)=(效價(jià)測定值/效價(jià)理論值-1)×100%。中間精密度：幾何標(biāo)準(zhǔn)偏差(GSD)=antilog (SD),式中,SD 為每個(gè)效價(jià)水平效價(jià)測定值的對數(shù)標(biāo)準(zhǔn)偏差。GCV=(GSD-1)×100%。線性：以效價(jià)理論值的對數(shù)(橫坐標(biāo))對其相應(yīng)的效價(jià)測定值的對數(shù)(縱坐標(biāo))作圖,采用最小二乘法進(jìn)行線性回歸。并列出直線回歸方程、及相關(guān)系數(shù)。范圍：相對準(zhǔn)確度、中間精密度和線性均符合要求的效價(jià)水平范圍滿足生物活性檢定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的要求。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 不同效價(jià)水平測試結(jié)果 80%、125% 效價(jià)水平試驗(yàn)可靠性測驗(yàn)回歸F檢驗(yàn)顯著(P＜0.05),偏離平行F檢驗(yàn)不顯著(P＞0.05)；100%效價(jià)水平試驗(yàn)可靠性測驗(yàn)回歸F檢驗(yàn)顯著(P＜0.05)；偏離平行、試品間F檢驗(yàn)不顯著(P＞0.05)?？尚畔蘼剩?5%。見表2。

表2 不同效價(jià)水平測試結(jié)果(%)

3.2 相對準(zhǔn)確度驗(yàn)證結(jié)果 不同效價(jià)水平測定值的相對偏差均在±20%范圍內(nèi)。見表3。

表3 不同效價(jià)水平相對準(zhǔn)確度測試結(jié)果

3.3 中間精密度驗(yàn)證結(jié)果 80%、100%、125%效價(jià)水平測定值的GCV 均＜20%。見表4。

表4 不同效價(jià)水平中間精密度驗(yàn)證結(jié)果

3.4 線性驗(yàn)證結(jié)果 以效價(jià)理論值的對數(shù)(橫坐標(biāo))對其相應(yīng)的效價(jià)測定值的對數(shù)(縱坐標(biāo))做圖如下。采用最小二乘法進(jìn)行線性回歸,擬合的直線回歸方程為Y=1.012X+0.0169,相關(guān)系數(shù)為0.9940。見圖1。

圖1 線性曲線

3.5 范圍 實(shí)驗(yàn)中相對準(zhǔn)確度、中間精密度和線性均符合要求,效價(jià)水平范圍為理論值的80%～125%,即21.92～34.20 U/mg,滿足生物活性檢定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的要求。

3.6 6 批樣品生物效價(jià)測定結(jié)果 取6 批樣品(批號：20210524、202006009、202006010、202104001、202104002、202104003)分別同法測定,各批樣品的測定結(jié)果見表5。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明6 批樣品的可靠性測驗(yàn)回歸F檢驗(yàn)顯著(P＜0.05),偏離平行F檢驗(yàn)不顯著(P＞0.05),試品間F檢驗(yàn)不顯著(P＞0.05),可信限率均＜25%,均符合要求。見表5。

表5 6 批樣品生物效價(jià)測定結(jié)果

4 討論

選用ICR 小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn),用門冬胰島素標(biāo)準(zhǔn)品配制成80%、100%、125%的效價(jià)水平測定活性,研究發(fā)現(xiàn),動(dòng)物狀態(tài)對實(shí)驗(yàn)結(jié)果較大,組內(nèi)選擇動(dòng)物體重控制在2 g 范圍內(nèi)實(shí)驗(yàn)成功率高,本研究選用全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行血糖測定,相對于血糖儀比較,測定過程較為復(fù)雜,實(shí)驗(yàn)結(jié)果不確定性高,但準(zhǔn)確度高,本試驗(yàn)室統(tǒng)計(jì)本實(shí)驗(yàn)成功率約為60%,關(guān)注實(shí)驗(yàn)過程中給樣是否存在漏液,嚴(yán)格控制給樣時(shí)間和取血時(shí)間,保障實(shí)驗(yàn)成功率。

本實(shí)驗(yàn)采用小鼠血糖法測定門冬胰島素生物活性,對其相對準(zhǔn)確度、中間精密度、線性和范圍進(jìn)行考察,結(jié)果表明建立的方法符合指導(dǎo)原則和生物活性檢定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的要求,可作為門冬胰島素活性測定方法,表明建立的方法是可靠的。