李方迪，李由然，張梁，丁重陽，顧正華，石貴陽，徐沙*

1(江南大學(xué) 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室，江蘇 無錫，214122)2(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫，214122)

番茄紅素，一種四萜類化合物，被廣泛應(yīng)用于保健品、醫(yī)藥等行業(yè)，因其卓越的抗氧化性被熟知。臨床研究證明，番茄紅素在預(yù)防心血管疾病、前列腺癌、乳腺癌等方面都有顯著功效[1]，可以降低心肌梗塞的風(fēng)險，降低血壓，并防止低密度脂蛋白膽固醇的氧化[2]。一般來說，番茄紅素不能由人體自身合成，只能從外界獲取，因此具有極高的商業(yè)價值。過去番茄紅素的生產(chǎn)方式多為植物提取，近些年來環(huán)保高產(chǎn)的微生物發(fā)酵法逐漸成為主流。微生物發(fā)酵不僅可以解決植物種植占用大量土地的問題，還可以解決化學(xué)合成不環(huán)保的弊端，更重要的是，發(fā)酵產(chǎn)生的番茄紅素是天然產(chǎn)物，其異構(gòu)性和活性與從自然界中提取的活性成分一致[3]，因此，番茄紅素生產(chǎn)的前景廣闊。

常用于番茄紅素生產(chǎn)的細(xì)胞工廠有大腸桿菌、谷氨酸棒狀桿菌、釀酒酵母、解脂亞洛酵母等。大腸桿菌由于其生長快、培養(yǎng)條件簡單、基因操作工具成熟等優(yōu)點，是最早開發(fā)的番茄紅素生產(chǎn)底盤細(xì)胞。重組大腸桿菌通過引入番茄紅素合成途徑和發(fā)酵條件優(yōu)化，生產(chǎn)出2.7 g/L番茄紅素，是迄今為止使用基因工程大腸桿菌報告的番茄紅素產(chǎn)量最高水平[4]。然而仍然存在一些爭議，大腸桿菌在發(fā)酵過程中釋放一些內(nèi)毒素，從而引起食品安全問題，與其相對的，酵母因其較高的食品安全性脫穎而出，經(jīng)過代謝改造，番茄紅素在解脂亞洛酵母中可以積累到175 mg/g DCW[5]。LI等[6]研究表明，甲羥戊酸(mevalonate，MVA)途徑的代謝產(chǎn)物，包括番茄紅素在菌體中的積累會抑制菌體生長，脂質(zhì)體(lipid droplets，LDs)的積累可以緩解產(chǎn)物毒性，同時由于番茄紅素的結(jié)構(gòu)易溶于脂，增大LDs含量有利于提高其在胞內(nèi)的積累。三酰甘油(triacylglycerol，TAG)是在真核細(xì)胞中含量最高的儲能物質(zhì)，在脂肪酸消耗期間可保證膜脂的供給，且其毒性相對游離脂肪酸較低[7]，這給胞內(nèi)脂肪酸提供了儲存方式。增加胞內(nèi)脂質(zhì)含量有多種方法，如過表達(dá)脂肪酸(fatty acid，F(xiàn)A)及TAG合成途徑相關(guān)基因[8-9]，釀酒酵母自身存在MVA途徑、丙烷脫氫(propane dehydrogenation，PDH)途徑與TAG途徑(圖1)，分別是番茄紅素合成的前體代謝途徑、乙酰輔酶A(coenzyme A，CoA)胞內(nèi)合成途經(jīng)與三酰甘油TAG合成的途徑。TAG途徑以乙酰CoA為前體物質(zhì)，經(jīng)由限速酶Acc1羧化生成丙二酰輔酶A，進(jìn)而轉(zhuǎn)化生成脂肪酰輔酶A，進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為磷脂酸(phosphatidic acid，PA)，由關(guān)鍵酶Pap1催化生成甘油二酯(diacylglycerol，DAG)，最后由Dga1進(jìn)一步?；蒚AG。三酰甘油是釀酒酵母中LDs的主要組成成分，Ldp1會附著于脂滴表面，顯著增大脂滴的體積。乙酰輔酶A供應(yīng)和產(chǎn)物形成途徑中能量耦合和氧化還原輔因子平衡的整體分析對于高效細(xì)胞工廠的設(shè)計至關(guān)重要[10]。陳符江等[11]異源表達(dá)來自腸道沙門氏菌的胞質(zhì)乙酰輔酶A合成酶acs1，并設(shè)計L641P氨基酸取代來防止乙?；?，從而解除了Acs1受到乙酰輔酶A乙酰化賴氨酸殘基的抑制，這些修飾顯著增加了線粒體外Acs1的活性，胞內(nèi)乙酰輔酶A含量提高了2.19倍。此外，CHEN等[12]通過敲除ypl062w位點，使胞內(nèi)的乙酰輔酶A增加了1倍。TRIKKA等[13]在釀酒酵母中敲除了exg1位點，將類胡蘿卜素的產(chǎn)量提高了接近8倍。聚腺苷酸聚合酶(Pap1)催化向幾乎所有mRNA添加poly(A)尾的反應(yīng)[14]，MEINKE等證明，poly(A)尾的添加促進(jìn)了mRNA從核轉(zhuǎn)運(yùn)至胞質(zhì)的過程，結(jié)合于poly(A)尾的蛋白質(zhì)與mRNA 5′端之間的相互作用可提高翻譯效率。

注：Acs1-醋酸鹽-輔酶A連接酶1;Acc1-乙酰輔酶A羧化酶;Pah1-磷脂酸磷酸酶;Dga1-二?；视蚈-?；D(zhuǎn)移酶;Ldp1-脂質(zhì)體定位蛋白; CrtE-香葉基香葉基二磷酸合酶; CrtB-八氫番茄紅素合酶; CrtI-八氫番茄紅素去飽和酶圖1 釀酒酵母胞質(zhì)中胞質(zhì)乙酰輔酶A合成途徑、番茄紅素合成途徑及脂質(zhì)代謝途徑Fig.1 Metabolic pathway of lycopene，acetyl coenzyme A and lipids in S. cerevisiae

本文以釀酒酵母YPH499為底盤細(xì)胞，過量表達(dá)關(guān)鍵基因dga1、pah1[15]，以及與脂滴形成關(guān)聯(lián)緊密的ldp1基因[16]。TAG途徑與MVA途徑均主要發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)中，而該途徑的前體乙酰輔酶A主要存在于線粒體中，這就導(dǎo)致前體供應(yīng)成為一個亟待解決的問題。本文將來自三孢布拉霉的acs1基因敲入釀酒酵母內(nèi)，這是一個定位于胞質(zhì)內(nèi)的丙酮酸脫氫酶，研究表明敲入該基因可使胞質(zhì)乙酰CoA的含量增加50%以上[10]；同時敲除ypl062w位點，該位點的缺失可提高所有萜類的產(chǎn)量[12]。本文中涉及到多個基因過表達(dá)，在較高的轉(zhuǎn)錄需求下，強(qiáng)化pap1基因(多核苷酸腺苷酸轉(zhuǎn)移酶)表達(dá)是必要的，這一點在后續(xù)的實驗結(jié)果中也得到了證實。選取本實驗室的YthmgⅠ為出發(fā)菌株，該菌株在YPH499的基礎(chǔ)上敲除了gal80，同時過表達(dá)了thmg1基因。經(jīng)過代謝改造，番茄紅素在重組菌內(nèi)的單位產(chǎn)量顯著提高。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒和引物

本文使用的所有菌株詳見表2，質(zhì)粒見表3，引物詳見表4。

1.1.2 培養(yǎng)基

本實驗培養(yǎng)大腸桿菌所用培養(yǎng)基為LB(Luria-Bertani)培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉5，蛋白胨10，NaCl 10；培養(yǎng)釀酒酵母所用培養(yǎng)基為DYPD(g/L)：酵母粉20，蛋白胨40，葡萄糖20；誘導(dǎo)ura3抗性標(biāo)記丟失所用培養(yǎng)基為5-FOA-YNB(yeast nitrogen base)：體積分?jǐn)?shù)1%的五氟乳清酸母液，體積分?jǐn)?shù)1%的氨基酸補(bǔ)足母液，葡萄糖20 g/L，酵母氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基7 g/L；固體培養(yǎng)基另添加18 g/L瓊脂粉。

1.1.3 母液配制

五氟乳清酸溶液：取1 g五氟乳清酸固體粉末于50 mL EP管內(nèi)，加入10 mL二甲基亞砜于55 ℃隔水融化，過膜分裝，于-20 ℃避光保存；

氨基酸補(bǔ)足母液(μg/mL)：亮氨酸100，賴氨酸100，色氨酸80，尿嘧啶30，組氨酸30；

抗生素母液：氨芐青霉素、卡那霉素、硫酸諾爾斯菌素、潮霉素母液濃度分別按照100、100、100、500 mg/mL配制，添加于培養(yǎng)基時均按照0.1%的體積比。

1.1.4 酶與試劑盒

本實驗所用酶與試劑盒見表1。菌株、質(zhì)粒和引物見表2～表4。

表1 工具酶與試劑盒Table 1 Tool enzymes and kits

表2 菌株Table 2 Strains

表3 質(zhì)粒Table 3 Plasmids

1.2 實驗方法

1.2.1 重組菌表達(dá)盒的構(gòu)建

本實驗選取來自三孢布拉霉(Blakesleatrispora)的acs1L641P，來自產(chǎn)脂酵母(Rhodosporidiumtoruloides)的ldp1以及來自釀酒酵母YPH499的pah1、dga1、pap1。前二者經(jīng)密碼子優(yōu)化后送由上海生工公司合成，后者以YPH499基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

以GAL1,10pr-acs1L641P-ADH1ter表達(dá)盒構(gòu)建為例：(1)提取YPH499基因組，以其為模板PCR擴(kuò)增得到GAL1、10pr、ADH1ter以及靶點ypl062w連帶其左右同源臂；(2)通過融合延伸PCR將GAL1、10pr、acs1L641P、ADH1ter連接在一起，而后利用TA連接的方法將上述融合片段連接19T(simple)載體，菌落PCR驗證；(3)利用TA連接將靶點ypl062w連帶其左右同源臂連接載體Vector 19T(simple)，反向PCR擴(kuò)增連帶左右同源臂的載體片段；(4)挑取步驟(2)驗證正確的菌落接入液體培養(yǎng)基，于37 ℃，200 r/min過夜培養(yǎng)后提取質(zhì)粒并酶切純化得到目的片段，將該片段與步驟(3)擴(kuò)增出的載體過夜連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，菌落PCR驗證。

以同樣方法構(gòu)建其他表達(dá)盒。

1.2.2 Sg質(zhì)粒的構(gòu)建

利用網(wǎng)站E-Crisp設(shè)計sgRNA并將其設(shè)計入引物中(表4)，以實驗室保藏質(zhì)粒302、149為模板分別擴(kuò)增出啟動子與發(fā)卡結(jié)構(gòu)的對應(yīng)片段，然后重疊延伸PCR將兩片段融合，酶切后連接BTS’質(zhì)粒。

表4 引物Table 4 Primers

續(xù)表4

1.2.3 篩選及重復(fù)轉(zhuǎn)化

本研究利用的CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)是一個雙質(zhì)粒系統(tǒng)，Cas9蛋白和sgRNA分別由2個游離質(zhì)粒在釀酒酵母菌株中表達(dá)以進(jìn)行相應(yīng)基因座的敲除整合。以YthmgⅠ為底盤細(xì)胞，利用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法將Cas質(zhì)粒、sg質(zhì)粒與線性化重組片段轉(zhuǎn)入細(xì)胞，利用同源重組的機(jī)制完成整合，利用抗生素硫酸諾爾斯菌素與潮霉素進(jìn)行重組菌株篩選，將完成轉(zhuǎn)化的菌液涂布至諾爾斯-潮霉素雙抗DYPD平板上，倒置于30 ℃培養(yǎng)箱至長出轉(zhuǎn)化子，經(jīng)菌落PCR初步篩選，再通過基因組測序驗證后獲得整合表達(dá)菌株。

由于轉(zhuǎn)化完成后的質(zhì)粒依然在底盤細(xì)胞內(nèi)殘留，這會影響再次轉(zhuǎn)化，故在進(jìn)行下一步操作前丟棄原有質(zhì)粒是必要的。本研究根據(jù)ura3標(biāo)記篩選原理，將無抗培養(yǎng)傳代后的改造菌株涂布至5-FOA-YNB平板進(jìn)行篩選，倒置于30 ℃培養(yǎng)箱至長出轉(zhuǎn)化子，挑取單菌落接種于DYPD液體培養(yǎng)基搖培以待再次轉(zhuǎn)化。

1.2.4 重組菌發(fā)酵實驗

挑取轉(zhuǎn)化完成的平板上的菌落接至DYPD培養(yǎng)基中，30 ℃，200 r/min培養(yǎng)至對數(shù)生長中期，即OD值0.6～0.8，以10%的接種量接至含15 mL培養(yǎng)基的25 mL小搖瓶中，30 ℃，200 r/min搖培至96 h。定時取樣對重組菌生長趨勢及合成番茄紅素水平進(jìn)行測定。

1.2.5 生長趨勢測定及番茄紅素提取

取1.5 mL菌液備用。其中1 mL菌液離心棄上清液，ddH2O洗滌2次后烘至恒重，稱量計算干重。另0.5 mL菌液同樣離心洗滌，添加菌體等體積的玻璃珠與1 mL三氯甲烷；振蕩破碎3 min，冰浴1 min，重復(fù)2～3次，4 ℃低溫離心后錫紙包裹，于4 ℃冰箱內(nèi)靜置過夜萃取。隔天吸取萃取液至新EP管中，氮?dú)獯蹈?，精確添加1 mL正己烷復(fù)溶，用酶標(biāo)儀測定番茄紅素產(chǎn)量。

1.2.6 番茄紅素測定

本研究使用酶標(biāo)儀進(jìn)行番茄紅素測定，測定波長為472 nm，每個樣品取4個平行。番茄紅素標(biāo)品用于定量分析，精確稱取1.5 mg番茄紅素標(biāo)品用正己烷定量于15 mL棕色容量瓶，充分溶解，加入體積分?jǐn)?shù)1%的2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚(butylated hydroxytoluene，BHT)作為抗氧化劑，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。預(yù)實驗結(jié)果證明番茄紅素樣品在0～20 mg/L線性最好，故選取該范圍制作標(biāo)準(zhǔn)曲線及樣品測定。

1.2.7 胞外代謝物的檢測

發(fā)酵液中葡萄糖、乙醇的濃度利用高效液相色譜進(jìn)行測定。以Bio-RadHPX-87H為色譜柱，5%的稀硫酸作為流動相，流速為0.8 mL/min，柱溫50 ℃，示差檢測器。

1.2.8 熒光顯微鏡檢

番茄紅素主要積累于釀酒酵母胞內(nèi)的脂閥上，會于熒光顯微鏡綠色激發(fā)光下發(fā)出熒光。將轉(zhuǎn)化番茄紅素表達(dá)盒的重組菌株涂布諾爾斯-潮霉素雙抗平板，30 ℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)4 d后挑取紅色單菌落制片，置熒光顯微鏡100×物鏡下，分別于明場下與綠色激發(fā)光下觀察其圖像。

2 結(jié)果與分析

2.1 代謝改造表達(dá)盒的構(gòu)建

構(gòu)建脂質(zhì)途徑改造表達(dá)盒如圖2-a所示，前體及轉(zhuǎn)錄途徑相關(guān)表達(dá)盒如圖2-b所示。本研究以YthmgⅠ[17]為出發(fā)菌株，對gal10位點敲入ldp1同時敲除gal10，得到重組菌株LFD5，單獨(dú)敲除gal10得到LFD6；在gal7位點敲入pap1同時敲除gal7，得到LFD7，單敲除gal7得到LFD8；在exg1位點敲入GAL1，10pr-pah1-ADH1ter同時敲除exg1，得到LFD9；敲入ADH1ter-dga1-GAL1，10pr-pah1-ADH1ter同時敲除exg1，得到LFD10；單敲除exg1得到LFD11；在gal1位點敲入acc1同時敲除gal1，得到LFD13；單敲除gal1得到LFD14。

a-GAL啟動子控制TAG途徑關(guān)鍵基因的表達(dá)；b-GAL啟動子控制關(guān)鍵基因pap1和acs1L641P的表達(dá)圖2 代謝改造途徑表達(dá)盒Fig.2 Metabolic engineering pathway expression box

以LFD10為出發(fā)菌株，對gal10位點敲入ldp1同時敲除gal10，得到重組菌株LFD12。以LFD12為出發(fā)菌株，在ypl062w位點敲入GAL1，10pr-acs1L641P-ADH1ter同時敲除ypl062w，得到重組菌LFD15，單敲除ypl062w得到LFD16；分別以LFD12、LFD15為出發(fā)菌株，于gal7位點敲入pap1同時敲除gal7，得到重組菌LFD17、LFD18。

2.2 釀酒酵母脂質(zhì)體合成途徑的改造

將脂質(zhì)途徑改造重組菌LFD5、LFD6、LFD9、LFD10、LFD11、LFD12、LFD13、LFD14，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，取發(fā)酵96 h時的樣品進(jìn)行分析測定，結(jié)果如圖3所示。

圖3 重組菌搖瓶發(fā)酵的番茄紅素產(chǎn)量Fig.3 Lycopene production in shake flask fermentation of recombinant strains注：LFD5：as YthmgⅠ；Δgal10∷ldp1；LFD6：as YthmgⅠ；Δgal10∷non-marker；LFD9：as YthmgⅠ；Δexg1∷GAL1, 10pr-pah1-ADH1ter；LFD10：as YthmgⅠ；Δexg1∷GAL1,10pr-pah1,dga1-ADH1ter；LFD11：as YthmgⅠ；Δexg1∷non-marker；LFD12：as YthmgⅠ；Δgal10∷ldp1；Δexg1∷GAL1, 10pr-pah1, dga1-ADH1ter；LFD13：as YthmgⅠ；Δgal1∷acc1；LFD14：as YthmgⅠ；Δgal1∷non-marker

就過表達(dá)單個基因而言，LFD5的產(chǎn)量最高，但仍不及出發(fā)菌株。雖然各基因單一表達(dá)時對番茄紅素產(chǎn)量提升的效果并不顯著，但組合表達(dá)后，重組菌LFD12(過表達(dá)dga1、pah1、ldp1)的產(chǎn)量大大提高，為45.76 mg/g DCW，是YthmgⅠ的1.5倍。選取產(chǎn)量較高的重組菌，利用熒光顯微鏡對細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行觀察，結(jié)果如圖4所示。菌體熒光亮度與番茄紅素單位細(xì)胞產(chǎn)量呈正相關(guān)，胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)較為明亮的綠色小點。

圖4 熒光顯微鏡觀察重組菌于綠色激發(fā)光下(a)與明場下(b)的圖像Fig.4 Fluorescence microscopy images of recombinant strains under green excitation light (a) and bright field (b)

2.3 胞內(nèi)乙酰輔酶A合成酶及轉(zhuǎn)錄翻譯相關(guān)基因的過表達(dá)

對重組菌LFD12(基于YthmgⅠ組合過表達(dá)脂質(zhì)相關(guān)基因)、LFD15(基于LFD12過表達(dá)乙酰CoA合成基因)、LFD18(基于LFD15加強(qiáng)轉(zhuǎn)錄翻譯基因)敲入番茄紅素表達(dá)盒后進(jìn)行發(fā)酵，結(jié)果如圖5所示?？梢钥闯鯨FD18的產(chǎn)量最高，單位產(chǎn)量109.26 mg/g DCW，是出發(fā)菌株YthmgⅠ的3.36倍。

圖5 重組菌搖瓶發(fā)酵的番茄紅素產(chǎn)量Fig.5 Lycopene production in shake flask fermentation of recombinant strains注：LFD12：as YthmgⅠ；Δgal10∷ldp1；Δexg1∷GAL1, 10pr-pah1, dga1-ADH1ter；LFD15：as LFD12；Δypl062w∷GAL1, 10pr-acs1L641P-ADH1ter；LFD18：as LFD15；Δgal7∷pap1

分別對LFD12、LFD15、LFD18進(jìn)行熒光鏡檢，結(jié)果如圖6所示，LFD18的熒光最為明亮，這與番茄紅素產(chǎn)量相符。

圖6 熒光顯微鏡觀察重組菌于綠色激發(fā)光下(a)與明場下(b)的圖像Fig.6 Fluorescence microscopy images of recombinant strains under green excitation light (a) and bright field (b)

為了進(jìn)一步探究過表達(dá)pap1的效果，分別對YthmgⅠ、LFD7(基于YthmgⅠ過表達(dá)pap1)、LFD18(基于LFD15過表達(dá)pap1)敲入番茄紅素表達(dá)盒后進(jìn)行搖瓶發(fā)酵實驗，定期取樣至96 h進(jìn)行分析測定，繪制曲線圖，結(jié)果如圖7所示?？煽闯觯ㄟ^代謝改造敲入的基因越多，過表達(dá)pap1對產(chǎn)量的提升越為顯著。

a-番茄紅素產(chǎn)量；b-菌株生長曲線圖7 使用不同出發(fā)菌株過表達(dá)pap1的效果Fig.7 Typical profiles observed for lycopene production and cell growth注：LFD7: as YthmgⅠ; Δgal7∷pap1; LFD18: as YthmgⅠ; Δexg1∷GAL1,10pr-dga1, pah1-ADH1ter; Δgal10∷ldp1; Δypl062w∷GAL10pr-acs1L641P-ADH1ter; Δgal7∷pap1

2.4 發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)

本研究使用上海迪必爾5 L發(fā)酵罐，發(fā)酵菌株為LFD18，發(fā)酵條件為：溫度30 ℃，轉(zhuǎn)速500 r/min；使用的培養(yǎng)基為DYPD，從發(fā)酵45 h開始以20 g/h的速度恒速流加補(bǔ)充葡萄糖；發(fā)酵時長為96 h。對番茄紅素產(chǎn)量、菌體生長情況以及胞外代謝產(chǎn)物進(jìn)行測定，結(jié)果如圖8所示。

a-LFD18在發(fā)酵罐中補(bǔ)料發(fā)酵96h；b-LFD18的生長曲線和番茄紅素產(chǎn)量；c-LFD18發(fā)酵液中葡萄糖、乙醇、乙酸酯和甘油的濃度圖8 葡萄糖補(bǔ)料發(fā)酵LFD18的番茄紅素產(chǎn)量、菌體量及副產(chǎn)物測定Fig.8 Determination of lycopene yield, biomass and by-products of LFD18 during glucose fed-batch fermentation

番茄紅素產(chǎn)量最終達(dá)到191.77 mg/L，單位產(chǎn)量為30.44 mg/g DCW。葡萄糖在0～23 h被快速耗盡，同時產(chǎn)生一定量乙醇；葡萄糖耗盡后，乙醇作為碳源被消耗，菌體生長減緩，番茄紅素快速積累，同時生成乙酸。自45 h恒速流加葡萄糖后，乙醇重新開始積累，菌體繼續(xù)緩慢生長，至60 h后達(dá)到穩(wěn)定。發(fā)酵總過程隨著菌體生長出現(xiàn)一定的甘油積累，累積速度與菌體生長呈現(xiàn)不完全的正相關(guān)，且在發(fā)酵過程中幾乎不被消耗。

3 結(jié)論與討論

TAG途徑與MVA途徑共用乙酰CoA作為前體，而2個途徑的產(chǎn)物積累時間不盡相同：本實驗構(gòu)建的番茄紅素表達(dá)盒由GAL啟動子啟動，其產(chǎn)物積累會發(fā)生在葡萄糖濃度降低時；而菌體中脂質(zhì)積累在氮源耗盡且碳源充足時較為顯著[18]，可以實現(xiàn)2條代謝途徑的有序分流，亦可避免短時間內(nèi)代謝通量過大耗盡乙酰CoA庫，有利于維持菌體內(nèi)部代謝的動態(tài)平衡。本實驗利用GAL啟動子組合過表達(dá)脂質(zhì)途徑相關(guān)基因后，番茄紅素產(chǎn)量提升至45.76 mg/g DCW，是原菌株產(chǎn)量的1.7倍，說明提高菌體內(nèi)脂質(zhì)含量有利于番茄紅素積累。觀察顯微鏡像可見，菌體熒光強(qiáng)度與脂質(zhì)改造過表達(dá)基因數(shù)目正相關(guān)。

MA等[15]在釀酒酵母中同時過表達(dá)TAG途徑的關(guān)鍵基因pah1、dga1、acc1后胞內(nèi)TAG含量增加了59%，番茄紅素產(chǎn)量提升了110%；此外還敲除了fld1，該策略顯著增加了番茄紅素積累，但是縮短了釀酒酵母的壽命。ZHU等[16]研究表明，ldp1在釀酒酵母中過量表達(dá)時，Ldp1定位于脂滴表面促進(jìn)了巨大脂滴形成，這表明Ldp1在酵母脂滴動力學(xué)方面有著重要作用。SHI等[19]通過在釀酒酵母中過表達(dá)來自腸道沙門氏菌的乙醛脫氫酶基因ald6、乙酰輔酶A合成酶基因acs以及乙醇脫氫酶基因adh211，顯著增加了代謝通量，番茄紅素產(chǎn)量相較改造前提高了12%。SHIBA等[20]組合表達(dá)來自三孢布拉霉的ald6和acs1L641P將乙酸合成乙酰輔酶A的轉(zhuǎn)化率提高了3倍，使得紫穗槐二烯的產(chǎn)量提高了4倍。本實驗在脂滴改造的基礎(chǔ)上進(jìn)一步加強(qiáng)乙酰CoA的表達(dá)，番茄紅素產(chǎn)量相較過表達(dá)acs1L641P前并無提高，而在脂質(zhì)改造及乙酰CoA改造的基礎(chǔ)上進(jìn)一步強(qiáng)化轉(zhuǎn)錄相關(guān)基因pap1后番茄紅素產(chǎn)量提高了2.6倍，單位產(chǎn)量達(dá)到109.26 mg/g DCW，鏡檢可見菌體熒光明顯增強(qiáng)，說明基因過表達(dá)應(yīng)輔以轉(zhuǎn)錄強(qiáng)化，保證對應(yīng)基因的高效表達(dá)。

SHI等[19]使用7 L發(fā)酵罐，分別使用葡萄糖與乙醇作為碳源，通過兩階段補(bǔ)料方法對代謝改造釀酒酵母進(jìn)行發(fā)酵，番茄紅素總產(chǎn)量達(dá)到3.28 g/L，相較搖瓶發(fā)酵產(chǎn)量310 mg/L提高了11倍。本實驗結(jié)合脂質(zhì)工程與代謝工程，構(gòu)建了番茄紅素高產(chǎn)釀酒酵母菌株，搖瓶發(fā)酵產(chǎn)量為360.66 mg/L；通過發(fā)酵罐恒速流加葡萄糖培養(yǎng)96 h，產(chǎn)量為191.77 mg/L，相較搖瓶反而有所降低。菌體在發(fā)酵后期退化較為嚴(yán)重，猜測一是由于發(fā)酵后期葡萄糖流加速度過大導(dǎo)致乙醇大量積累，抑制了菌體生長；二是YPH499菌株本身較容易退化，不適宜大體系發(fā)酵培養(yǎng)。后續(xù)可以再實行發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化、分批補(bǔ)料優(yōu)化等策略，進(jìn)一步提高重組菌的番茄紅素產(chǎn)量。