宋銳恒 沈建宇 韓偉凱 李貴寶 侯海光 岳慶偉 孫晉浩

(山東大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖與神經(jīng)生物學(xué)系，濟(jì)南 250012)

甲基苯丙胺(methamphetamine，METH)是一種精神活性藥，濫用后會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)損傷和精神障礙。該藥具有強(qiáng)烈的成癮性。中縫背核(dorsal raphe nucleus,DRN)是中腦導(dǎo)水管腹側(cè)的神經(jīng)核，可調(diào)控情緒和認(rèn)知功能。在獎(jiǎng)勵(lì)性飲酒行為中，MRI顯示小鼠的DRN腦區(qū)激活[1]。內(nèi)源性阿片受體通過(guò)DRN到伏隔核的神經(jīng)通路調(diào)控小鼠的獎(jiǎng)賞行為[2]。激活大鼠DRN中促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子受體1(CRF-R1)明顯降低了嗎啡誘導(dǎo)的條件性位置偏愛(ài)(conditioned place preference,CPP)評(píng)分[3]。這些研究說(shuō)明DRN與藥物成癮相關(guān)，但DRN在METH成癮中的作用和機(jī)制還不清楚。

本實(shí)驗(yàn)建立小鼠CPP動(dòng)物模型，然后分析了METH誘導(dǎo)DRN神經(jīng)元c-Fos表達(dá)情況，并通過(guò)化學(xué)遺傳學(xué)抑制DRN神經(jīng)元活性，檢測(cè)對(duì)METH誘導(dǎo)CPP行為偏好的影響。最后，進(jìn)行蛋白質(zhì)譜分析，尋找差異表達(dá)的蛋白分子。本實(shí)驗(yàn)有助于揭示METH成癮機(jī)制并發(fā)現(xiàn)針對(duì)性的干預(yù)靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

選用6～8 周齡C57BL/6J雄性小鼠，體重 20～25g，購(gòu)于山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)符合山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)要求。腺病毒AAV2/9-hSyn-hM4D(Gi)-mCherry和AAV2/9-hSyn-mCherry購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因科技有限公司。兔抗小鼠C-Fos單克隆抗體購(gòu)自Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1CPP行為檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均進(jìn)行基線測(cè)試(pre-test)，METH模型組分別在第1、3、5天給予METH腹腔注射(2mg/kg),對(duì)照組注射等量生理鹽水。兩組動(dòng)物均在白箱中訓(xùn)練，時(shí)長(zhǎng)40min。在2、4、6d兩組動(dòng)物均給予生理鹽水腹腔注射，在黑箱中訓(xùn)練。第7天自由探索15min，進(jìn)行測(cè)試(test)。

1.2.2腦內(nèi)定位注射 采用5%水合氯醛腹腔注射(0.75ml/100g)，麻醉小鼠。將含鈣指示劑的病毒AAV2/9-CMV-GCaMP6s-P2A-nls-dTomato注射至DRN腦區(qū)，坐標(biāo)為前囟前AP:-4.5mm，旁開(kāi)L:0mm，硬膜下D:3.1mm，注射300nL，3w后取腦切片檢測(cè)Ca2+信號(hào)變化。在化學(xué)遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)中，將AAV2/9-hSyn-hM4D(Gi)-mCherry和AAV2/9-hSyn-mCherry分別注射到METH模型組和對(duì)照組小鼠DRN腦區(qū)，待3w后病毒充分表達(dá)，CPP測(cè)試前30min 腹腔注射疊氮平-N-氧化物(clozapine-N-oxide,CNO)，劑量為3mg/kg。

1.2.3免疫組織化學(xué)染色 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物灌注取腦，固定6h后，置入30%蔗糖溶液內(nèi)，4℃靜置至沉入容器底部，切取含DRN腦區(qū)的組織塊，行冰凍切片，厚度30μm。經(jīng)5%二抗同源血清封閉1h后，給予兔抗小鼠c-Fos(1∶1000)孵育，4℃過(guò)夜。然后經(jīng)羊抗兔二抗(1∶500)室溫孵育2h，在熒光顯微鏡下觀察分析。

1.2.4蛋白提取及分析 提取DRN腦區(qū)蛋白，以Bradford法測(cè)量蛋白濃度，-20℃儲(chǔ)存。對(duì)蛋白進(jìn)行還原和烷基化后，使用100mM Tris-HCl,(pH 8.5)稀釋3倍，在1mM CaCl2的條件下用胰蛋白酶消化(酶與底物的比例為1∶50)，持續(xù)處理16h(37℃)。經(jīng)純化、洗脫、干燥后，重新溶解于0.1%甲酸，行LC/MS-MS 分析。

1.2.5實(shí)時(shí)熒光定量PCR 提取DRN區(qū)域組織的總RNA。通過(guò) NanoDrop檢測(cè)RNA 純度。設(shè)計(jì)靶分子引物，在以下條件下進(jìn)行PCR擴(kuò)增：95℃ 3min，95℃ 5s和60℃ 30s，重復(fù)40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參。引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 小鼠CPP模型的建立

采用METH腹腔注射建立小鼠CPP模型，評(píng)估METH引起的成癮記憶(圖1a)。METH模型組小鼠在伴藥箱中的運(yùn)動(dòng)軌跡較訓(xùn)練前密集，停留時(shí)間明顯增加，較前產(chǎn)生了明顯的CPP偏好(t=4.438,P<0.05)，而對(duì)照組小鼠測(cè)試時(shí)CPP 分?jǐn)?shù)與基線水平無(wú)明顯差異(P>0.05)(圖1b,c)。這表明成功建立了METH誘導(dǎo)的CPP動(dòng)物模型。

注：a.METH誘導(dǎo)CPP模型建立示意圖；b.對(duì)照組小鼠基線和測(cè)試的CPP評(píng)分；c.METH模型鼠基線和測(cè)試的CPP評(píng)分，測(cè)試時(shí)形成明顯的CPP偏好(t=4.438,P<0.05)。對(duì)照組n=4，METH模型組n=5。

2.2 METH誘導(dǎo)DRN神經(jīng)元c-Fos表達(dá)

METH模型小鼠DRN內(nèi)大量神經(jīng)元呈c-Fos陽(yáng)性著色，這些c-Fos陽(yáng)性細(xì)胞多沿DRN中線分布；對(duì)照組DRN內(nèi)僅有少量散在的c-Fos陽(yáng)性細(xì)胞 (圖2a)。METH處理后c-Fos陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組明顯增多(圖2b,t=4.065,P<0.05)，而且c-Fos陽(yáng)性細(xì)胞比例也明顯高于對(duì)照組(圖2b,t=4.529,P<0.05)。

注：a.METH誘導(dǎo)DRN c-Fos 表達(dá)，對(duì)照組僅有少量陽(yáng)性細(xì)胞分布；b.c-Fos陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和陽(yáng)性細(xì)胞比例統(tǒng)計(jì)分析。對(duì)照組n=4，METH模型組n=5;標(biāo)尺：50μm。

2.3 METH升高DRN神經(jīng)元胞內(nèi)鈣離子水平

將含Ca2+指示劑的病毒載體實(shí)施腦內(nèi)注射，神經(jīng)元轉(zhuǎn)染后顯示紅色熒光，鈣離子活動(dòng)顯示為綠色熒光(圖3 a)。對(duì)照組DRN神經(jīng)元Ca2+信號(hào)熒光強(qiáng)度26.93±0.64，METH處理后Ca2+信號(hào)熒光強(qiáng)度為50.43±1.02，明顯高于對(duì)照組(t=20.50,P<0.001)。見(jiàn)圖3b、c。

注：a.示意圖顯示鈣離子與GCaMP6結(jié)合后，分子構(gòu)象改變導(dǎo)致了515nm波段發(fā)射熒光增加;b.為鈣離子熒光強(qiáng)度統(tǒng)計(jì)分析;c.分別為對(duì)照組，METH組DRN神經(jīng)元鈣離子熒光檢測(cè)圖片。對(duì)照組n=3，METH模型組n=3;標(biāo)尺：50μm。

2.4 抑制DRN神經(jīng)元活性降低CPP評(píng)分

本實(shí)驗(yàn)采用化學(xué)遺傳學(xué)的方式抑制DRN腦區(qū)神經(jīng)元(圖4 a)。在METH模型鼠測(cè)試前30min腹腔注射CNO，激活hM4Di抑制DRN神經(jīng)元活性，結(jié)果顯示，抑制后模型鼠的CPP 分?jǐn)?shù)明顯降低(t=3.26,P<0.05)。而對(duì)照組，在CNO誘導(dǎo)后，仍表現(xiàn)出CPP行為偏好(t=4.407,P<0.05)。顯示抑制DRN可以降低METH誘導(dǎo)的CPP偏好。

注：a.化學(xué)遺傳學(xué)病毒載體元件構(gòu)成;b.腦區(qū)注射示意圖;c.CPP行為分析，抑制DRN腦區(qū)后，明顯降低了CPP分?jǐn)?shù)(P<0.05)。對(duì)照組n=5，METH模型組n=6;ns：表示比較的兩組數(shù)據(jù)沒(méi)有差異。

2.5 蛋白質(zhì)譜分析

本實(shí)驗(yàn)采用LC/MS-MS對(duì)DRN腦區(qū)組織進(jìn)行了蛋白組學(xué)的分析。共獲得了583個(gè)蛋白分子，其中13個(gè)表達(dá)上調(diào)，17個(gè)表達(dá)下調(diào)(設(shè)定差異倍數(shù)≥1.5倍及P<0.05)(表2，表3)。篩選了部分和神經(jīng)及突觸相關(guān)的蛋白分子進(jìn)行表達(dá)驗(yàn)證，其中突觸囊泡蛋白1(Syt1)和細(xì)胞黏附分子1(Cadm1)表達(dá)升高(均P<0.05)；神經(jīng)束蛋白(Nfasc)和突觸小泡蛋白2(SV2)的C亞型Sv2c表達(dá)降低(均P<0.05)。其中，Syt1的上調(diào)較為明顯，上調(diào)近4倍(圖5)。

表2 表達(dá)上調(diào)分子

表3 表達(dá)下調(diào)分子

注：通過(guò)熒光定量PCR檢測(cè)篩選分子的mRNA表達(dá)變化。a.檢測(cè)Cadm1、ATP1B2、Stx1a的表達(dá);b.檢測(cè)Nfasc、Sv2c、Syt1的表達(dá)。對(duì)照組n=3，METH模型組n=3。

3 討論

3.1 METH明顯激活了DRN神經(jīng)元

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，給予METH處理后，小鼠DRN內(nèi)c-Fos陽(yáng)性細(xì)胞明顯多于對(duì)照組，同時(shí)DRN內(nèi)鈣離子信號(hào)強(qiáng)度增加，說(shuō)明METH激活了DRN神經(jīng)元。c-Fos作為即早基因，是Fos轉(zhuǎn)錄因子家族的成員之一，多數(shù)成癮性藥物如可卡因、嗎啡、苯丙胺等可快速誘導(dǎo)c-Fos表達(dá)，活化神經(jīng)元[4]。Ca2+是通用的第二信使，參與神經(jīng)元去極化信號(hào)的傳遞并有助于突觸活動(dòng)的發(fā)生，所以對(duì)于神經(jīng)元的活化至關(guān)重要。在嗎啡成癮中，通過(guò)在體多通道的電生理記錄發(fā)現(xiàn)，DRN 5-HT神經(jīng)元在嗎啡作用下被激活[5]。并且，在嗎啡誘導(dǎo)的CPP測(cè)試時(shí)，DRN內(nèi)神經(jīng)元活化明顯。本項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中，METH明顯激活DRN神經(jīng)元，提示這個(gè)腦區(qū)可能和METH導(dǎo)致的成癮行為變化有關(guān)。

3.2 抑制DRN后顯著降低CPP評(píng)分

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)化學(xué)遺傳學(xué)手段抑制DRN腦區(qū)，顯著降低了METH誘導(dǎo)的CPP評(píng)分。DRN內(nèi)含有多種神經(jīng)元，其中5-羥色胺(5-hydroxy tryptamine,5-HT)能神經(jīng)元最多，占DRN神經(jīng)元總量的2/3。5-HT 神經(jīng)元投射廣泛，也接受多個(gè)腦區(qū)的投射[6]。DRN 5-HT 神經(jīng)元從與獎(jiǎng)賞信號(hào)密切相關(guān)的前腦和邊緣系統(tǒng)接收廣泛而密集的投射[7]。5-HT能神經(jīng)元可控制情緒，學(xué)習(xí)和認(rèn)知功能，感覺(jué)和運(yùn)動(dòng)的控制等[8]。最近研究發(fā)現(xiàn)，DRN的5-HT神經(jīng)元編碼獎(jiǎng)賞信號(hào)[9]。我們推測(cè)，抑制DRN腦區(qū)導(dǎo)致CPP的逆轉(zhuǎn)，很可能與DRN腦區(qū)的5-HT神經(jīng)元有關(guān)。

3.3 DRN腦區(qū)蛋白組學(xué)分析

本實(shí)驗(yàn)對(duì)METH模型鼠的DRN組織進(jìn)行了蛋白質(zhì)組學(xué)分析，獲得了一批差異變化的蛋白分子，其中和突觸相關(guān)的分子變化顯著，如Syt1表達(dá)明顯上調(diào)，Nfasc，Sv2c表達(dá)下調(diào)。Syt1屬于突觸蛋白突觸蛋白家族，在突觸傳遞和可塑性的幾個(gè)階段起著關(guān)鍵作用。SYT1可以在參與突觸的常規(guī)功能之前調(diào)節(jié)軸突絲狀偽足和分支的形成[10]。突觸囊泡2C(SV2C)屬于突觸囊泡2(SV2)蛋白超家族的一種新的異構(gòu)體，是已知的肉毒桿菌神經(jīng)毒素/A(BoNT/A)的受體，調(diào)節(jié)多巴胺釋放，從而成為治療精神疾病的潛在目標(biāo)分子[11]。這說(shuō)明篩選的分子在調(diào)控突觸可塑性以及神經(jīng)遞質(zhì)的釋放與轉(zhuǎn)運(yùn)方面發(fā)揮了重要的作用。我們推測(cè)在METH成癮中，這些分子在DRN腦區(qū)的差異表達(dá)可能執(zhí)行著重要的功能。

綜上，METH激活了DRN腦區(qū)神經(jīng)元。DRN在METH成癮中起著重要作用，METH可通過(guò)改變DRN內(nèi)一些與突觸相關(guān)的蛋白分子的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控成癮行為的變化。

利益沖突：所有作者均申明不存在利益沖突。