任艷茹 檀子嶠 姚孟薇 楊欣欣 徐 靜 李曉瑜△

(1濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院，濟(jì)寧 272013;2濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，濟(jì)寧 272029)

下咽鱗狀細(xì)胞癌(Hypopharyngeal squamous cell carcinoma，HSCC)占所有頭頸部惡性腫瘤的3%左右，是頭頸部惡性程度最高、預(yù)后最差的腫瘤之一，據(jù)相關(guān)研究報(bào)道下咽癌患者的5年總生存率僅為30%～35%[1]。近50%的患者在診斷后一年內(nèi)復(fù)發(fā)，且多發(fā)展為遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[2]。因此，進(jìn)一步了解HSCC的致癌機(jī)制及有效靶點(diǎn)對(duì)盡早干預(yù)、防止復(fù)發(fā)、提高預(yù)后具有十分重要的意義。

腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(Brain-derived neurotrophic factor，BDNF)，最早由德國(guó)學(xué)者在豬腦提取液中發(fā)現(xiàn)的一種堿性蛋白[3]。它通過(guò)其與細(xì)胞表面受體發(fā)生配體-受體反應(yīng)激活各種關(guān)鍵信號(hào)通路[4]。BDNF作為目前腫瘤領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)，過(guò)往文獻(xiàn)證明BDNF在喉癌[5]、甲狀腺癌[6]等頭頸部腫瘤中高表達(dá)，其高表達(dá)可以促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移、上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和化療耐藥性[7-8]。目前BDNF在HSCC癌組織中的表達(dá)情況及其對(duì)HSCC侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響卻尚未報(bào)道。本文旨在探討B(tài)DNF在HSCC中的表達(dá)及其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2013年4月至2016年12月我院耳鼻喉科手術(shù)中用于病理檢查留取的33例HSCC癌組織、22例HSCC癌旁組織以及12例行懸雍垂-腭-咽成形術(shù)(UPPP)的正常咽部黏膜組織石蠟包埋組織切片標(biāo)本。納入標(biāo)準(zhǔn)：1)符合HSCC臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)病理檢查證實(shí)；2)臨床資料完整；3)排除由其他腫瘤侵犯或轉(zhuǎn)移；4)患者及家屬均知情并簽署知情同意書。本研究已通過(guò)濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 細(xì)胞株與試劑

細(xì)胞株:人下咽鱗狀細(xì)胞癌FaDu細(xì)胞，購(gòu)自iCell Bioscience Inc。

MEM培養(yǎng)基、胎牛血清、青鏈霉素雙抗混合液(Gibco)；胰蛋白酶消化液(BIOTOP)；凍存液(美倫公司)；4%多聚甲醛(索萊寶公司)；結(jié)晶紫染色液(5×結(jié)晶紫染色儲(chǔ)液+稀釋液)(凱基生物公司)；Matrigal基質(zhì)膠(Corning)；磷酸鹽緩沖液(福州邁新公司)；EDTA抗原修復(fù)液pH 9.0；內(nèi)源性過(guò)氧化物酶阻斷劑(北京中杉金橋公司)；兔抗人 BDNF 多克隆抗體(Affinity公司)；兔抗人TrkB多克隆抗體(Proteintech Group)；抗體稀釋液(Proteintech Group)；增強(qiáng)酶標(biāo)山羊抗小鼠/兔IgG聚合物通用型二抗，DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋公司)。蘇木素-伊紅染色液、二甲苯、75%、95%、無(wú)水乙醇、中性樹膠封片劑等均由我院病理科實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 二步法免疫組織化學(xué)染色

通過(guò)免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)33例HSCC癌組織、22例HSCC癌旁組織及12例正常咽部黏膜組織中BDNF表達(dá)量。按照試劑說(shuō)明書步驟進(jìn)行通用二步法免疫組織化學(xué)染色，脫蠟、水化、抗原修復(fù)、阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶、孵育一抗、次日取出組織切片，PBS洗片2min×3次、滴加適量反映增強(qiáng)劑、滴加即用型二抗增強(qiáng)酶標(biāo)羊抗小鼠/兔IgG聚合物、DAB顯色、蘇木素染色、將染色后的石蠟切片放置于上行梯度濃度的酒精中脫水、透明、封片，儲(chǔ)存。

免疫組化結(jié)果判讀：由兩名病理科專業(yè)醫(yī)師在光學(xué)顯微鏡下采取雙盲法判定。觀察細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，在組織中陽(yáng)性表達(dá)時(shí)染色為棕黃色或褐色顆粒，調(diào)節(jié)至400×鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)視野計(jì)數(shù)細(xì)胞并根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞所占比例(0分：<5%；1分：5～25%；2分：26%～50%；3分：>51%)及染色強(qiáng)度(0分：無(wú)色；1分：淺黃色；2分：棕黃色；3分：棕褐色)進(jìn)行評(píng)分。以上兩項(xiàng)積分相加≥3分時(shí)判定結(jié)果為陽(yáng)性。

1.4 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)

對(duì)照組：不含BDNF的MEM完全培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的FaDu細(xì)胞；實(shí)驗(yàn)組：在含400ng/ml BDNF刺激因子的MEM完全培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的FaDu細(xì)胞，每組均設(shè)置3個(gè)副孔。

將Matrigal基質(zhì)膠提前一天從-20℃冰箱轉(zhuǎn)移至4℃冰箱，使其由固態(tài)變?yōu)橐簯B(tài)，用MEM無(wú)血清培養(yǎng)基按1∶2稀釋Matrigal基質(zhì)膠，用預(yù)冷槍頭吸取50μl稀釋好的Matrigal加入Transwell上室，37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)過(guò)夜孵育基質(zhì)膠，吸出上層液態(tài)的不凝膠，使薄層Matrigal基質(zhì)膠沉積底部。取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的各組FaDu細(xì)胞，更換為MEM無(wú)血清培養(yǎng)基饑餓過(guò)夜，常規(guī)消化、離心，用MEM無(wú)血清培養(yǎng)基重懸至單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)后調(diào)整FaDu細(xì)胞濃度至1×106個(gè)/ml。于Transwell下室中加入30% MEM完全培養(yǎng)基600μl，向Transwell上室每孔滴注100μl各組細(xì)胞懸液(1×105個(gè)/孔)。放置于37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)過(guò)夜培養(yǎng)，取出24孔板，棄去上室培養(yǎng)基，吸除剩余培養(yǎng)基及基質(zhì)膠，將小室浸于500μl 4%多聚甲醛小孔，室溫下固定30min后，蒸餾水清洗3次，再浸入500μl預(yù)先配制的結(jié)晶紫溶液中，室溫下染色30min后，蒸餾水清洗3次，用棉簽輕輕拭去上室未穿膜FaDu細(xì)胞。將小室放置于倒置顯微鏡下觀察，400×視野下隨機(jī)選取5個(gè)視野計(jì)數(shù)，結(jié)果取平均值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，通過(guò)Fisher精確概率法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用GraphPad Prism 5軟件對(duì)Transwell侵襲試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以P<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BDNF在HSCC癌組織、癌旁組織及正常咽部黏膜組織中的表達(dá)情況

光學(xué)顯微鏡下顯示BDNF在組織中主要表達(dá)在細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，在組織中BDNF陽(yáng)性表達(dá)時(shí)染色為棕黃色或褐色顆粒(圖1示)。

注：A為正常咽部黏膜組織切片；B為下咽癌癌組織切片；C為下咽癌癌旁組織切片。

2.2 BDNF在HSCC癌組織、癌旁組織及正常咽部黏膜組織中的表達(dá)

正常咽部黏膜組織中BDNF表達(dá)的陽(yáng)性率為0(0/12)；22例HSCC患者癌旁組織有7例可見BDNF陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性率為31.8%(7/22)；HSCC患者的癌組織中28例可見BDNF陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性率為84.8%(28/33)。BDNF蛋白在HSCC癌組織中的表達(dá)顯著高于癌旁組織及正常咽部黏膜組織，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.0125)；且在HSCC癌旁組織中的BDNF蛋白陽(yáng)性表達(dá)明顯高于正常咽部黏膜組織，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.0125)。

表1 BDNF在下咽癌組織及癌旁組織、正常咽部黏膜組織中的表達(dá)差異

2.3 BDNF表達(dá)與下咽癌臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系

下咽癌組織標(biāo)本中BDNF蛋白的表達(dá)與腫瘤直徑、分化程度、是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期相關(guān)(P<0.05)，與性別、年齡及浸潤(rùn)深度無(wú)關(guān)(P>0.05)。見表2。

表2 下咽癌組織中BDNF的表達(dá)與臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系

2.4 BDNF對(duì)FaDu細(xì)胞的侵襲能力的影響

外源性BDNF明顯增強(qiáng)FaDu細(xì)胞的侵襲能力，兩組間差異性具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2、圖3。

注：A為對(duì)照組穿膜的Fadu細(xì)胞;B為400ng/ml濃度組穿膜的Fadu細(xì)胞。

注：與對(duì)照組相比，***P<0.05。

3 討論

頭頸部鱗狀細(xì)胞癌(HNSCC)是上呼吸道最常見的惡性腫瘤，HSCC約占所有HNSCC的3%，然而卻是所有頭頸部惡性腫瘤中預(yù)后最差的一種[3]，這與其早期即出現(xiàn)區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和隨后的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移擴(kuò)散有關(guān)，這是HSCC的一個(gè)重要特征[9]。HSCC治療手段包括手術(shù)切除，放射療法(RT)或化學(xué)療法。對(duì)于特定的早期病例(T1和部分T2期患者及無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者)，可以采用單純手術(shù)切除治療方式，而晚期HSCC則需要手術(shù)切除及放、化療聯(lián)合的綜合性治療[10]。下咽局部有豐富的淋巴網(wǎng)絡(luò)，使腫瘤可以早期擴(kuò)散到頸部和咽后淋巴結(jié)，增加了轉(zhuǎn)移的機(jī)會(huì)，導(dǎo)致HSCC患者預(yù)后較其他頭頸部腫瘤相對(duì)較差。因此，找尋新的有意義的治療靶點(diǎn)對(duì)于HSCC的治療和遠(yuǎn)期預(yù)后具有重要意義。

腫瘤細(xì)胞中存在BDNF/TrkB自分泌通路，BDNF/TrkB通路與腫瘤細(xì)胞的形成、侵襲轉(zhuǎn)移以及耐藥性[11]相關(guān)。BDNF除了在神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中高表達(dá)外，在呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、血液系統(tǒng)及生殖系統(tǒng)的腫瘤組織中同樣發(fā)現(xiàn)表達(dá)上調(diào)[12-15]。BDNF/TrkB信號(hào)通路在頭頸部多種腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的重要作用[8,16]，但BDNF在HSCC中的表達(dá)情況及對(duì)于HSCC侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響知之甚少，因此，研究BDNF對(duì)于HSCC的生長(zhǎng)浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移及預(yù)后的影響有重要的價(jià)值。

通過(guò)免疫組化實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)：1)HSCC組織中腫瘤直徑>2cm的患者BDNF蛋白的表達(dá)水平明顯高于≤2cm的患者；2)中低分化的患者BDNF蛋白的表達(dá)水平明顯高于高分化的患者；3)有淋巴轉(zhuǎn)移的患者BDNF蛋白的表達(dá)水平明顯高于無(wú)淋巴轉(zhuǎn)移的患者；4)Ⅲ、Ⅳ期患者BDNF蛋白的表達(dá)水平明顯高于Ⅰ、Ⅲ期的患者。以上各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本文中浸潤(rùn)至肌層及以下的患者與浸潤(rùn)至黏膜下層的患者的BDNF蛋白的表達(dá)率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，分析可能原因：1)由于樣本量較少導(dǎo)致統(tǒng)計(jì)學(xué)差異不明顯；2)本文中所收集晚期患者(Ⅲ及Ⅳ期)較多，腫瘤惡性度普遍較高，從而影響B(tài)DNF蛋白的表達(dá)差異性。我們認(rèn)為增加樣本量，豐富不同腫瘤分期，可使統(tǒng)計(jì)學(xué)差異更加顯著。

大量新生血管的形成是另一個(gè)與腫瘤遠(yuǎn)處侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的因素，BDNF在血管生成的過(guò)程中是必不可少的[17]，Kermani等[18]發(fā)現(xiàn)BDNF有雙重促血管生成的作用，其既可以通過(guò)局部激活內(nèi)皮細(xì)胞亞群表達(dá)的TrkB受體，也可以通過(guò)主動(dòng)募集骨髓源性干細(xì)胞的方式促進(jìn)血管內(nèi)皮生成。通過(guò)這種雙重促血管生成活性，與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)共同作用促進(jìn)生成新生血管，達(dá)到促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和侵襲轉(zhuǎn)移的作用[19]。

Kupferman等[20]發(fā)現(xiàn)BDNF參與喉癌及舌癌的生長(zhǎng)過(guò)程，并且可以誘導(dǎo)細(xì)胞遷移和上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的形成。BDNF在腫瘤微環(huán)境中可以通過(guò)成纖維細(xì)胞(CAFs)控制的旁分泌軸協(xié)助淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，與正常成纖維細(xì)胞相比，含有來(lái)自頭頸部腫瘤患者相關(guān)成纖維細(xì)胞(CAFs)的條件培養(yǎng)基可促進(jìn)頭頸部細(xì)胞增殖、細(xì)胞浸潤(rùn)、耐受化療藥物以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，從機(jī)制上證明了BDNF在頭頸部腫瘤發(fā)生及進(jìn)展過(guò)程中的重要作用[21]。這一過(guò)程也被Dudás等證實(shí)，通過(guò)在無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)成纖維細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)激活的成纖維細(xì)胞，也可以產(chǎn)生高水平的BDNF，能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞EMT形成，并且發(fā)現(xiàn)使用TGF-β1處理舌鱗狀細(xì)胞癌SCC-25細(xì)胞后可抑制其生長(zhǎng)，而BDNF處理后可恢復(fù)SCC-25細(xì)胞的生長(zhǎng)，認(rèn)為BDNF可以提高腫瘤細(xì)胞存活率，從而導(dǎo)致患者預(yù)后惡化[22-23]。

本文根據(jù)上述文獻(xiàn)的報(bào)道進(jìn)一步驗(yàn)證HSCC的侵襲轉(zhuǎn)移能力是否與BDNF相關(guān)，在免疫組化結(jié)果證實(shí)BDNF在HSCC組織中高度表達(dá)的基礎(chǔ)上，我們以外源性BDNF作為刺激因子培養(yǎng)FaDu細(xì)胞，通過(guò)Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比外源性BDNF(400ng/ml)處理后的FaDu細(xì)胞穿膜數(shù)量更多，侵襲能力明顯增強(qiáng)，兩組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與上述文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致，以此證明BDNF的表達(dá)與FaDu細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

綜上所述，BDNF蛋白在HSCC癌組織中表達(dá)水平顯著高于癌旁組織及正常咽部黏膜組織，且表達(dá)水平與腫瘤直徑、分化程度、是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期密切相關(guān)；并且通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)BDNF蛋白可促進(jìn)下咽鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系FaDu的侵襲轉(zhuǎn)移能力，進(jìn)一步說(shuō)明BDNF的表達(dá)對(duì)HSCC的侵襲轉(zhuǎn)移有作用。臨床上可通過(guò)檢測(cè)BDNF的表達(dá)來(lái)輔助判斷患者腫預(yù)后，后期實(shí)驗(yàn)也可通過(guò)BDNF作為切入點(diǎn)進(jìn)一步研究所涉及的相關(guān)通路，期許找到HSCC潛在的治療靶點(diǎn)。