孫琰晴，徐 東，李 斌，陳麗竹，張明亮，葉乃好，胡順鑫，李煥軍，尼志杰，喬瑞光，相智巍

(1.上海海洋大學 國家海洋生物科學國際聯(lián)合研究中心，水產(chǎn)科學國家級實驗教學示范中心，上海 201306；2.山東省海洋資源與環(huán)境研究院 山東省海洋生態(tài)修復重點實驗室，山東 煙臺 264006；3.中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所,山東 青島 266071)

引 言

在過去的幾十年里，重金屬及類金屬物質(zhì)在環(huán)境中的積累已逐漸成為影響動植物生長、代謝等生理生化功能的重要因素[1]。作為在自然界中廣泛存在的類金屬，砷及其化合物被世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構(gòu)列為一類致癌物，同時也被我國生態(tài)環(huán)境部列入有毒有害水污染物名錄(第一批)，對人類及動植物都具有很強的毒性作用。近年隨著礦石的開采冶煉、含砷農(nóng)藥的使用等活動的加劇導致海洋中的砷污染愈發(fā)嚴重，對生態(tài)系統(tǒng)和人類的健康產(chǎn)生了巨大的威脅[2]。海洋植物是海洋生態(tài)系統(tǒng)的主要生產(chǎn)者，對海水中As濃度的變化具有敏感性[3]，尤其是大型可食用藻類對砷的富集，已經(jīng)引起人們的特別關注。

海帶(Laminariajaponica)是一種含有多種礦物質(zhì)的經(jīng)濟藻類，也是我國重要的養(yǎng)殖藻類之一。除食用功能外，海帶還是一種重要的工業(yè)原料，可以用來生產(chǎn)褐藻膠、甘露醇、提取碘等，在化工、醫(yī)藥等方面都具有廣泛應用，但由于其對重金屬、礦物質(zhì)等具有強烈的富集作用[4]，亦被稱為海洋中的“砷庫”[5]。作為一種砷超積累的物種，它被認為是研究可食用海藻中砷潛在風險的理想材料[6]。目前對海帶的相關研究主要集中在海帶中生物活性物質(zhì)的提取、分離及功能性研究、海帶養(yǎng)殖模式的探索等方面，而環(huán)境因子尤其是重金屬脅迫對海帶的生理影響及其在海帶中的富集研究較少。砷作為一種有毒類金屬，會導致海帶細胞大量活性氧的積累[7]，而抗氧化防御系統(tǒng)則可以有效清除活性氧(ROS)[8]，緩解超氧自由基、過氧化氫等造成的損傷。為探討砷對海帶抗氧化防御系統(tǒng)的影響及其在海帶中的富集作用，本研究以海帶孢子體為實驗對象，測定不同暴露時間海帶組織氧化損傷及抗氧化活性變化，同時利用電感耦合等離子質(zhì)譜(ICP-MS)檢測海帶中總砷含量，從而揭示砷富集對海帶孢子體抗氧化防御系統(tǒng)的影響，同時可為海帶健康養(yǎng)殖提供一定的支持和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及培養(yǎng)方法

海帶孢子體從榮成東楮島采集后，于自然海水中清洗兩遍后暫養(yǎng)1～2 d，選取10 cm左右生長良好、藻體完整的海帶于f/2培養(yǎng)基中進行循環(huán)水養(yǎng)殖和暴露實驗，培養(yǎng)溫度10±1 ℃，光照強度3 000～4 000 lx，光暗周期比12 L:12 D。實驗所用消解管、玻璃容器提前經(jīng)15%硝酸浸泡24 h以上。

1.2 實驗設計

取藻體完整、生長情況較好的海帶孢子體進行實驗，根據(jù)預實驗結(jié)果分別配制0.2、0.4、0.8、1.6 μmol/L的NaAsO2和Na2HAsO4海水進行暴露實驗，分別標為Ⅲ-a、Ⅲ-b、Ⅲ-c、Ⅲ-d和Ⅴ-a、Ⅴ-b、Ⅴ-c、Ⅴ-d，每個處理三個平行，以不加砷的培養(yǎng)液作為空白對照Ctr，循環(huán)水養(yǎng)殖，分別在0、7、14、28 d時取樣測定海帶中總砷含量，并測定1、2、4、7、28 d時海帶中H2O2、MDA含量和SOD、CAT酶活性。

1.3 實驗方法

1.3.1 海帶中總砷含量的測定

海帶孢子體樣品取樣后用清水洗滌3次，吸水紙擦干表面水分，稱取0.1 g海帶樣品于消解管中，加入8 mL硝酸溶液和2 mL過氧化氫溶液，擰緊消解管蓋，放入微波消解儀中進行消解(消解條件：120 ℃ 10 min—150 ℃ 10 min—180 ℃ 20 min)。消解完成后180 ℃趕酸至近干，轉(zhuǎn)移到25 mL比色管中定容，用ICP-MS進行總砷含量測定[9]。

1.3.2 樣品提取和酶測定

海帶孢子體取樣后用清水洗凈擦干，分別稱取0.1 g左右樣品加入9倍體積的生理鹽水冰浴勻漿，4 ℃，12 000 r/min離心10 min，取上清待測。使用南京建成生物工程研究所有限公司試劑盒對CAT、SOD活性和MDA、H2O2含量進行測定。

1.3.3 統(tǒng)計與分析

用SPSS 20分析軟件對實驗數(shù)據(jù)進行單因子方差分析(One-way ANOVA)和多重比較(Duncan)，P<0.05時具有顯著性差異，所有數(shù)據(jù)為3個平行實驗結(jié)果的平均值，并用origin 9作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 海帶中總砷含量變化

表1為無機砷暴露不同時間時海帶中總砷含量。經(jīng)測定，實驗初始時海帶中總砷含量為1.683 mg/kg(鮮重)，與各取樣時間對照組中總砷含量沒有顯著差異(P>0.05)，但顯著低于無機砷暴露后海帶中總砷含量(P<0.05)。由表中可以看出，亞砷酸鹽處理組海帶中總砷含量隨暴露濃度的升高呈逐漸升高的趨勢，各取樣時間內(nèi)兩個高濃度處理組海帶中總砷含量無顯著差異(P>0.05)，但均顯著高于較低濃度處理組(P<0.05)，實驗進行至28 d時Ⅲ-d組海帶中總砷含量達到最大值，為4.869 mg/kg。除28 d外砷酸鹽處理組海帶中總砷含量隨濃度的變化趨勢同亞砷酸鹽處理組，28 d時海帶中總砷含量最大值在V-c處取得，為4.257 mg/kg，顯著高于其他濃度處理組(P<0.05)。海帶在相同濃度的兩種無機砷暴露環(huán)境中的砷積累量不同，亞砷酸鹽暴露下海帶中總砷含量高于砷酸鹽暴露。結(jié)果表明，海帶對環(huán)境中無機砷具有富集作用，對亞砷酸鹽的積累能力大于砷酸鹽。

表1 無機砷暴露下海帶中總砷含量Table 1 Total arsenic content in L. japonica exposed to inorganic arsenic 單位：mg/kg

2.2 As(Ⅲ)與As(V)對海帶氧化-抗氧化生理生化指標的影響

2.2.1 無機砷砷影響下海帶中MDA及H2O2含量

圖1(a)為無機砷暴露后不同時間海帶孢子體幼苗中H2O2含量，隨著時間的增加，兩種無機砷形態(tài)暴露下海帶在4 d內(nèi)H2O2含量變化趨勢不同。As(Ⅲ)處理組中，H2O2含量在4 d內(nèi)呈上下波動趨勢，除Ⅲ-c在第2天時取得最小值外，其他處理組均在第4天時取得最小值。As(V)處理組中H2O2含量除V-d組外呈降低趨勢，其中V-d組在第2天時取得最小值，其他處理組在第4天時含量最低。4 d后H2O2含量逐漸增加，實驗28 d時結(jié)果顯示，隨著砷暴露濃度增加，各處理組中H2O2含量增加，且顯著高于對照(P<0.05)。結(jié)果表明，無機砷暴露對海帶中H2O2含量的增加起到促進作用，且隨濃度的升高促進作用增強。

圖1 無機砷暴露后海帶組中H2O2及MDA含量Fig.1 The content of H2O2 and MDA in L. japonica after inorganic arsenic exposure

從圖1(b)中可以看出，無機砷處理下海帶孢子體幼苗MDA含量隨時間呈現(xiàn)先降低后升高再降低的趨勢。第2天時MDA含量較第1天時顯著下降(P<0.05)，隨后在第4天時顯著升高并達到最大值(除V-c組外)。實驗28 d時，所有砷處理組海帶中MDA含量較7 d時均顯著降低(P<0.05)。隨著砷暴露濃度的增加，As(Ⅲ)和As(V)處理組海帶中MDA含量均呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢，除最高濃度處理組外，As(Ⅲ)暴露下海帶中MDA含量高于As(V)暴露。實驗期間，所有實驗組海帶中MDA含量均顯著高于對照組(P<0.05)。結(jié)果表明，無機砷暴露會使海帶中MDA含量的顯著升高，且濃度越高越易造成藻細胞過氧化損傷。

2.2.2 無機砷對海帶中CAT及SOD酶活的影響

無機砷暴露下海帶孢子體幼苗中過氧化氫酶(CAT)活性隨時間的變化如圖2(a)所示，隨時間的增加，海帶中CAT活性呈現(xiàn)上下波動的變化趨勢。實驗第2天時，所有處理組CAT活性較第1天時均顯著升高(P<0.05)，并達到最大值，Ⅲ-b、V-b處理組CAT活性分別為As(Ⅲ)與As(V)處理組中的最大值，分別達90.48 U/mg和72.05 U/mg。4 d時各處理組CAT活性均顯著降低(P<0.05)，隨后在7 d時上升。28 d時海帶CAT活性較1 d時升高，其中As(Ⅲ)處理組活性隨濃度的升高而升高，As(V)最高濃度處理組CAT活性高于其他濃度處理組。結(jié)果表明，無機砷暴露會使海帶中CAT活性短暫升高以緩解氧化損傷，暴露一段時間后海帶CAT能力達到飽和，并開始降低，長期砷暴露下海帶CAT活性達到相對穩(wěn)定狀態(tài)。

圖2 無機砷暴露后海帶中CAT及SOD活性Fig.2 The activities of CAT and SOD in L. japonica after inorganic arsenic exposure

圖2(b)中可以看出，所有砷處理組海帶孢子體幼苗中超氧化物歧化酶(SOD)活性在第1天時最大。第2天時所有處理組都顯著下降(P<0.05)，4 d時除Ⅲ-a、Ⅲ-d外各處理組中SOD活性仍繼續(xù)下降。之后，隨著暴露時間的延長，各處理組海帶中SOD活性逐漸升高，對照組海帶中SOD活性在整個實驗期間處于較低水平，顯著低于實驗組(P<0.05)。實驗28 d時，海帶中SOD活性仍低于1 d時水平，兩種無機砷暴露下最低濃度處理組SOD活性最高，除Ⅲ-b組外，隨暴露濃度升高而降低。結(jié)果表明，砷暴露誘導了海帶中SOD活性的升高，但隨暴露時間增加對其影響減弱，低濃度無機砷暴露下海帶SOD活性更高。

3 討論

3.1 海帶對無機砷的積累

研究海帶中砷的積累，有助于了解全球砷污染環(huán)境下海水中砷濃度的升高對海帶中砷含量的影響，從而有助于降低其對人類產(chǎn)生的健康問題[10-11]。雖然有研究表明海帶不同部位中砷的富集量有所不同，如劉天紅等[9]認為，海帶假根部總砷含量最高，其次是葉片中部、邊稍部，其葉尖處的砷含量最低，與聶新華[12]、姜橋[13]等的研究結(jié)果一致。這是因為海帶主要靠葉片吸收營養(yǎng)物質(zhì)及微量元素，再運輸?shù)礁鱾€部位，根部生長期長，因此砷的富集量明顯高于柄部和葉片。但由于本實驗所用海帶孢子體幼苗較小，不易分別對不同部位砷含量進行準確測定，因此本實驗中砷的測定值為整株海帶孢子體幼苗的整體砷含量。在砷酸鹽暴露下，海帶對砷富集量較小，這可能是由于養(yǎng)殖水中存在的磷與砷共處同一主族，具有相似的化學性質(zhì)，而海帶都是通過磷酸轉(zhuǎn)運蛋白吸收As(V)和無機磷酸鹽，存在一定的競爭關系[14-15]，而As(Ⅲ)進入藻細胞的通道不受養(yǎng)殖水中磷的影響[16]，另外由無機砷暴露下海帶對砷的富集系數(shù)(BCF)結(jié)果顯示，28 d時As(Ⅲ)最高濃度處理組BCF值為46.44，遠大于相同濃度處理下As(V)組中BCF值22.33。因此本研究中磷充足的條件下，海帶對As(V)的富集能力弱于As(Ⅲ)，但磷限制條件下海帶對As(V)富集轉(zhuǎn)化及其機制有待進行深入研究。

3.2 無機砷暴露對海帶氧化損傷及抗氧化防御酶系的影響

所有需氧生物體都擁有一套比較完整的抗氧化防御體系[17]，在干旱、寒冷、高鹽及重金屬等逆境脅迫中對生物健康起到了至關重要的作用。研究表明，砷酸鹽可以解除氧化磷酸化和光合磷酸化，對氨基酸中的巰基基團具有較高的親和力，從而抑制了某些含有巰基基團的酶的表達并使蛋白質(zhì)變性，通過阻止蛋白質(zhì)之間的相互作用而損害細胞新陳代謝[8-9]。植物體內(nèi)丙二醛(MDA)和過氧化氫(H2O2)含量高低能夠反映出植物細胞膜受到傷害程度的大小。實驗初期海帶孢子體幼苗中過高的MDA和H2O2含量說明砷暴露引起了海帶的氧化應激，且較高濃度砷處理下過氧化作用更強。有證據(jù)表明，無機砷的暴露會導致大量活性氧的產(chǎn)生及脂質(zhì)過氧化作用的發(fā)生，對細胞產(chǎn)生損害[18]。而連續(xù)的無機砷暴露帶來的氧化應激激活了抗氧化酶防御系統(tǒng)，本研究中MDA和H2O2含量在第2天時的降低證實了這一點(圖1)，但由于海帶自身抗氧化能力的有限性，隨著暴露實驗的進行，其含量仍顯著高于對照組。抗氧化酶防御系統(tǒng)包括超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)等，其中SOD構(gòu)成了對抗活性氧(ROS)的第一道防線[19]。植物可以通過SOD發(fā)揮作用，將砷脅迫誘導的超氧自由基轉(zhuǎn)化為H2O2，并通過CAT阻止H2O2積累，使其分解或還原為H2O和O2，達到降低植物體內(nèi)活性氧含量的效果[20]。

CAT活性在實驗第2天時達到最大值，表明海帶可以通過提高CAT活性來緩解過氧化損傷，第4天時活性的顯著降低可能是一段時間的砷脅迫抑制了過氧化氫酶分子的活性或抑制了相關酶基因的表達，其具體機理有待進一步研究。長期砷暴露下海帶CAT活性達到相對穩(wěn)定狀態(tài)。從砷濃度對CAT活性的影響看，第28天時CAT活性均高于對照組，其中As(Ⅲ)處理組濃度越高CAT活性越強，As(V)處理組高濃度下CAT活性高于其他濃度處理組，與H2O2含量測定結(jié)果基本一致，說明長期砷暴露下海帶仍會通過提高酶活性來幫助細胞清除過多的H2O2，但砷暴露下其能力是有一定限度的。海帶中SOD活性在實驗1 d時，而后逐漸降低并趨于穩(wěn)定，但實驗期間SOD活性始終顯著高于對照組(圖2)，可能是砷脅迫破壞了原有的活性氧產(chǎn)生消除平衡，在短暫SOD活性升高后逐漸達到新的平衡，在砷脅迫對美人蕉[20]、水稻幼苗[21]等植物中也發(fā)現(xiàn)了SOD增強的現(xiàn)象。因此，在海帶養(yǎng)殖過程中，海帶雖然能夠?qū)ι槊{迫做出一定程度的響應，但仍要對海水中砷含量進行監(jiān)測，以防止砷富集對海帶生長、品質(zhì)和產(chǎn)品安全帶來不利影響。

4 結(jié)論

(1)研究結(jié)果表明，不同價態(tài)無機砷在海帶中的積累不同，海帶對五價砷的積累能力弱于三價砷。

(2)類金屬砷的存在對海帶細胞產(chǎn)生了一定程度的氧化損傷，使海帶中過氧化氫和丙二醛含量升高，但隨砷暴露時間的增加，海帶中抗氧化防御系統(tǒng)通過一定的自我調(diào)節(jié)，從而降低了砷脅迫的毒害作用。