熊瑩槐，羅曉春，錢雪橋,黃錦爐，劉緒博

(1. 廣東海大集團股份有限公司畜牧水產(chǎn)研究中心，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部微生態(tài)資源養(yǎng)殖利用重點實驗室，廣東 廣州 511400；2. 華南理工大學生物科學與工程學院，廣東 廣州 510006)

引 言

凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)又稱南美白對蝦，具有適溫范圍廣(6～39 ℃)，鹽度適應(yīng)能力強(0.5～50)，生長速度快，抗病力強，肉質(zhì)鮮美等特點，已成為中國和世界范圍內(nèi)的對蝦三大養(yǎng)殖種類之一[1]。

在過去幾十年間，隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，全球魚粉供應(yīng)量開始出現(xiàn)短缺，魚粉價格昂貴，因此在水生生物飼料中用植物蛋白替代魚粉開始被廣泛研究[2-3]。但是相對于動物蛋白，植物蛋白源存在諸多抗營養(yǎng)因子，諸如植酸鹽、大豆抗原蛋白等，這會導致蝦類消化酶活性下降，甚至導致養(yǎng)殖動物腸道組織結(jié)構(gòu)產(chǎn)生病理性的損傷[4-6]。據(jù)報道，通過飼料添加復合酶制劑是提高水產(chǎn)動物對飼料消化吸收能力的一個有效的途徑之一，甚至在一定程度上可以提高水生動物的免疫能力[7-8]。例如，Yildirim等[9]報道飼料中添加復合酶制劑(果膠酶、木聚糖酶等)可顯著提高非洲鯰(Oreochromisniloticus×O.aureus)的飼料轉(zhuǎn)化率和生長性能；王國霞等[4]報道飼料添加植酸酶和復合酶可以提高黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)抗氧化能力和腸道健康狀況。

此外，隨著全球市場對蝦類的需求越來越大，蝦養(yǎng)殖業(yè)迅猛發(fā)展[10]，為提高蝦養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟社會利益，高密度養(yǎng)殖模式開始在整個蝦產(chǎn)業(yè)中流行[11-12]，這使蝦持續(xù)暴露在人工和次優(yōu)的養(yǎng)殖條件下。在高密度養(yǎng)殖模式下，往往投入過多的餌料，從而導致殘餌糞便在蝦池的大量積累，使得對蝦對飼料利用率下降，且水環(huán)境急劇惡化，有害微生物大量繁殖，進一步影響了對蝦的生長、發(fā)育和產(chǎn)品質(zhì)量[13]。飼料添加益生菌可以在一定程度上緩解養(yǎng)殖弊端，益生菌在腸道中的繁殖速度大于凋亡速度，并與宿主、環(huán)境形成動態(tài)平衡[14]。研究表明，益生菌可以在一定范圍內(nèi)形成占位效應(yīng)，從而抑制致病菌過度生長，有助于調(diào)節(jié)腸道菌群的平衡，并可以提高宿主的免疫力；此外，益生菌還可以為宿主提供養(yǎng)分，增強宿主消化酶活性，提高飼料消化率[15]。目前，較少研究報道飼料中添加微生態(tài)制劑對凡納濱對蝦體生化組成、能量收支和能量平衡的影響。

本實驗通過在飼料中添加復合酶制劑，復合菌制劑以及復合菌酶制劑來對比研究復合酶制劑和復合菌制劑對凡納濱對蝦生長、體生化組成、和能量平衡的影響，以期為凡納濱對蝦健康養(yǎng)殖提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗設(shè)計

本實驗于廣州海鷗島試驗基地進行，所用系統(tǒng)為循環(huán)水系統(tǒng)。以初始體重(2.05±0.05)g凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)為實驗對象，分別設(shè)計了1個對照組和3個處理組，其中，A為對照組，投喂基礎(chǔ)飼料(主要成分見表1)；B為基礎(chǔ)飼料+酶制劑(消化酶和非淀粉多糖酶等復合酶)；C為基礎(chǔ)飼料+復合菌制劑組(復合菌由嗜酸乳桿菌、枯草芽孢桿菌、釀酒酵母和糞鏈球菌構(gòu)成)；D為基礎(chǔ)飼料+復合菌酶制劑(主要由嗜酸乳桿菌、枯草芽孢桿菌、釀酒酵母和糞鏈球菌復合菌與消化酶和非淀粉多糖酶等復合酶)。飼料制劑購于歐科拜克生物有限公司(洛陽，河南，中國)。菌酶制劑通過攪拌的方法與飼料均勻混合，B組酶制劑濃度為150 mg/kg，C組復合菌濃度為2×109cfu/g，D組菌、酶濃度分別為2×109cfu/g、150 mg/kg；飼料中添加的菌、酶劑量均為25 g/kg。每個處理組分別設(shè)4個重復，每個重復分別放養(yǎng)100尾蝦。

表1 基礎(chǔ)飼料的主要成分Table 1 composition of the basic feed

實驗開始前，將對蝦暫養(yǎng)于鹽度17的半咸水中進行馴化，整個馴化期為10 d。期間保持合適充氧，定時測定水溫，定時投喂適量基礎(chǔ)飼料，并且將養(yǎng)殖用水的鹽度每天提升2，逐漸馴化直到鹽度升至養(yǎng)殖用水的自然鹽度31。馴化暫養(yǎng)結(jié)束后穩(wěn)定2 d，準備進行正式實驗。

暫養(yǎng)馴化階段結(jié)束后，將實驗蝦饑餓1 d，然后選取規(guī)格相近，無病無傷、健康活潑的凡納濱對蝦分輪次隨機放入16個相同規(guī)格的400 L塑料桶中，每次放入對蝦10尾，共放10輪即每個養(yǎng)殖桶中共放凡納濱對蝦100尾，在放蝦過程中稱量并記錄每個重復中蝦的總重量。然后進行45 d的養(yǎng)殖實驗。養(yǎng)殖過程中，使水溫保持27 ℃左右，溶氧高于5 mg/L，養(yǎng)殖用水鹽度31，酸堿度8.0±0.1。養(yǎng)殖水質(zhì)使用多功能YSI專業(yè)水質(zhì)分析儀進行測定(Yellow Spring Instrument Co., Yellow Spring, Ohio, USA)。每天于上午8:30及下午5：00定時投喂，每天的投喂量以對蝦體重3%～5%為準。每次投喂前分別收集養(yǎng)殖桶底部的殘餌、糞便，同時換水1/3～2/3。每天檢查并記錄對蝦的攝食和死亡情況。

1.2 樣品采集與指標測定

1.2.1 糞便收集與肌肉采集

實驗用飼料隨機取樣3份，用于飼料成分的分析。實驗開始前對投喂時間內(nèi)飼料的1.5 h溶失率進行測定，用于校正溶失造成的攝食量計算中的誤差。殘餌在投喂后1 h用虹吸法及時收集，每次在投喂前和投喂后1.5 h用虹吸法收集糞便和蝦殼，再分別裝入對應(yīng)燒杯，在70 ℃下烘干至恒重后在-20 ℃下保存。實驗結(jié)束時，對蝦停食24 h，然后對每個桶的蝦分別稱重，樣品在70 ℃下烘干至恒重后在-20 ℃下保存。

肌肉組織經(jīng)液氮迅速冷凍后于-80 ℃超低溫冰箱保存，用于肌肉組織腺苷酸的測定。

1.2.2 生長指標的計算

養(yǎng)殖實驗開始前，測量記錄實驗用蝦的初總體重、初均重、初均長、對蝦的總數(shù)。45 d的養(yǎng)殖之后，將實驗用蝦進行24 h的饑餓處理，統(tǒng)計存活的數(shù)量，計算均增重、增重率、特定生長率等。

體重增長率=[均增重(g)/初均重(g)]×100%；

(1)

成活率=養(yǎng)殖結(jié)束后對蝦總數(shù)/養(yǎng)殖開始前對蝦總數(shù)×100%

(2)

特定生長率=(lnW2-lnW1)/t×100%；

(3)

W1表示初始體重，W2表示末體重，t表示養(yǎng)殖時間。

1.2.3 生化組成和能值的測定

將實驗蝦樣品放入烘箱70 ℃下烘干至恒重，得到干物質(zhì)含量；以馬福爐(HRMF-7000，熱博特有限公司，中國)550 ℃灼燒6 h灰化至恒重得到灰分含量；元素分析儀(Vario ELⅢ，元素分析系統(tǒng)公司，德國)測得N含量后，再計算得到蛋白質(zhì)含量(6.25×N)；以脂肪抽提儀(BUCHI36680，力辰儀器有限公司，中國)測定蝦體脂肪含量(乙醚為抽提劑)；蝦體組織能值以氧彈熱量儀(PARR6400，Parr儀器公司,美國)測得。

對蝦的攝食(C)、生長(G)、呼吸(R)、糞便(F)、排泄(U)和蛻殼(E)的能量符合下列關(guān)系：

C=G+R+F+U+E

(4)

其中，C為攝入的餌料能量，G為生長能，R為代謝能，F(xiàn)為糞能，U為排泄能，E為蛻殼能。其中，C、G、F和E所含的能值用PARR 6400型氧彈熱量儀測定，排泄能以下式計算：

U=(CN-GN-FN-EN)×24.83

(5)

式中,CN為攝食食物中所含的氮，GN為蝦體中積累的氮，F(xiàn)N和EN為糞便和蛻殼損失的氮，24.83為每克氨氮的能值(KJ)。這里假定氨是唯一的氮排泄物。含氮量用VarioELⅢ型元素分析儀測定。呼吸耗能由能量收支式R=C-G-F-U-E求出。

1.2.4 腺苷酸含量的測定

腺苷酸含量采用Agilent 1100高效液相色譜儀(HPLC,Agilent Corp., USA)進行測定。適量冷凍肌肉組織樣品加入9倍體積的冰冷高氯酸(0.9 mol·L-1)溶液進行勻漿。勻漿液于7 000 g、4 ℃下離心5 min，收集上清液并以3.75 mol·L-1K2CO3中和至pH6.5。中和后的溶液于7 000 g、4 ℃下離心10 min，收集上清液用于測定相應(yīng)組織中腺苷酸含量。組織樣品經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾后用于測定腺苷三磷酸(ATP)、腺苷二磷酸(ADP)和腺苷一磷酸(AMP)含量。以UltimateTM AQ-C18柱(4.6×250 mm)，柱溫為35 ℃，洗脫時間為24 min，流速為1.0 ml·min-1，檢測波長為254 nm。以磷酸緩沖液(40 mmol·L-1KH2PO4和60 mmol·L-1K2HPO4，pH6.50)作為流動相。根據(jù)測得的峰面積和標準曲線計算腺苷酸含量(微摩爾每克組織，μmol·gww-1)。標準曲線由已知濃度的ATP(0-0.8 mmol·L-1)、ADP(0-1.2 mmol·L-1)和AMP(0-1.5 mmol·L-1)溶液制作而成[16]。回歸曲線方程、總腺苷酸(TAN)含量計算公式如下：

ATP Y=14.045x+9.374，R2=1.000

(6)

ADP Y=18.11x-25.053，R2=0.9998

(7)

AMP Y=18.32x-31.33，R2=0.9998

(8)

TAN=[ATP]+[ADP]+[AMP]

(9)

上式中，Y表示腺苷酸峰面積，X表示腺苷酸濃度，[ATP]、[ADP]和[AMP]分別表示ATP、ADP和AMP濃度。

1.3 數(shù)據(jù)計算與統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)使用平均值±標準誤(Mean±S.E.)表示。利用SPSS 22.0對凡納濱對蝦以上各指標的變化作單因子方差分析(One-Way ANOVA)和Duncan’s多重比較檢驗，并以P<0.05作為差異顯著水平。

2 結(jié)果

2.1 不同處理組凡納濱對蝦的生長指標

由表2所示，養(yǎng)殖實驗結(jié)果表明，飼料酶制劑和菌制劑均可以顯著提高凡納濱對蝦的生長性能。投喂不同飼料45 d后，實驗組(B、C、D組)凡納濱對蝦的末體重、均增重、增重率和特定生長率均顯著高于對照組(A組)，且D組生長指標顯著高于其他組(P<0.05)。C組對蝦的末體重、均增重和增重率顯著高于B組，但顯著低于D組(P<0.05)。

表2 不同處理凡納濱對蝦生長情況Table 2 Growth performance of Litopenaeus vannamei fed with different diets

2.2 不同處理組凡納濱對蝦的含能量及體生化組成

如表3所示，飼料酶制劑和菌制劑對凡納濱對蝦體脂肪和灰分影響不顯著(P>0.05)。D組對蝦體蛋白質(zhì)含量顯著高于A、B兩組，且D組對蝦體水分含量顯著低于A、B和C組(P<0.05)。B組和C組對蝦體水分和蛋白質(zhì)差異不顯著(P>0.05)。飼料添加復合菌制劑可以顯著提高對蝦體能量值，其中C組和D組對蝦體能量顯著高于A和B組(P<0.05)。

表3 不同處理凡納濱對蝦體成分組成和體能量Table 3 Body composition and energy content of Litopenaeus vannamei fed with different diets

2.3 不同處理組凡納濱對蝦的能量分配

由表4和表5可知，飼料添加酶制劑和菌制劑可以顯著提高凡納濱對蝦的攝食能，生長能，呼吸能和蛻殼能，其中D組各能值含量最高(P<0.05)。相比于對照組(A組)，B組對蝦生長能占攝食能比例、蛻殼能占攝食能比例顯著升高，且呼吸能占攝食能比例顯著降低(P<0.05)。同樣地，C組對蝦生長能占攝食能比例、蛻殼能占攝食能比例也顯著升高；呼吸能占攝食能比例和排泄能占攝食能比例均顯著降低，且B、C兩組間也存在顯著性差異(P<0.05)。D組對蝦生長能占攝食能比例、蛻殼能占攝食能比例顯著高于其他三組，且呼吸能占攝食能比例和排泄能占攝食能比例顯著低于其他三組(P<0.05)。

表4 不同處理凡納濱對蝦能量收支各組分能量值Table 4 Energy budget components of Litopenaeus vannamei fed with different diets

表5 不同處理凡納濱對蝦能量收支各組分能量分配Table 5 The ratio of the energy of each component to the energy of ingestion of Litopenaeus vannamei fed with different diets

2.4 不同處理組凡納濱對蝦肌肉的腺苷酸含量

由圖1可知，不同處理對凡納濱對蝦肌肉的TAN無顯著影響(圖1a)；飼料酶制劑(B組)和菌制劑(C組)顯著提高了凡納濱對蝦肌肉ATP含量，且酶菌制劑(D組)肌肉ATP含量顯著高于其他三組(P<0.05，圖1b)。同時，飼料酶制劑組(B組)、菌制劑組(C組)和菌酶制劑組(D組)凡納濱對蝦肌肉AMP/ATP和ADP/ATP值顯著低于對照組，且C組顯著低于B組，D組顯著低于其他三組(P<0.05，圖1c，d)。

圖1 不同處理凡納濱對蝦肌肉的腺苷酸含量注：ATP為腺苷三磷酸，ADP為腺苷二磷酸，AMP為腺苷一磷酸，TAN為三者之和。不同字母上標表示單因素分析Duncan’s檢驗差異性顯著，下同。Fig.1 Adenine nucleotides in the muscles of Litopenaeus vannamei fed with different dietsNotes：ATP is adenosine triphosphate, ADP is adenosine diphosphate, AMP is adenosine monophosphate, TAN is the sum of the ATP, ADP and AMP. Means with different superscripts indicate significant differences (P<0.05) based on e-way ANOVA and the Duncan’s test.

3 討論

通過添加酶制劑和菌制劑提高水產(chǎn)動物的生產(chǎn)性能已有大量成功的報道[13,15,17-18]。相似地，本實驗也發(fā)現(xiàn)飼料中添加復合酶制劑(消化酶和非淀粉多糖酶)和復合菌制劑(嗜酸乳桿菌、枯草芽孢桿菌、釀酒酵母和糞鏈球菌)可顯著提高凡納濱對蝦的生長性能。這可能因為，飼料中添加的消化酶增強了凡納濱對蝦對飼料的利用率，加大了營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，從而提高了生長性能。此外，酶制劑中的非淀粉多糖酶可降解可溶性非淀粉多糖，減少食糜粘性，也可以摧毀植物細胞壁，進一步釋放飼料的營養(yǎng)成分[19]而被對蝦所吸收利用。飼料中所添加的復合菌制劑本身可以作為營養(yǎng)物質(zhì)被對蝦利用，更可以改善腸道菌群結(jié)構(gòu)，促進腸道成熟，增強腸道對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收能力[20-21]。其中，枯草芽孢桿菌自身可以合成α-淀粉酶、脂肪酶、纖維素酶、蛋白酶等，在消化道中與動物體內(nèi)的消化酶類一同發(fā)揮作用[22]。此外，本實驗表明，飼料中同時添加酶制劑和菌制劑效果比分別單獨添加酶制劑或菌制劑效果好，表明凡納濱飼料中復合酶和復合菌制劑可以起到協(xié)同作用。

本實驗研究結(jié)果表明，飼料中復合菌酶制劑的添加會顯著降低凡納濱對蝦體水分含量，并顯著提高體蛋白質(zhì)含量，從而提高凡納濱對蝦的品質(zhì)。飼料中菌酶制劑的添加顯著提高了凡納濱對蝦的攝食能，且菌酶制劑組凡納濱對蝦的(生長能/攝食能)和(蛻殼能/攝食能)顯著高于其他組，而(呼吸能/攝食能)和(排泄能/攝食能)顯著低于其他組，表明菌酶制劑組凡納濱對蝦更多的能量被用來生長和蛻殼。此外，相較于對照組，在飼料中單獨添加酶制劑或菌制劑也可以顯著提高凡納濱對蝦用于生長的能量，但該效果均不如菌酶制劑組好。

在生物體內(nèi)，ATP是能量的儲存形式，而ADP和AMP是能量被利用的形式，當機體的能量被大量儲存時，生物體可以獲得更好的生長性能[23]。本研究發(fā)現(xiàn)單獨在飼料中添加復合酶制劑和復合菌制劑均可以顯著提高凡納濱對蝦肌肉ATP含量，并降低ADP/ATP和AMP/ATP含量，表明酶制劑和菌制劑的添加可以促進對蝦能量的保存率，從而提高其生長效率。此外，本實驗進一步發(fā)現(xiàn)，在飼料中同時添加復合酶制劑和復合菌制劑效果比單獨添加這兩種制劑更好。這進一步解釋了菌酶制劑組凡納濱對蝦具有最佳生長性能。

4 結(jié)論

本實驗發(fā)現(xiàn)在飼料中添加復合酶制劑，復合菌制劑可以顯著提高凡納濱對蝦能量收支狀況和肌肉ATP含量，從而顯著提高了凡納濱對蝦的生長性能。同時本研究結(jié)果表明，凡納濱對蝦飼料中酶制劑和菌制劑起到協(xié)同作用，同時添加效果最好。