李文強(qiáng)，張新晨

（哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 普外科，黑龍江 哈爾濱 150001）

生物鐘是生命的基本特征之一，普遍存在于多種生物中，從低等的細(xì)菌到真核的真菌、植物、動(dòng)物到人類都存在生物鐘調(diào)控系統(tǒng)。哺乳動(dòng)物的生物鐘由中樞生物鐘和外周生物鐘組成。中樞生物鐘位于下丘腦的視交叉上核，外周生物鐘存在于各種器官組織中。中樞生物鐘通過自主神經(jīng)支配、體溫、激素信號(hào)和飲食來調(diào)控外周生物鐘。從分子水平上看，生物鐘系統(tǒng)是由一系列生物鐘基因組成，主要有生物鐘核心基因Bmal1、Clock、Npas2，負(fù)反饋基因Per1-3、Cry1-2，以及靶基因和 鐘 控 基 因Nr1d1、Nr1d2、RORα、Dbp、Tef、Nfil3等。隨著生物鐘研究的逐漸深入，生物鐘基因及蛋白在抗炎及免疫調(diào)節(jié)中的作用逐步被發(fā)現(xiàn)，本文簡(jiǎn)單介紹生物鐘通路，并重點(diǎn)討論生物鐘基因Rev-erb和ROR在抗炎及免疫調(diào)節(jié)中的作用，以及針對(duì)Rev-erb和ROR靶向配體的研究及應(yīng)用。

1 生物鐘通路

生物鐘系統(tǒng)是一個(gè)層次網(wǎng)絡(luò)[1]。這個(gè)層次的頂部是視交叉上核（suprachiasmatic nucleus,SCN），SCN位于下丘腦前部，接受光信息促進(jìn)松果體褪黑激素分泌、腎上腺皮質(zhì)酮釋放、調(diào)節(jié)體溫和睡眠-覺醒周期的節(jié)律，充當(dāng)一個(gè)“指揮者”，為生物鐘系統(tǒng)提供主要的時(shí)間線索[2]。SCN通過神經(jīng)元和體液信號(hào)同步機(jī)體大多數(shù)器官和組織細(xì)胞中運(yùn)作的局部時(shí)鐘振蕩器，影響全身晝夜生理學(xué)和行為[3]。

在細(xì)胞水平上，生物鐘的基因和蛋白以轉(zhuǎn)錄-翻譯反饋回路表達(dá)，周期約為24 h。第一個(gè)生物鐘反饋調(diào)節(jié)機(jī)制：Bmal1和Clock形成一個(gè)異二聚體，激活Per1、Per2和Cry1、Cry2的轉(zhuǎn)錄，當(dāng)Per和Cry蛋白到達(dá)關(guān)鍵值時(shí)抑制Bmal1-Clock二聚體對(duì)自身基因的激活以結(jié)束這個(gè)循環(huán)。在Per和Cry蛋白降解后再次開始一個(gè)新的晝夜循環(huán)，重新開始Bmal1-Clock介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活[4]。第二個(gè)生物鐘反饋調(diào)節(jié)機(jī)制：Bmal1-Clock異二聚體轉(zhuǎn)錄控制啟動(dòng)子序列中含有E-box元件的核激素受體Rev-erbα（Nr1d1）、Reverbβ（Nr1d2）及RORα、RORβ和RORγ，轉(zhuǎn)錄出RORs蛋白和Rev-erbs蛋白在Bmal1基因的啟動(dòng)子序列中競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合ROR元素（RORe）。RORs蛋白的結(jié)合增加Bmal1的轉(zhuǎn)錄，Rev-erbs蛋白的結(jié)合能抑制這種反應(yīng)[5]，由于表達(dá)模式及靶基因的大量重疊，Rev-erb和ROR通常參與調(diào)節(jié)相似的生理過程。

2 Rev-erb在抗炎及免疫調(diào)節(jié)中的研究

2.1 Rev-erb通過調(diào)節(jié)炎癥因子表達(dá)發(fā)揮抗炎作用

有研究[6]發(fā)現(xiàn)，Rev-erb過表達(dá)抑制與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎相關(guān)的炎癥因子IL-6、TNF-α、CCL-2和MMP-9的表達(dá)。有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[7]發(fā)現(xiàn)Nr1d1-/-小鼠中Cx3cr1和MMP-9 mRNA表達(dá)升高，而Rev-erbα過表達(dá)促使Cx3cr1和MMP-9 mRNA表達(dá)下降。在巨噬細(xì)胞中，Rev-erbα通過結(jié)合小鼠CCL-2啟動(dòng)子中的近端元件下調(diào)CCL-2的表達(dá)[8]，從而介導(dǎo)水泡性口炎病毒誘發(fā)腦炎模型中病毒感染的晝夜敏感性[9]。Rev-erbα能夠與組蛋白脫乙酰酶3（HDAC3）結(jié)合，并與DNA的一個(gè)由HDAC3和核受體輔助抑制因子（NCOR）組成抑制復(fù)合物，負(fù)性調(diào)節(jié)IL-6等炎癥因子的基因表達(dá)[7]。綜上所述，Rev-erb作為多種炎癥因子的負(fù)性調(diào)節(jié)因子發(fā)揮抗炎作用。

2.2 Rev-erb通過抑制NFκB/Nlrp3發(fā)揮抗炎作用

Rev-erbα在體外和體內(nèi)調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞激活，Rev-erbα功能喪失促進(jìn)體內(nèi)自發(fā)性神經(jīng)炎癥和神經(jīng)元功能障礙。研究[10]發(fā)現(xiàn)，小鼠海馬中Rev-erbα缺失導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞免疫反應(yīng)性的節(jié)律被破壞，并使腦小膠質(zhì)細(xì)胞鎖定在促炎狀態(tài)；染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）實(shí)驗(yàn)表明，Rev-erbα與NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)轉(zhuǎn)錄物的啟動(dòng)子區(qū)域相互作用，Rev-erbα缺失導(dǎo)致培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞和小鼠海馬中的促炎性NF-κB活化。在Raw264.7細(xì)胞熒光素酶報(bào)告分析、電泳遷移率轉(zhuǎn)移分析（EMSA）和芯片序列中，Reverbα與p65啟動(dòng)子中的REV反應(yīng)元件直接結(jié)合降低總胞漿和核p65水平[11]。Rev-erbα還通過與NLRP3和IL1b的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，負(fù)調(diào)節(jié)NLRP3炎癥小體的表達(dá)[12]。在Nr1d1缺陷小鼠和人巨噬細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)NLRP3的表達(dá)及其復(fù)合物的激活與Nr1d1的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，隨時(shí)間變化，在深夜達(dá)到高峰，Reverbα激活可抑制LPS誘導(dǎo)的急性腹膜炎和肝炎的NLRP3炎癥途徑[12]。抑制NF-κB/NLRP3軸可能是Rev-erbα介導(dǎo)抗炎的一種機(jī)制。

2.3 Rev-erb通過誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分化發(fā)揮抗炎作用

Rev-erbα和Rev-erbβ在巨噬細(xì)胞結(jié)合位點(diǎn)的全基因組分析顯示，這些受體參與了復(fù)合物靶基因的調(diào)控，提示Rev-erbα和Rev-erbβ在巨噬細(xì)胞中起重要作用；巨噬細(xì)胞能夠極化成具有不同表型和生理功能的促炎M1或抗炎M2狀態(tài)。敲除造血細(xì)胞中的Nr1d1，然后將骨髓移植到LDL受體（LDLR）無效的小鼠中，發(fā)現(xiàn)這些小鼠的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊增加，但脂質(zhì)水平未受影響[7]。這種作用源于巨噬細(xì)胞功能的改變，Rev-erbα的過表達(dá)導(dǎo)致巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)錄水平降低[6]及抗炎M2巨噬細(xì)胞水平的升高[13]，進(jìn)而發(fā)揮抗炎作用。

2.4 Rev-erb通過抑制Th17細(xì)胞發(fā)育發(fā)揮抗炎作用

Rev-erbα與Th17細(xì)胞中的RoR反應(yīng)元件結(jié)合，抑制包括RoRγ在內(nèi)的依賴于RoRα的基因表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，提高Rev-erb mRNA的表達(dá)或用合成的Rev-erb激動(dòng)劑治療可通過降低Th17細(xì)胞水平，顯著延緩實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎的發(fā)生、發(fā)展[14]。相反，Rev-erbα丟失則導(dǎo)致CD3+T細(xì)胞Nfil3的表達(dá)升高，進(jìn)而使RORγT細(xì)胞誘導(dǎo)IL-17表達(dá)并促進(jìn)Th17細(xì)胞的發(fā)育[15]。這些結(jié)果提示，抑制自身免疫性疾病中的Th17細(xì)胞分化發(fā)育可能是Rev-erb發(fā)揮抗炎作用的一種機(jī)制。

2.5 Rev-erb蛋白通過穩(wěn)定性的動(dòng)態(tài)變化發(fā)揮炎癥調(diào)節(jié)作用

Rev-erb蛋白在抑制未受挑戰(zhàn)的細(xì)胞內(nèi)源性促炎機(jī)制中發(fā)揮動(dòng)態(tài)平衡作用。其中，Rev-erbα起主導(dǎo)作用。在炎癥反應(yīng)的形成過程中，促炎細(xì)胞因子通過SUMO化和泛素化，引起Rev-erbα蛋白穩(wěn)定性顯著變化和降解增加。炎癥信號(hào)促進(jìn)Reverbα的降解提供了一條新途徑來解釋慢性炎癥疾病中的晝夜節(jié)律破壞與先天免疫間的聯(lián)系，增加Rev-erb蛋白穩(wěn)定性藥物的研究可能為一種新型抗炎途徑[16]。

2.6 Rev-erb依賴其DNA結(jié)合域發(fā)揮抗炎作用

清除小鼠支氣管上皮細(xì)胞中的Rev-erbαDNA結(jié)合域后，支氣管肺泡灌洗液中的中性粒細(xì)胞反應(yīng)顯著[16]。這表明Rev-erbα的另一種抗炎作用依賴于其DNA結(jié)合域。

3 ROR在抗炎及免疫調(diào)節(jié)中的研究

3.1 ROR通過調(diào)節(jié)炎癥因子表達(dá)發(fā)揮抗炎作用

RORα缺乏的小鼠（RORα-/-）存在嚴(yán)重的共濟(jì)失調(diào)神經(jīng)元表型，其支氣管肺泡灌洗液中IL-1β、IL-6和巨噬細(xì)胞炎癥蛋白-2（MIP-2）水平較高，氣管內(nèi)滴注脂多糖（LPS）后更易致死[17]。RORα在淋巴細(xì)胞發(fā)育中起關(guān)鍵作用，RORα-/-小鼠由于B細(xì)胞和T細(xì)胞間室發(fā)育嚴(yán)重缺陷導(dǎo)致脾臟和胸腺細(xì)胞生成減少，在T細(xì)胞依賴性抗原免疫中，CD8型T細(xì)胞在T細(xì)胞受體刺激和IgG水平升高后表現(xiàn)出IFN-γ增加。RORα-/-小鼠肥大細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中TNF-α和IL-6表達(dá)增加，表明RORα以亞群特異的方式作為炎癥細(xì)胞因子的負(fù)調(diào)節(jié)因子[18]。

3.2 ROR通過上調(diào)IκBα發(fā)揮抗炎作用

RORα還被證明與IκBα——B細(xì)胞抑制物α中Kappa輕多肽基因增強(qiáng)子的核因子、啟動(dòng)子區(qū)域的ROR元件結(jié)合，上調(diào)IκBα轉(zhuǎn)錄，抑制NF-κB信號(hào)途徑，進(jìn)而導(dǎo)致p65核移位減少和靶基因轉(zhuǎn)錄減少[19]。因此，RORα負(fù)性調(diào)節(jié)細(xì)胞因子誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。

3.3 ROR通過誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分化發(fā)揮抗炎作用

巨噬細(xì)胞中的RORα保持靜息、非激活狀態(tài)，防止早期先天性免疫反應(yīng)[18]。在巨噬細(xì)胞中過表達(dá)RORα，可以通過激活磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶α（AMPKα）增加M2巨噬細(xì)胞標(biāo)志物（Arg1、YM1和Fizz1）基因和蛋白的表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2極化，這可能為RORα的一種抗炎機(jī)制[20]。

3.4 ROR通過促進(jìn)Th17細(xì)胞發(fā)育發(fā)揮促炎作用

Th17細(xì)胞產(chǎn)生IL-17細(xì)胞因子，并在多發(fā)性硬化癥等自身免疫性疾病中激活炎癥反應(yīng)；Th17細(xì)胞的分化依賴于視黃酸受體相關(guān)的RORγt[14]。在原始CD4 T細(xì)胞中RORγt的過表達(dá)驅(qū)動(dòng)誘導(dǎo)Th17細(xì)胞的發(fā)育，抑制ROR-γt和ROR-α的表達(dá)，從而抑制Th17細(xì)胞的分化[21]。與之前所述作用相反，ROR可通過促進(jìn)Th17細(xì)胞發(fā)育分化發(fā)揮促炎作用。

ROR在抗炎及免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用，但在具體炎癥疾病中發(fā)揮的是抗炎還是促炎作用，仍需進(jìn)一步研究。

4 合成的Rev-erb配體研究

4.1 Rev-erb激動(dòng)劑：GSK4112

1，1-二甲基乙基N-[（4-氯苯基）甲基]-N-[（5-硝基-2-噻吩基）甲基]甘氨酸鹽是第一個(gè)合成的Rev-erb靶向配體。最初命名為SR6452，隨后被更名為GSK4112。GSK4112是從熒光共振能量轉(zhuǎn)移生化篩選中鑒定出來的。在熒光共振能量轉(zhuǎn)移生化篩選中，GSK4112以濃度依賴的方式增加NCOR肽與Rev-erbα的結(jié)合。GSK4112增加核受體輔助抑制因子（NCOR）向Bmal1啟動(dòng)子的募集[22]，同時(shí)增加HDAC3募集到G6PC啟動(dòng)子，這可以作為GSK4112對(duì)Rev-erb基因作用的一種機(jī)制。GSK4112能調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律中涉及的幾個(gè)關(guān)鍵基因的水平，可作為一種潛在的調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律的藥物[22]。在巨噬細(xì)胞中，GSK4112在LPS誘導(dǎo)的內(nèi)毒素休克中可以減少人巨噬細(xì)胞IL-6的釋放、降低促炎細(xì)胞因子和趨化因子CXCL-11、CCL-2、CXCL-6和IL-19 mRNA的表達(dá)[23]。在星形膠質(zhì)細(xì)胞中，使用GSK4112可顯著阻斷腫瘤壞死因子誘導(dǎo)的CCL-2 mRNA和MMP-9 mRNA的上調(diào)，均表明GSK4112具有抗炎作用[24]。GSK4112在腹腔給藥后沒有良好的藥代動(dòng)力學(xué)曲線，在Rev-erb激動(dòng)方面作用較弱，這限制其作為體內(nèi)研究Rev-erbs功能的應(yīng)用[25-26]。

4.2 Rev-erb激動(dòng)劑：SR9009、SR9011

SR9009和SR9011以GSK4112為初始架構(gòu)，改善了功效和藥代動(dòng)力學(xué)特性（增加全身暴露）。SR9009和SR9011是Rev-erbα和Rev-erbβ的雙重合成激動(dòng)劑，其效能是GSK4112的3～4倍，在驅(qū)動(dòng)Rev-erb方面更有效。研究[27]發(fā)現(xiàn)當(dāng)Rev-erbα表達(dá)達(dá)到峰值（即在睡眠期的中間）時(shí)，給小鼠進(jìn)行兩種化合物的腹腔給藥都會(huì)導(dǎo)致小鼠清醒后車輪轉(zhuǎn)動(dòng)活動(dòng)的喪失；此外，這兩種化合物都能影響晝夜節(jié)律幾種核心時(shí)鐘基因在小鼠下丘腦的表達(dá)改變，包括Cry2的抑制，Per2的增強(qiáng)，Bmal1表達(dá)的相移和Npas2晝夜表達(dá)模式的消除。這表明SR9009和SR9011通過調(diào)節(jié)Rev-erb活性對(duì)晝夜節(jié)律振蕩器產(chǎn)生影響。

SR9009或其他人工合成Rev-erbs激動(dòng)劑可抑制IgE和IL-33介導(dǎo)的肥大細(xì)胞激活，并抑制Gab2/PI3K和NF-κB途徑。因此，通過合成Rev-erb激動(dòng)劑對(duì)Rev-erb活性的調(diào)節(jié)可能對(duì)廣泛的過敏性疾病有潛在的作用[28]。使用SR9009刺激動(dòng)脈粥樣硬化模型小鼠骨髓源性巨噬細(xì)胞，可以降低骨髓源性巨噬細(xì)胞向促炎M1巨噬細(xì)胞的極化，同時(shí)增加其向抗炎M2巨噬細(xì)胞的極化，這表明Rev-erbs的藥理學(xué)靶向可能是治療動(dòng)脈粥樣硬化的一種可行選擇[29]。SR9009治療后，心肌梗死模型小鼠炎癥因子IL-6、Mcp1、Ly6g、CD11b、MMP-9 mRNA表達(dá)及磷酸化NF-ERKBp65、磷酸化κ、磷酸化p38蛋白表達(dá)均明顯下降，中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)程度明顯降低。這表明，SR9009治療是通過調(diào)節(jié)炎癥和重塑過程改善心功能，減少心肌梗死的死亡率[30]。

4.3 Rev-erb拮抗劑：SR8278

SR8278是目前為止唯一一種Rev-erb合成拮抗劑。在基于Gal4的共轉(zhuǎn)染報(bào)告實(shí)驗(yàn)及由3個(gè)Reverb啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的全長(zhǎng)Rev-erbα熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)中，SR8278提高了Rev-erbα和Rev-erbβ的靶基因活性，包括Bmal1、PCK和G6PC，用SR8278處理HepG2細(xì)胞可以增加G6PC和PCK的表達(dá)[31]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)GSK4112通過激活Rev-erbα刺激葡萄糖誘導(dǎo)的MIN-6小鼠胰島素瘤細(xì)胞中的胰島素分泌，SR8278能抑制GSK4112發(fā)揮作用[32]。SR8278對(duì)Rev-erb活性調(diào)節(jié)有一定作用，但在免疫調(diào)節(jié)中的研究仍較少。

5 合成的ROR配體研究

5.1 RORα和RORγ反向激動(dòng)劑：SR1001

SR1001的發(fā)現(xiàn)和報(bào)告證明ROR配體可用于探索ROR在小鼠疾病模型中的作用[33]。SR1001抑制RORα和RORγ基因活性，降低受體和共激活劑之間的相互作用。使用SR1001治療動(dòng)脈粥樣硬化模型小鼠，誘導(dǎo)了一種抗動(dòng)脈粥樣硬化的免疫模式，其特征是Th17細(xì)胞減少，Treg和Th2細(xì)胞增加[34]。這種抑制與IL-17A細(xì)胞因子的表達(dá)下調(diào)相關(guān)[35]。TH17細(xì)胞可能是1型糖尿病發(fā)展的病理因素，SR1001減少了促炎細(xì)胞因子的表達(dá)，特別是TH17介導(dǎo)的細(xì)胞因子，減少了自身抗體的產(chǎn)生，并增加了CD4+Foxp3+T調(diào)節(jié)細(xì)胞的頻率，使用針對(duì)該細(xì)胞類型的ROR特異性合成配體可能會(huì)成為一種治療1型糖尿病的新方法[36]。

5.2 RORγ反向激動(dòng)劑：SR2211

SR2211是一種在生化和細(xì)胞的測(cè)定中對(duì)RORγ顯示出優(yōu)于RORα的精確選擇性的化合物。在EL-4細(xì)胞中，SR2211抑制IL-17a和IL-23R的表達(dá)，以及下調(diào)細(xì)胞內(nèi)IL-17蛋白水平，并抑制TH17細(xì)胞分化[37]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[38]顯示SR2211在膠原誘導(dǎo)的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型小鼠中具有活性，通過腹膜注射SR2211，2次/d，持續(xù)15 d，能顯著減少模型小鼠的關(guān)節(jié)炎癥。

6 小結(jié)

生物鐘基因Rev-erb和ROR在抗炎及免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，其通過影響炎癥因子、炎癥通路及免疫細(xì)胞的表達(dá)調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)。目前Rev-erb和ROR的人工合成配體也越來越多，其在免疫調(diào)節(jié)及相關(guān)疾病的治療潛力已經(jīng)在免疫相關(guān)疾病的動(dòng)物模型中得到一定證明。未來，進(jìn)一步改進(jìn)和優(yōu)化配體有可能會(huì)應(yīng)用于自身免疫相關(guān)疾病的治療。改善這些人工合成配體藥物性質(zhì)的研究已經(jīng)取得一定進(jìn)展，其中一些改進(jìn)的人工合成配體或其類似物在不久的將來極有可能進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。