王存孝

（南京科技職業(yè)學(xué)院，江蘇南京 210048）

香料是日常食品中一類可以改變食品味道的物質(zhì)，如香蘭素（4-羥基-3-甲氧基苯甲醛）就是目前市場(chǎng)上重要的香料之一，它具有濃郁的奶香氣息，能起到增香、抑菌和抗氧作用[1]，被廣泛用于食品特別是乳制品中。香蘭素的過量使用會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生危害，導(dǎo)致惡心、嘔吐和頭痛等癥狀，嚴(yán)重時(shí)甚至?xí)p傷肝腎功能[2]?！妒称钒踩珖覙?biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》（GB 2790—2014）規(guī)定了香蘭素在食品中的使用限量[3]，而現(xiàn)在許多乳品企業(yè)為了滿足消費(fèi)者口味，在奶粉中過量使用香蘭素和香精等添加劑，危害到消費(fèi)者尤其是兒童的健康。

較為常見的香蘭素的檢測(cè)方法有色譜法、光譜法和電化學(xué)方法等[3]。采用紫外-可見分光光度法測(cè)定香蘭素，操作簡便、分析成本低、結(jié)果可靠，然而靈敏度較低，易受其他組分的譜線干擾[4]。電化學(xué)方法響應(yīng)迅速、靈敏度高，但樣品基質(zhì)干擾嚴(yán)重，存在重復(fù)性差的問題。氣相色譜法在檢測(cè)時(shí)，由于前處理時(shí)間長、預(yù)處理復(fù)雜，易使香蘭素氧化變質(zhì)，不適用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。液相色譜-質(zhì)譜法儀器昂貴，檢測(cè)成本高，對(duì)環(huán)境和人的要求也高，在基層檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)中推廣困難[5]。高效液相色譜法則因其精密度、靈敏度高，操作相對(duì)簡單快速而被廣泛地應(yīng)用。本文旨在采用高效液相色譜法建立一種針對(duì)市售常見奶粉中香蘭素的快速檢測(cè)的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器

Waters 2695 色譜儀；HY-2 漩渦振蕩器（上海雷磁有限公司）；JP-3 超聲波清洗器（上海繼譜有限公司）；TG16 離心機(jī)（湖南湘儀）；0.45 μm 微孔濾膜。

1.1.2 試劑

香蘭素標(biāo)準(zhǔn)溶液（≥98%）(上海麥克林生化科技有限公司)；甲醇（色譜級(jí)）；乙醇（AR）；奶粉樣品（6 份，1～3 號(hào)為普通奶粉，4～6 號(hào)為幼兒奶粉）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（5 mg·mL-1）：稱取1.25 g（準(zhǔn)確到0.000 1 g）香蘭素到250 mL 容量瓶中，使用乙醇溶解并定容搖勻，4 ℃避光保存。

標(biāo)準(zhǔn)中間溶液（100 μg·mL-1）：從標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液中移取2.00 mL 至100 mL 容量瓶中，使用乙醇稀釋至刻度線，4 ℃避光保存。

標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：移取一系列適量的100 μg·mL-1溶液，使用相同的稀釋方法配制成含有0.1 μg·mL-1、0.5 μg·mL-1、1.0 μg·mL-1、5.0 μg·mL-1、10.0 μg·mL-1、20.0 μg·mL-1和40.0 μg·mL-1香蘭素的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.2.2 樣品前處理

奶粉試樣攪拌均勻后，準(zhǔn)確稱取2 g 于試管中，加入25 mL 的常溫水，超聲振動(dòng)10 min，混勻并溶解，再將其旋渦振蕩40 s。

移取以上試樣溶液10.00 mL 于離心管中，加入10 mL 乙醇，渦旋混合40 s，然后高速離心8 min，用滴管將上層清液收集于容量瓶（50 mL）中。繼續(xù)往離心管中加入同樣體積的乙醇，重復(fù)此步驟操作2 次，每次都收集上層清液于同一個(gè)容量瓶中，將容量瓶定容至刻度線，搖勻，通過0.45 μm 微孔膜過濾，得到待測(cè)溶液。

1.2.3 液相色譜條件

色譜柱：Agilent C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇∶水（30∶70）；流速：1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長：279 nm；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：30 ℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測(cè)波長的選擇

通過對(duì)標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行200～380 nm 的光譜掃描（圖1）可以發(fā)現(xiàn)，香蘭素的吸收峰有233 nm、279 nm 和308 nm 這3 處。233 nm 處峰型和靈敏度雖然較好，但易出現(xiàn)其他有機(jī)化合物的吸收峰干擾。選擇279 nm和308 nm 為檢測(cè)波長對(duì)香蘭素標(biāo)準(zhǔn)工作液測(cè)定發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于308 nm 波長，279 nm 處目標(biāo)峰峰形對(duì)稱性更好，信噪比更高。因此，選擇279 nm 作為檢測(cè)波長。

圖1 香蘭素的吸收光譜圖

2.2 前處理?xiàng)l件優(yōu)化

以1 號(hào)奶粉樣品為基準(zhǔn)，通過測(cè)定香蘭素加標(biāo)回收率的方法，考察提取劑對(duì)提取效率的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明，傳統(tǒng)的鹽酸和乙腈溶液雖然能沉淀完全蛋白質(zhì)，去除脂肪干擾，但提取效率較低，回收率不到85%。當(dāng)選擇乙醇作為提取劑后，提取效率提高10%以上。因此，本次實(shí)驗(yàn)將采用乙醇來提取樣品中的香蘭素。

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，乙醇的用量較少時(shí)（≤10 mL）時(shí)，樣品上層清液中會(huì)有蛋白和脂肪殘留，出現(xiàn)渾濁現(xiàn)象，而當(dāng)使用量增加至20 mL、30 mL、40 mL 時(shí)，提取率隨之升高?？紤]到30 mL和40 mL的提取效果接近，確定最終提取劑用量為30 mL。同時(shí)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，提取劑采用多次提取的方式效率更高，但當(dāng)提取次數(shù)為3次以上時(shí)，效率反而轉(zhuǎn)低，可能是步驟和時(shí)間的增加導(dǎo)致待測(cè)物損失。因此，確定乙醇提取次數(shù)為3 次，每次10 mL。

渦旋混合時(shí)間過長會(huì)出現(xiàn)乳化現(xiàn)象，過短會(huì)導(dǎo)致提取率下降，混合時(shí)間在30～60 s 時(shí)，提取率比較穩(wěn)定。從節(jié)約處理時(shí)間的角度出發(fā)，選擇渦旋時(shí)間為30 s。

2.3 流動(dòng)相的選擇

以甲醇水溶液（30%～40%）為流動(dòng)相時(shí)，在分離度和靈敏度方面都能滿足測(cè)定需要。在樣品測(cè)定中發(fā)現(xiàn)，甲醇溶液的濃度對(duì)香蘭素的分離度影響不大，但會(huì)改變其出峰的時(shí)間。當(dāng)甲醇濃度為30%時(shí)，待測(cè)組分和其他干擾組分即可實(shí)現(xiàn)良好的分離。因此，從成本和環(huán)保角度考慮，選擇30%的甲醇水溶液為流動(dòng)相。

2.4 線性范圍和檢出限

對(duì)香蘭素標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行測(cè)定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，可得到圖2。在0.1～40.0 μg·mL-1，峰面積與濃度擁有良好的線性關(guān)系，其線性方程為y=79.398x+12.764，r2=0.999 7，檢出限（3S/N）為0.05 μg·mL-1。

圖2 香蘭素的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.5 回收率及精密度實(shí)驗(yàn)

稱取1 號(hào)乳粉樣品20 份，每份2 g，按表1方法添加標(biāo)樣，進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)（n=5）。結(jié)果顯示，加標(biāo)回收率為96.0%～100.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于5%。

表1 奶粉中香蘭素測(cè)定的回收率和RSD 表

2.6 實(shí)際樣品測(cè)定

對(duì)6 種樣品進(jìn)行了香蘭素含量測(cè)定，平行測(cè)定5次，結(jié)果如表2所示。1～3 號(hào)普通奶粉能檢測(cè)出微量香蘭素，在幼兒奶粉中未測(cè)出香蘭素的存在，以上奶粉符合《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》要求。

表2 奶粉中香蘭素的檢測(cè)結(jié)果（n=5）

3 結(jié)論

香蘭素在空氣中易氧化和遇光分解的特性會(huì)給檢測(cè)帶來一定難度[6]。本研究結(jié)合香蘭素回收率試驗(yàn)，優(yōu)化了樣品提取條件，并以甲醇水溶液為流動(dòng)相，建立了一種高效液相色譜法測(cè)定奶粉中香蘭素的快速檢測(cè)方法。該方法在0.1～40.0 μg·mL-1線性關(guān)系良好，加標(biāo)回收率和精密度均能滿足實(shí)際檢測(cè)的要求，可為奶粉中香蘭素的質(zhì)量監(jiān)測(cè)提供重要參考依據(jù)。